应用逆转录聚合酶链反应法扩增类胰岛素生长因子Ⅱ基因

利用酸性异硫氰酸胍-酚-氯仿一步法从人胚胎组织中提取总RNA,经Oligo(dT)纤维柱分离纯化出mRNA。用逆转录与聚合酶链反应相结合的RT-PCR法,扩增出人类胰岛素生长因子Ⅱ(IGFⅡ)的cDNA片段,在限制性内切酶Sma Ⅰ存在的连接体系中,将扩增出的cDNA片段克隆进PUC12的Sma Ⅰ位点处。经限制性内切酶EcoR Ⅰ、Sal Ⅰ、Eco47Ⅲ酶切鉴定其方向。以重组质粒的双链DNA为模板,用末端终止法测定其全部核苷酸顺序,证实其核苷酸编码的IGFⅡ在氨基酸顺序上与文献报道的相同。     

人尿道(阴茎)鳞癌上皮细胞(HUS-98)cDNA文库的构建及鉴定

为了进一步分离人尿道(阴茎)鳞癌组织特异性表达基因和鳞癌特异性相关基因,采用SMART技术,构建了人尿道 (阴茎)鳞癌上皮细胞cDNA文库,从人尿道(阴茎)鳞癌上皮细胞中分离总RNA并纯化mRNA,利用经修饰的oligo(dT)引物 合成cDNA第一链,利用SMART核苷酸作为cDNA第一链在mRNA5′端延伸出去的模板,采用LD-PCR合成双链cDNA,双链 cDNA经酶切和过柱分级分离后,克隆入λTriplEx2载体后经体外包装而成cDNA文库。结果表明原始人尿道(阴茎)鳞癌上 皮cDNA文库获得1.57×107个重组子,重组率达到98%。文库扩增后,滴度达到4.0×109pfu/ml,插入cDNA平均长度为2.5kb。 构建的人尿道(阴茎)鳞癌上皮cDNA文库具有良好的质量,该cDNA文库为进一步筛选鳞癌抑癌基因及鳞癌特异性表达基因 奠定了基础。     

鸡珠旦白cDNA在细菌质体中的克隆

自苯肼处理过的鸡网织红细胞所分离出的mRNA,制备成鸡珠旦白cDNA,并使之在pMB9质体的抗四环素基因中克隆。限制性酶的分析结果表明,至少分离到两类克隆。从核苷酸序列的资料证明,这些分离的克隆相当于鸡的α和β-血红旦白基因。     

cDNA合成和产量计算

以信使核糖核酸(mRNA)为模板合成互补的DNA链(cDNA),并以此单链DNA合成双链cDNA的技术是基因工程中最初的和重要的环节之一。本文根据研究工作的体会介绍cDNA合成方法,产量计算,影响cDNA合成的因素和解决的方法。一、cDNA合成方法自从1970年Temin和Baltimore 发现鸡骨髓瘤病毒逆转录酶以后,以mRNA为模板合成cDNA的技术很快应用到基因工程研究中。由于大多数合成反应都以polyA-mRNA为模板,因此需要加入寡聚脱氧胸腺核苷酸作为引物。底物是四种脱氧核苷三磷酸,其中一种     

脂肪酸合成酶基因片段克隆以及胰岛素诱导时该酶mRNA含量的变化

采用高效的由mRNA合成cDNA的方法,我们得到了含有3.7kb的脂肪酸合成酶基因片段的克隆pFAS_(203)。它具有限制内切酶PstⅠ、BamH Ⅰ、HineⅡ、PvuⅡ、Ava Ⅰ以及Pvu Ⅰ酶切位点,与已经得到的经杂交选择的mRNA离体翻译产物鉴定的cDNA克隆pFAS_(15)有部分重叠。对饥饿的糖尿病大鼠注射胰岛素并饲以无脂食物,肝中FAS mRNA以及其前体RNA含量增加,当注射后再饲无脂食物达12小对,肝中FASmRNA及其前体RNA约为糖尿病鼠的30倍。Poly(A)~+ RNA的Northern分析表明诱导期间FASmRNA含量增加而其分子大小不变。这些结果表明胰岛素对FAS基因的转录有调节作用。胰岛素诱导后的脂肪酸合成酶活性升高是在转录水平上调节的。     

