玉米淀粉分支酶基因的克隆与RNAi表达载体的构建

利用网络数据库http://jura.wi.mit.edu/bioc/siRNAext/,确定玉米淀粉分支酶SBEⅡb的部分基因序列作为RNAi的目标序列,通过RT-PCR方法从玉米自交系‘综31’中分别成功克隆出了玉米淀粉分支酶sbeⅡb基因的部分序列及其启动子序列,从大肠杆菌中成功克隆了木糖异构酶基因xylA作为筛选标记,构建了含有35S驱动的木糖异构酶基因和sbeⅡb启动子驱动的含有sbeⅡb目标序列的反向重复序列的表达载体pBAC413,并对玉米自交系实施转化。经PCR检测转基因玉米再生植株,初步判定目的序列已经成功整合到玉米再生植株的基因组中。     

RNAi沉默淀粉分支酶基因SBEI对玉米直链淀粉合成的影响

淀粉分支酶(SBE)是淀粉合成的限速酶。为了研究SBEI沉默对直链淀粉合成的影响, 克隆了玉米(Zea mays)淀粉分支酶SBEI基因片段, 构建了SBEI的RNAi表达载体pBAC418, 用基因枪将其导入玉米自交系幼胚愈伤组织, 经木糖筛选获得了7株转化再生植株。利用FAD2 intron和xylA基因探针对T₀代再生玉米植株进行DNA dot blot和PCR-Southern检测, 证实5株为阳性植株, 其中4株正常结实。SBEI基因沉默对阳性再生玉米株系籽粒的含油量没有显著影响; 蛋白质含量显著高于受体对照; 总淀粉含量与对照相比无显著差异, 转基因株系直链淀粉含量平均提高了9.8%。     

RNAi沉默淀粉分支酶基因SEEI对玉米直链淀粉合成的影响

淀粉分支酶(SBE)是淀粉合成的限速酶.为了研究SBEI沉默对直链淀粉合成的影响,克隆了玉米(Zea mays)淀粉分支酶SBEI基因片段,构建了S8EI的RNAi表达载体pBAC418,用基因枪将其导入玉米自交系幼胚愈伤组织,经木糖筛选获得了7株转化再生植株.利用FAD2 intron和xylA基因探针对T<,0>代再生玉米植株进行DNA dot blot和PCR-Southern检测,证实5株为阳性植株,其中4株正常结实.SBEI基因沉默对阳性再生玉米株系籽粒的含油量没有显著影响;蛋白质含量显著高于受体对照;总淀粉含量与对照相比无显著差异,转基因株系直链淀粉含量平均提高了9.8%.     

淀粉分支酶和去分支酶编码基因的功能

淀粉分支酶(SBE)和淀粉去分支酶(DBE)是直接参与淀粉生物合成的5类酶中的2类分支点形成支链淀粉,后者水解葡萄糖苷链中α(1-6)糖苷键.文章概述了已克隆的编码SBE和DBE同种型编码基因及其在体内外的表达特征,并提出DBE多聚体酶的结构和功能将成为淀粉粒起始形成研究中的起点,SBEⅠ和SBEⅡ表达调控是支链淀粉分子改良的途径的看法.     

水稻淀粉分支酶基因5′上游区缺失对基因表达的影响

为研究水稻淀粉分支酶基因 (sbe1) 5′上游调控区中存在的顺式作用元件 ,我们将水稻sbe1基因翻译起始点 (ATG) 5′上游区 1.2kb(- 10 96～ 74bp)片段经过不同限制性内切酶消化及外切核酸酶ExoIII部分消化 ,得到 4个 5′端缺失的片段。将这些缺失片段分别与 gus基因编码区连接 ,构建成融合质粒 ,经土壤农杆菌 (Agrobacterium)介导引入水稻 ,定量测定转基因水稻植株未成熟种子中的 gus酶活力。结果表明 ,- 5 16～ 6 4bp的sbe1启动子片段可以驱动gus基因的高表达 ,其它 3个启动子片段 (- 10 96～ 74bp ,- 2 95～ 74bp ,- 146～ 6 4bp)驱动 gus基因表达的能力较低。推测在sbe1基因 5′上游区 - 5 16～ - 2 95bp片段中可能存在能使 gus基因高表达的增强元件     

淀粉分支酶sbeIIb基因RNA干涉片段转化玉米自交系的研究

玉米高直链淀粉育种是玉米分子育种的一个重要研究方向.本实验中,首先研究了不同诱导愈伤培养基对再生体系的影响,确定了LS+2,4-D 2.0 mg/L+L-pro 700 mg/L+CH 500 mg/L+3 %蔗糖为诱导培养基.同时,构建并验证了含有淀粉分支酶sbeIIb基因双干涉片段载体和胚乳特异性启动子的表达载体pCAMBIA 1301+Glu+1620,并转入根癌农杆菌EHA105,以农杆菌转化法转化玉米自交系178.通过PCR检测,5株转化株表现阳性,初步证明了干涉片段已整合入玉米基因组中.     

