利用ORF438启动子在链霉菌中表达透明颤菌血红蛋白

利用ＯＲＦ４３８启动子在链霉菌中表达透明颤菌血红蛋白崔风文杨胜利（中国科学院上海生物工程研究中心上海２００２３３）１９８８年,由原核的透明颤菌（Ｖｉｔｒｅｏｓｃｉｌａｓｐｐ．）克隆到血红蛋白基因（ｖｇｂ）［１］,其后Ｍａｇｎｏｌｏ等在天蓝链霉菌及变青...     

在链霉菌中表达透明颤菌血红蛋白需要异源启动子

构建了质粒pIJ4083Mpro、pIJ4083\|pro\,pWLD8和pFW3。在浅青紫链霉菌TK24中,启动子探针质粒pIJ4083上的邻苯二酚双加氧酶基因(xylE)不能被透明颤菌血红蛋白基因(vgb)的启动子带动转录,表明vgb启动子在链霉菌中无作用。TK24中,pWLD8和pFW3均能表达透明颤菌血红蛋白(VHb),pWLD8上可能是由Plac带动vgb的表达;pFW3上vgb基因去掉了非必要部分,克隆在PCR扩增得到的glnA启动子下游,两者连成嵌合基因。     

透明颤菌血红蛋白基因在阿维链霉菌中的表达

将含有自身启动子的透明颤菌血红蛋白基因（ ｖｈｂ） 克隆至大肠杆菌—链霉菌穿梭质粒载体ｐＩＪ６５３ 中构建成表达载体ｐ ＷＹ１０１ 和ｐ ＷＹ１０２ ,用它们转化阿维菌素（ａｖｅｒｍｅｃｔｉｎｓ） 产生菌———阿维链霉菌（ Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ａｖｅｒｍｉｔｉｌｉｓ） ,经Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔｔｉｎｇ 分析并未检测到ｖｈｂ 基因表达,但用穿梭载体ｐＨＺ１２５２（ 其中的ｖｈｂ 基因位于受硫链丝菌素诱导的链霉菌强启动子ＰｔｉｐＡ之下） 转化阿维链霉菌并经硫链丝菌素诱导,则在该菌中表达出了有活性的ＶＨｂ 蛋白。ｐＨＺ１２５２ 在阿维链霉菌中发生了重组缺失,但缺失的ｐＨＺ１２５２ 上仍含有完整的ｖｈｂ 基因及诱导型强启动子,且可在阿维链霉菌中稳定遗传,却不能再转化大肠杆菌。     

透明颤菌血红蛋白基因在金色链霉菌中的克隆与表达

分别用质粒pJJ699与pUC19(vhb),pIJ702与pBR322(vhb),构建大肠杆菌链霉菌穿梭质粒,将透明颤菌血红蛋白基因转入金色链霉菌。在低溶解氧浓度下,透明颤菌血红蛋白的表达,可提高金色链霉菌氧的利用效率,产物合成比原始菌株提高40%～60%。在局部低氧的环境中,采用四环素抗性基因启动子带动血红蛋白基因表达,可有效发挥透明颤菌血红蛋白的氧传递效率,优于透明颤菌血红蛋白基因受溶解氧调控的天然启动子。     

透明颤菌血红蛋白基因表达对金色链霉菌生长代谢的影响

利用四环素抗性基因启动子在金色链霉菌中表达透明颤菌血红蛋白基因。在1m3发酵罐中研究了工程菌株的生长代谢特性。在溶解氧充足的条件下,透明颤菌血红蛋白表达,对金色链霉菌生长代谢未产生明显影响,工程菌株与参比菌株的生长代谢特性基本一致,工程菌株和参比菌株金霉素最终浓度分别为22905u/mL、22896u/mL。在低溶解氧条件下,透明颤菌血红蛋白的表达,可促进金色链霉菌菌体生长、菌丝活力保持和金霉素的合成：工程菌菌体浓度比参比菌株高5％～10％,产物合成提高11.4％。     