激素和活性多肽

<正> 测定了鲤鱼(CyPrinus earpio)的前胰岛素原cDNA的核苷酸序列,并克隆于pBR322的Pstl位点上。序列中插人T 439对核苷酸的鲤鱼前胰岛素原(108个氨基酸)完整的密码信息;另外还有5端的10对核苷酸以及一个105对核苷酸的非翻译区。     

微晶纤维素柱层析分离纯化鸡mRNA

mRNA(messenger RNA)在基因表达中起关键作用。生物所表现的各种属性决定于mRNA(沙季洛夫,1977),它的突变将导致遗传性的变异(牛满江等,1979;牛满江,1979)。近年来广泛开展mRNA反转录和DNA碱基顺序分析的研究,从mRNA或其基因的核苷酸顺序来确定蛋白质的氨基酸顺序,为蛋白质研究     

人前胰岛素原双链cDNA克隆的分离和鉴定

我们从人胰岛肿瘤组织eDNA基因库中分离到一个编码人前胰岛素原的双链eDNA克隆。限制性内切酶片段分析和DNA顺序分析均证明这是一个编码人前胰岛素原的cDNA克隆。该克隆中前胰岛素原编码顺序与β－内酰胺酶基因方向相同。     

人MCP cDNA的克隆、序列分析及同种型的比较

以人胚胎mRNA为模板,采用RT-PCR法得到了人补体调节蛋白膜辅蛋白(MCP)的一种cDNA全基因,序列分析结果表明,所获得的MCP cDNA为文献报道中10种同种型中的一种,属MCP-C₂型,该cDNA含一编码369个氨基酸的阅读框架,其中的STP区含14个氨基酸,由STP^C编码,胞浆尾区含23个氨基酸,为CYT₂,未发现有东西方人种之间的核苷酸的差异.     

菠菜甜菜碱醛脱氢酶基因的克隆和序列分析

以耐盐的菠菜mRNA为模板,经反转录合成甜菜碱醛脱氢酶(BADH)基因第一链cDNA。在人工合成的两端引物引导下,通过多聚酶链式反应(PCR),扩增获得双链cDNA。把重组有BADH基因的pUC19转化至E.coli DH5α菌株,亚克隆后测定了基因的全序列。所得到的BADH基因全长序列为1491bp,编码497个氨基酸。与文献报道的相比较,核苷酸序列同源性99.8％,氨基酸序列同源性达99.6％。在此基础上,构建了BADH基因的高等植物表达载体。     

菜甜菜碱醛脱氢酶基因的克隆和序列分析

以耐盐的菠菜mRNA为横板．经反转录合成甜菜碱醛脱氢酶(BADH)基因第一链cDNA。在人工合成的两端引物引导下,通过多聚酶链式反应(PCR)。扩增获得双链cDNA。把重组有BADH基因的pucl9转化至E．Coli DH5a菌株,亚克隆后测定了基因的全序列。所得到的BADH基因全长序列为1491bp,编码497个氨基酸。与文献报道的相比较,核苷酸序列同源性99．8％．氨基酸序列同源性达99．6％。在此基础上,构建了BADH基因的高等植物表达载体．     

几种mRNA在无细胞系统中的翻译

<正> 信使核糖核酸(mRNA)的分离与测活,在基因表达与调控、核酸结构的分析、以及基因工程等方面的研究中占有特殊的地位。一个目的基因的分离可以通过mRNA逆转录成cDNA而钩出此基因,所得基因可以进行核苷酸的序列分析,同时还可以进行调控序列的分析;又如可以借助mRNA探针从基因文库中钩出目的基因,也可以通过mRNA筛选出所需要的克隆。因此mRNA的研究已成为分子生物研究中重要手段。     

两个人组蛋白H1基因的亚克隆和它们启动子核苷酸顺序的比较

从人基因库中分离得到的两个含有不同变种组蛋白H_1基因的λ克隆(λHh8和λHh9),分别把它们含有该基因的片段(8c和9a)插入载体puc8质粒中,得到了亚克隆pHh8c和pHh9a。对这两个人组蛋白H_1基因的启动子(Promoter)和部份编码蛋白质的区域作了核苷酸顺序的分析和比较,确定了它们的启动要素和同系顺序。     