植物支链淀粉合成的关键酶—淀粉分支酶

支链淀粉是植物淀粉的主要成分,而淀粉分酶支酶是其合成的关键酶。开展对该酶的深入研究不论是在基因理论研究领域还是在实现应用方面都具重要意义。     

马铃薯遗传转化体系的优化及玉米淀粉分支酶基因SBEⅡb的导入

以马铃薯脱毒试管苗茎段为转化受体材料,建立并优化了农杆菌介导的马铃薯遗传转化体系。通过农杆菌介导法将玉米淀粉分支酶基因(Starch branching enzyme b,SBEⅡb)的过表达载体转化马铃薯,接种762个茎段,共获得35株抗性植株。经PCR检测获得了4株转基因阳性植株;对转基因植株进一步进行GUS活性组织化学染色,发现转基因植株的茎段与试管薯均被染上蓝色,表明外源SBEⅡb基因已整合到马铃薯基因组,且正常表达。     

农杆菌介导淀粉分支酶基因RNAi片段转化玉米的研究

以玉米自交系“178”和“R18红”的胚性愈伤组织为材料,通过愈伤组织对潮霉素的敏感性实验,确定了潮霉素15 mg/L~25 mg/L为愈伤组织适宜的选择压。利用农杆菌(Agrobacterium tum efaciens)介导将淀粉分支酶基因RNA干涉表达载体转入玉米自交系中,并对农杆菌转化系统的条件进行研究。结果表明:在感染液和共培培养基中分别都加入100μm ol/L乙酰丁香酮和50 mg/L抗坏血酸,农杆菌LBA4404的菌液OD600为0.6、侵染时间20 m in为农杆菌转化的最适条件。对转化的愈伤组织分化诱导出苗后进行PCR检测,证明外源目的基因已整合到玉米基因组中,转化率最高达到2.4%。     

水稻几丁质酶基因RCH8创伤导转录及启动子功能分析

高等植物几丁质酶基因受病害侵染、真菌激发子、乙烯、机械创伤等诱导转录。我们已经测定过水稻Ⅰ类几丁质酶基因ＲＣＨ８的ＤＮＡ序列。为了研究水稻中与防卫反应有关的几丁质酶基因启动子的活怀、功能和表达调控。我们以ＲＣＨ８几丁质酶基因保守的编码区序烈 探讨针,分别在创伤处理２－２４ｈ后提取水稻叶片的总ＲＮＡ作Ｎｏｒｔｈｅｒｎ杂交,发现创伤处理６ｈ可以检测到几丁质酶基因的表达,１２ｈ表达水平最高。合成了一个与     

水稻Xa1基因启动子的克隆及功能分析

Xa1是一个能对日本白叶枯病优势小种(小种1号)产生专化性抗性的R基因,虽已有该基因克隆、表达和功能方面的研究,但对其表达调控分子机制还不很清楚。本研究利用Xa1启动子与GUS报告基因的转基因T1株系,研究了Xa1启动子的时空表达及对不同外源激素的应答特征。结果表明,Xa1启动子驱动的GUS基因在水稻根中的表达量明显高于茎和叶,且在根部的中柱区GUS的表达量明显高于周围组织;在外源MeJA作用下GUS的表达显著增强,在SA和ABA处理下也有一定程度的增强,这些结果暗示Xa1的抗病作用与其在根系中柱的组织特异性表达存在一定的相关性,MeJA对Xa1启动子的活性起重要的调控作用。     

斑马鱼心肌特异性启动子的克隆及其功能鉴定*

目的:探讨心室肌球蛋白重链(vmhc)基因启动子的心肌组织特异性.方法:利用PCR技术从斑马鱼基因组中克隆了vmhc编码区5’上游大小为1952bp的调控区域,应用酶切连接方法将vmhc启动子插入pGEFP-N1质粒,成功构建pEGFP-vmhc重组载体.再应用高保真DNA聚合酶PCR扩增包含vmhc启动子序列,增强型绿色荧光蛋白(EGFP)基因序列及3'UTR序列的基因片段,经过纯化后通过显微注射将vmhc-EGFP基因片段导入斑马鱼受精卵中.结果:注射后的斑马鱼心脏中出现绿色荧光,而其他部位无荧光出现.结论:vmhc启动子能够正确有效地驱动外源基因在斑马鱼心脏中特异表达,适合应用于心血管疾病的基因功能研究,基因靶向治疗等.     