透明颤菌血红蛋白的研究进展

血红蛋白广泛存在于动植物、微生物中,是一种氧结合蛋白。透明颤菌血红蛋白是20世纪70年代后期发现的一种血红蛋白,该蛋白质能使细菌在低氧的情况下生存,并保持较高的生长速率。随着作用机理研究深入,透明颤菌血红蛋白在发酵工业和植物转基因等生物工程领域有着广泛的应用。     

透明颤菌血红蛋白在肉桂地链霉菌中的表达对基因细胞生长及抗生素合成的影响

肉桂地链霉菌（S.cinnamonensis)是莫能菌素（Monensin)的产生菌,大肠杆菌－链霉菌穿梭表达载体pHZ1252中的透明颤菌血红蛋白基因（vhb)位于硫链丝菌素诱导启动子ＰtipA之下,它在肉桂地链霉菌中的结构不稳定,,发生了重组缺失,缺失的片段包括大肠杆菌质粒部分vhb基因。但来自阿维链霉菌(S.avermitilis)中缺失了大肠杆菌质粒部分却保留了完整的vhb基因及tipA启动子的pHZ1252,可在肉桂地链霉菌中稳定复制,不再发生缺失,经硫链丝菌素诱导表达出了有生物活性的ＶＨb蛋白,摇瓶发酵实验证明,ＶＨb蛋白在氧限条件下可明显促进肉桂地链霉菌的菌体生长和抗生素合成。     

透明颤菌血红蛋白在肉桂地链霉菌中的表达对其细胞生长及抗生素合成的影响

肉桂地链霉菌(S.cinnamonensis)是莫能菌素(Monensin)的产生菌。大肠杆菌链霉菌穿梭表达载体pHZ1252中的透明颤菌血红蛋白基因(vhb)位于硫链丝菌素诱导启动子P_tipA之下,它在肉桂地链霉菌中的结构不稳定,发生了重组缺失,缺失的片段包括大肠杆菌质粒部分和vhb基因。但来自阿维链霉菌(S.avermitilis)中缺失了大肠杆菌质粒部分却保留了完整的vhb基因及tipA启动子的pHZ1252,可在肉桂地链霉菌中稳定复制,不再发生缺失,经硫链丝菌素诱导表达出了有生物活性的VHb蛋白。摇瓶发酵实验证明,VHb蛋白在氧限条件下可明显促进肉桂地链霉菌的菌体生长和抗生素合成。     

委内瑞拉链霉菌秦岭变种属间接合转移系统的构建及透明颤菌血红蛋白的表达

【目的】构建委内瑞拉链霉菌秦岭变种属间接合转移系统及透明颤菌血红蛋白的表达。【方法】以链霉菌广泛使用的整合型质粒pSET152和复制型pHZ1358为出发质粒,通过供体大肠杆菌(Escherichia coli)ET12567(pUZ8002)进行属间接合转移委内瑞拉链霉菌秦岭变种。【结果】确定了该变种的最佳接合转移条件;通过SOE-PCR(Splicing by overlap extension PCR)技术构建含PermE和vhb结构基因融合片段的整合型表达载体pJD100,转化ET12567(pUZ8002)后属间接合转移委内瑞拉链霉菌秦岭变种。通过PCR和CO结合差光谱验证了vhb基因在委内瑞拉链霉菌秦岭变种中的整合表达。【结论】本文首次探索了委内瑞拉链霉菌秦岭变种接合转移系统,确定了委内瑞拉链霉菌秦岭变种的最佳接合转移条件,并采用基因工程手段使vhb基因在委内瑞拉链霉菌秦岭变种中获得表达。     