克隆的小鼠白细胞介素-7对B细胞前体有刺激作用

目前对淋巴细胞发育了解较少,本文作者借助长效培养系统检定到一种能刺激淋巴细胞前体增殖的新生长因子,并获得编码该因子的cDNA克隆。这种新的造血细胞生长因子被命名为白细胞介素-7(IL-7)。以从小鼠骨髓衍生的细胞系IXN/A6制备cDNA文库,经过筛选表达于COS-7细胞中的cDNA文库的约720000重组体,最后得到一编码IL-7的cDNA克隆(即克隆104(?)),并测定了克隆1046的核苷酸顺序。该克隆(插入基因)有1607碱基对(bp)长,仅含一个462bp的开放阅读框架(ORF)。在ORF之前存     

重组DNA技术(续)

四、DNA的体外重组 DNA重组技术,当用于干扰素、胰岛素、疫苗、免疫球蛋白等物质的生产时,目前多半采用从mRNA反转录成cDNA,然后和载体DNA重组,再转化至大肠杆菌内进行复制和表达。在某一基因结构已清楚的情况下,亦可人工合成该基因(如人胰岛素基因等),再将该基因嵌入载体引进大肠杆菌中。若从基因库中分离出的基因,由于已含有内含子(Intron),     

内蒙古白绒山羊TSC2基因克隆与表达模式分析

旨在克隆内蒙古白绒山羊TSC2基因cDNA并分析其特性及基本表达模式.利用RT-PCR分段克隆TSC2基因cDNA片段并测序,将得到的cDNA各片段核苷酸序列拼接后获得绒山羊TSC2基因编码区全长序列(HQ684023)并进行生物信息学分析.半定量RT-PCR方法检测TSC2基因在不同组织中的表达特异性.结果表明内蒙古白绒山羊TSC2基因cDNA编码区核苷酸序列为5184 bp,包含了编码1727个氨基酸残基的全长ORF.核苷酸序列与牛、猪、马、大熊猫、犬、恒河猴、人、小鼠及大鼠的同源性分别为97％、90％、89％、88％、87％、87％、87％、86％和86％.NCBI CDD程序预测该基因编码的蛋白质有一个Tuberin结构域和一个Rap-GAP结构域;Psite程序分析有5个N糖基化位点、2个cAMP和cGMP依赖蛋白激酶磷酸化位点、16个蛋白激酶C磷酸化位点、25个酪蛋白激酶磷酸化位点.PSORT程序预测其定位于胞内体膜.TSC2基因在内蒙古白绒山羊的睾丸、脑、肝脏、肺、乳腺、脾和肾脏等组织中都有表达,mRNA丰度在睾丸中较高,乳腺中较低.     

单链胰岛素前体在酵母中的分泌表达及其转变成人胰岛素

将化学合成的单链猪胰岛素前体(PIP)基因和用聚合酶链反应得到的α交配因子前导顺序(αMFL)基因插入质粒pVT102-U的醇脱氢酶基因ADH1的启动子和3’终止顺序之间而生成质粒pVT102-U/αMFL-PIP.被pVT102-U/αMFL-PIP转化的酵母(Saccharomyces cerevistae)可表达单链前体并分泌到培养基中.前体在纯化后可通过胰蛋白酶的转肽作用转变成人胰岛素.纯化的人胰岛素具有全部活力并可结晶.人胰岛素的总收率为每升培养液25mg.     

转染RNF6基因对肝癌细胞IRS-2表达的影响

构建环指蛋白6(RNF6)真核表达载体,并探讨其对胰岛素受体底物1(IRS-2)表达的影响。以人cDNA为模板,PCR扩增RNF6全长编码基因,并将其克隆至载体pcDNA3.1-CHA中,将重组质粒转染肝癌细胞株HepG2,利用Real time-PCR、Western blot检测细胞内IRS-2 mRNA水平及蛋白表达情况。携带RNF6目的基因的质粒转染HepG2细胞48 h后IRS-2的mRNA表达降低,为对照组的37%,显著低于对照组,差异有统计学意义(P0.01)。RNF6引起IRS-2的表达下调,这一过程可能由于泛素化导致胰岛素信号转导通路障碍。     

酿酒酵母海藻糖-6-磷酸合成酶基因克隆及植物表达载体的构建

从耐热性极强的酿酒酵母菌株AS21416中分离纯化出总RNA和mRNA,以AMV逆转录酶合成cDNA,采用保守引物,从该cDNA中扩增克隆出tps1基因,对该基因的全序列分析表明,该基因含有1507个核苷酸,与国外报道相关基因的同源性达99.6%。利用BamHⅠ和SacⅠ切点将tps1基因插入植物表达载体pBin438多克隆位点上,得到tps1基因植物表达载体重组质粒。