水稻OsWTF1基因启动子的克隆与表达分析

目的：分析水稻OsWTF1基因启动子的功能及核心序列。方法：利用PCR技术从水稻日本晴基因组中克隆了转录因子WTF1编码区5上游大小为2049bp的调控区域,命名为OsWTF1,将它和长度为1631、608、474、415bp的5端缺失体分别与GUS基因融合构建表达载体,并用农杆菌介导法转化水稻。结果：GUS组织化学分析表明,OsWTF1、Os1631能够驱动GUS基因在根、茎、叶、叶鞘、花药、颖壳上的表达,Os608,Os474,Os415能驱动GUS在根、茎、花药、颖壳中表达,在叶鞘中未表达,而且在叶中的表达也很微弱。结论：OsWTF1启动子核心序列可能位于-1bp--415bp之间,在-608bp--1631bp之间可能存在与基因叶肉特异表达相关的重要元件。     

植物支链淀粉合成的关键酶——淀粉分支酶

支链淀粉是植物淀粉的主要成分,而淀粉分支酶是其合成的关键酶。淀粉分支酶可分为两同形体家族,本文从酶学特性、染色体定位、基因及基因表达方面阐明了它们之间的联系和区别,并证实不同同形体在植物支链淀粉合成和结构决定上所起作用不同。开展对该酶的深入研究不论是在基础理论研究领域还是在现实应用方面都具重要意义。     

ZNF268基因启动子区的克隆及功能分析

锌指基因家族是人体中最大的基因家族,它参与细胞分化、胚胎发育,并与许多疾病的发生相关。人类ZNF268基因是一个在人胚肝中特异性表达的C2H2型锌指基因,并可能在人的早期肝脏发育中起重要作用。为了研究ZNF268基因表达调控的分子机制,以正常人总基因组为模板PCR扩增了ZNF268基因的5′调控区2533bp片段,并将此片段插入启动子缺失的EGFP(增强型绿色荧光蛋白)载体构建了重组质粒pZNF268—EGFP。用脂质体介导的方法将pZNF268—EGFP转染NIH／3T3、COS7、K562、HeLa4个细胞系。在激光共聚焦显微镜下观察绿色荧光的表达,发现在每个细胞系中,转染了重组质粒pZNF268—EGFP的细胞均有荧光表达,但其起始表达时间均晚于转染了阳性对照质粒pEGFP—C1的细胞且荧光较弱。这表明ZNF268基因的5′调控区2．5kb片段是一个有功能的启动子,但该启动子与CMV启动子相比活性较弱。选择易培养的HeLa细胞系用于缺失研究。将一系列5′端—2456bp至—20bp缺失、3′端均为 77bp的缺失片段插入启动子缺失的CAT(氯酶素酰胺转移酶)载体构建了一系列重组质粒。将这些重组质粒转染HeLa细胞系进行缺失分析,并通过共转染pCMV—Sport—βgal质粒校正转染效率。结果表明,ZNF268启动子—2456～—1639bp区域可能含有正调控元件,—1244～—1013bp和—525～—156bp区域可能含有负调控元件,ZNF268启动子激活转录的一个重要区域位于—156～—20bp。     

玉米19kD醇溶贮藏蛋白基因启动子种子特异性表达控制区段的分析

为研究玉米（Ｚｅａｍａｙｓ　Ｌ．）１９ｋＤ醇溶贮藏蛋白（ｚｅｉｎ）基因启动子种子特异性表达的控制区段,将全长６９４ｂｐ的启动子进行５’端缺失,共得到６个缺失突变体,长度分别为４８８ｂｐ、３７８ｂｐ、３０２ｂｐ、１５２ｂｐ、１２４ｂｐ和８５ｂｐ。将６个片段分别与报告基因ｇｕｓ连接构建成表达载体ｐＤＧＢ系列,经土壤农杆菌（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）介导转化,引入烟草。ＧＵＳ活性检测证明,４８８ｂｐ启动子片段能促使ｇｕｓ基因在种子中特异表达。３７８ｂｐ、３０２ｂｐ、１５２ｂｐ和１２４ｂｐ片段启动子引导的ｇｕｓ基因在烟草根、叶柄、种子中均可表达。     

水稻籽粒淀粉分支酶活性的遗传分析

用由247个株系组成的珍汕97B/密阳46重组自交系群体及其含207个分子标记的连锁图谱,在2002年和2003年分别测定亲本和重组自交系群体开花后10 d和20 d籽粒的淀粉分支酶的活性,检测到3个控制开花后10 d Q酶活性的主效应QTL(qnantitative trait loci),联合贡献率为10%,其中qQ10-6与环境发生显著的互作;分别检测到5对和2对染色体区间对开花后10 d、20 d Q酶活性的影响具有加性×加性上位性作用,其中开花后10 d的3对染色体区间具有显著的上位性×环境互作效应.由此可见,水稻籽粒Q酶活性相关基因的表达,受到环境因子的极大影响.