毕赤酵母中表达透明颤菌血红蛋白提高重组脂肪酶的表达

解脂耶氏酵母胞外脂肪酶Lip2(YlLip2)是一种具有广泛应用前景的工业酶.为了改善高密度发酵生产Y1Lip2过程中的溶氧限制,提高Y1Lip2的表达量,将YlLip2基因lip2和透明颤菌血红蛋白(VHb)基因vgb分别置于AOXl启动子和PsADH2启动子的调控之下,进行YlLip2和VHb在毕赤酵母中的共表达.PsADH2启动子来源于树干毕赤酵母Pichia stipitis,在低氧条件下能被激活.SDS-PAGE和CO-差式光谱分析表明,Y1Lip2和VHb在重组菌中成功实现了共表达.在氧限制性条件下,VHb表达的细胞(VHb+,GS 115/9Klip2-pZPVT)与对照细胞(VHb-,GS 115/9Klip2)相比,摇瓶和10 L发酵罐中YlLip2表达量分别提高了25％和83％.此外,在低氧条件下,VHb+细胞在10 L发酵罐中的生物量也比VHb-细胞高.文中也获得了一株表达了VHb的并携带有多个lip2基因拷贝的克隆子GS 115/9Klip2-pZP VTlip2 49#,在低氧条件下,该克隆子在10L发酵罐中的最高脂肪酶水解活力达33 900 U/mL.因此,在毕赤酵母中用PsADH2启动子表达VHb,同时增加lip2基因的拷贝数是提高YlLip2表达量的一种有效策略.     

透明颤菌血红蛋白基因在淀粉酶产色链霉菌中的表达及对合成丰加霉素的影响

[目的]丰加霉素(Toyocamycin)是核苷类抗生素家族的重要成员,其在农业植物病害防治领域具有巨大的应用价值.为改善丰加霉素生产菌淀粉酶产色链霉菌(Streptomyces diastatochromogenes 1628)发酵过程溶氧限制,旨在实现vgb在S.diastatochromogenes 1628中的表达以促进丰加霉素的生物合成.[方法]首先以gfp为报告基因检测红霉素抗性基因启动子Perm*在S.diastatochromogenes 1628中的转录活性,再利用PermE*实现vgb的异源表达.[结果]在荧光显微镜下,重组菌1628-GFP菌丝可发出稳定明亮的绿色荧光,表明启动子PermE*在菌株1628中可有效启动外源基因的表达;通过一氧化碳结合差光谱分析显示VHb具有生物学活性;摇瓶实验表明:与原始菌株相比,重组菌可促进丰加霉素产量的提高,在中度和高度限氧条件下促进效果尤为明显,提高幅度分别为48.9％和104.5％. PCR和发酵效价检测显示重组菌具有良好的遗传稳定性.[结论]成功实现了vgb在S.diastatochromogenes 1628中的表达,有效提高了其丰加霉素的合成水平,为丰加霉素的工业化生产提供了基础条件.     

透明颤菌血红蛋白的应用进展

透明颤菌血红蛋白（VHb）具有在限氧条件下促进异源宿主细胞生长和增加产物产量的作用,已在发酵、环保、转基因动植物、重组蛋白表达等方面得到了广泛应用。将VHb与酶或蛋白融合表达可提高酶的活性、稳定性或蛋白的分离效率。对VHb进行改造有助于获得性能更良好的"新"蛋白。     

透明颤菌血红蛋白的表达及其对基因工程菌的影响

利用已克隆的透明颤菌血红蛋白基因,构建了一批复制类型和抗生标记不同的ｖｇｂ表达载体,并就ｖｇｂ基因表达及其对几种基因工程大肠杆菌的影响进行了初步研究。实验证明ｖｇｂ基因的表达具有氧调控特性,在溶氧水平下跌至２０％饱和度时迅速合成。ｖｇｂ基因的表达产物可促进青霉素酰化酶和ＴＮＦ、ＩＬ－２等基因工程菌在低氧条件下细胞生长和产物表达的状况,由于ｖｇｂ基因的表达降低了细胞对氧的敏感程度,可望运用它来改善发     

透明颤菌血红蛋白的表达及对基因工程菌的影响

利用已克隆的透明颤菌(Vitreoscilla)血红蛋白基因(vgb),构建了一批复制类型和抗生标记不同的vgb表达载体,并就vgb基因表达及其对几种基因工程大肠杆菌的影响进行了初步研究。实验证明vgb基因的表达具有氧调控特性,在溶氧水平下跌至20％饱和度时迅速合成。Vgb基因的表达产物(Vitreoscilla Hemoglogin,VHb)可促进青霉素酰化酶和TNF、IL-2等基因工程菌在低氧条件下细胞生长和产物表达的状况,由于vgb基因的表达降低了细胞对氧的敏感程度,可望运用它来改善发酵过程中溶氧控制裕度。这些实验结果预示着vgb基因在耗氧生物过程中,如抗生素工业和基因工程菌高密度发酵,有着良好的应用前景。     

透明颤菌血红蛋白的表达对酵母中麦角固醇合成的影响

构建了含透明颤菌（Vistreoscilla）血红蛋白基因vgb和酵母遗传霉素（G418）抗性基因的重组质粒pVgbkanMX4,转化至酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae 1190中,经过分析,基因vgb在酵母细胞中得到表达。对重组菌和野生菌进行了摇瓶培养及5 L发酵罐培养的研究。在摇瓶实验中,重组菌的麦角固醇产量比野生菌有显著提高,在野生菌中的含量为0.573%、而在重组菌中的产量为1.07%。 经过30 h发酵罐培养的实验,野生菌中麦角固醇含量为0.9%,重组菌中其含量为1.38%,验证了摇瓶实验的结果。结果证明vgb基因有利于酵母中麦角固醇的合成。     

透明颤菌血红蛋白基因克隆及植物表达载体的构建

透明颤菌血红蛋白是一种专性好氧的氧结合蛋白。目的:以VHb基因构建植物表达载体,并在大肠杆菌中实现表达。方法:使利用试剂盒提取透明颤菌血红蛋白的总DNA,以其为模板通过PCR克隆VHb基因。结果:克隆得到VHb基因片段的长度约为0.5kb,与NCBI上公布的VHb基因序列最大同源性达99%。结论:通过酶切鉴定及PCR检测,成功构建重组植物表达载体p3300-vhb-super promoter-Tnos。     

透明颤菌血红蛋白的研究与发展前景

在缺氧条件下,透明颤菌血红蛋白(VHb)通过促进氧输送增强呼吸和能量代谢,并在各种宿主中表达,显示出改善增长,蛋白质分泌,代谢产物的生产力和提高宿主抗逆性等的生理效应,从而使蛋白质在代谢工程尤其在优化植物代谢中应用前景广阔.概括了VHb在生物技术工业的诸多研究领域中的应用潜力,探讨VHb功能的细胞机制,并显示出各领域所采取的各种方法.     

透明颤菌血红蛋白在发酵工业中的应用概述

透明颤菌血红蛋白在发酵工业中的应用概述郭宏秋,杨胜利（中国科学院上海生物工程研究中心,上海２００２３３）在生物技术日益产业化的今天,特别是随着基因工程技术的飞速发展,为生产新的生物产品带来了可能,有些产品已进人商业化生产,像干扰素、白细胞介素、生长激...     

利用PCR法扩增透明颤菌血红蛋白基因条件的优化

以透明颤菌染色体基因组DNA为模板,利用PCR技术获取透明颤菌(Vitreoscilla)血红蛋白基因(vgb)。在多聚合酶链式反应中采用碱变性模板与热启动等方法进行透明颤菌血红蛋白基因体外扩增,成功地扩增出约0.5 kb的透明颤菌血红蛋白基因,并对vgb的PCR条件进行了研究。获取理想的目的基因PCR反应的综合参数比十分重要。     

透明颤菌血红蛋白基因在解淀粉芽孢杆菌中的表达及其影响

将强启动子P43与透明颤菌血红蛋白基因（vgb）通过重叠延伸PCR进行融合,克隆到芽孢杆菌整合表达载体pDG1730中,重组表达载体pDG-P43vgb转化促生防病解淀粉芽孢杆菌FZB42,Wsetern-Blot和CO差光谱分析表明重组菌株FZB42-VHb表达了有活性的VHb蛋白,VHb的表达对重组菌株菌体的生长及抗菌脂肽的产生都有促进作用.在相同培养条件下,重组菌最大菌体密度比原始菌株提高了14.49 %,抗菌脂肽fengycin的产量提高了1.74倍,抗菌脂肽surfactin的产量提高了3.14倍.