固氮酶钼铁蛋白铁钼辅因子的抽提研究进展

固氮酶由两种铁硫蛋白(钼铁蛋白和铁蛋白)组成。由还原剂提供电子经铁(Fe)蛋白传递给钼铁(MoFe)蛋白,在MoFe蛋白的活性中心部位进行N_2、C_2H_2等多种底物的还原[10,11,20]。MoFe蛋白中的Mo、Fe原子和酸不稳定性硫原子(S~*)组成2个M簇(FeM-oco)、3—4个P簇(P-cluster)及1—2个S(2Fe)簇。在底物还原过程中,这些原子簇都可能参与电子的传递。铁钼辅因子(FeMoco)已被认为是络合和还原底物的重要部位。因此,要阐明MoFe蛋白的作用机理就得研究FeMoco的结构和功     

铁钼辅因子激活氧钝化钼铁蛋白的初步研究

棕色固氮菌(Azotobacter vinelandii)固氮酶钼铁蛋白氧钝化后,未断裂出任何含钼、铁原子的断片。用有机溶剂从钼铁蛋白中提取得到的铁钼辅因子(FeMoCo)可以激活被氧钝化了的钼铁蛋白,使其还原乙炔能力得到部分或完全恢复。这种激活作用的效率随着钼铁蛋白氧钝化程度的加深而降低。初步结果表明,氧钝化的钼铁蛋白中最先受到损伤的可能是 FeMoCo。如果氧钝化程度进一步加剧,其它部分也可能受到损伤。     

棕色固氮菌固氮酶钼铁蛋白纯净铁钼辅因子的制备和性质

建立了以挥发性酸碱(TFA/NH_4OH)和NH_4OH碱化的NMF从棕色固氮菌固氮酶钼铁蛋白分离提取纯净铁钼辅因子(FeMo—co)的方法。得到了纯净FeMo-co的NMF制剂,从而证明了Tris、ClNa~ 、柠檬酸、HPO_4~(-2)、S_2O_4~(2-)以及氨基酸残基不为FeMo—co的有效分离和结构稳定所必需。制备的纯净FeMo—co的Fe/Mo比为8,比活为230nMC_2H_4/min/MoMn。由于分离制备的FeMo—co制剂除抽提溶剂NMF外不含任何其他成分,所以是进行FeMo—co结晶和结构研究的理想材料。     

钼铁蛋白铁钼辅因子的有机组分对其功能的影响

棕色固氮菌(Azotobacter vinelandii)固氮酶的钼铁蛋白经邻菲啰啉在厌氧或有氧环境中处理后,变为 P-cluster 单一缺失或 P-cluster 和 FeMoco 同时缺失的失活钼铁蛋白。含柠檬酸盐或高柠檬酸盐的重组液都使这两种失活蛋白能恢复固氮酶重组的 H~ 和 C_2H_2还原活性,活性恢复程度随反映钼铁蛋白中金属原子簇含量变化的圆二色和磁圆二色谱及金属含量的恢复程度的提高而提高,但它们固 N_2能力的恢复程度则不相同:P-cluster 单一缺失的蛋白用两种重组液重组后均可恢复其固 N_2能力,而 P-cluster 和 FeMoco 同时缺失的蛋白,只有用含高柠檬酸盐的重组液重组才恢复其固 N_2能力,表明含不同有机组分的重组液所组装的 P-cluster 均与天然状态相同,只有含高柠檬酸盐的重组液所组装的 FeMoco 才与天然状态相同,从而证明高柠檬酸盐是 FeMoco 的必需的有机组分。     

棕色固氮菌不固氮变种UW45与固氮酶钼铁蛋白铁钼辅因子重组的某些特性

以UW45抽提液的DEAE-纤维素柱层析的0.15M NaCl或0.25M NaCl洗出液与Smith法或Shah法制备的铁铝辅因子重组,则0.25 M NaCl洗出液的重组对乙炔还原的活性远较0.15 M NaGl的为高。0.15 M NaGl的洗出液较0.25 M NaCl洗出液的组分明显不纯。不全钼铁蛋白与铁钼辅因子和铁蛋白重组后能还原基质氰化钾,但对分子氮或迭氮化钠的还原却较微弱甚至不还原。铁钼辅因子按Smith和Shah法制备,其分子量范围分别为低于1000D和接近1500D。由于Smith和Shah法两种铁钼辅因子还原乙炔和氰化钾的比活不同,电泳图谱有差异、分子量又有大小,因此这两种铁钼辅因子的分子结构可能不尽相同。     

植物中钼的吸收转运及钼辅因子与钼酶的研究进展

钼是植物生长发育所必需的微量元素,只有和蛋白质或者蝶呤结合形成钼辅因子才能产生生物活性。自然界存在2种钼辅因子:以铁硫簇为基础的铁钼辅因子(Fe Moco)和以钼蝶呤为基础的钼辅因子(MPT/Moco)。植物对钼的吸收有2种转运蛋白系统,一种是专一性转运蛋白,如MOTl和MOT2;另一种是共转运蛋白,如磷酸盐转运蛋白(PHT)和硫酸盐转运蛋白(SULTR)。最近研究发现一种钼酶——线粒体氨肟还原蛋白(m ARC)。本文综述了近年来植物体内钼的吸收与转运机制、钼辅因子的合成过程以及钼酶的研究进展,并提出了今后的重点研究方向。     

固氮酶铁钼辅因子FeMo-co在水与非水体系内重组活力与催化活力的比较研究

 本文提出一种测定FeMo-co催化活力的反应体系,用此反应体系,在测定FeMo-co催化活力的过程中,FeMo-co与变种UW45抽提液的重组活性始终保持不变。讨论了水含量、还原剂对FeMo-co催化活力和重组活力的影响。     

辅因子再生研究进展

许多有价值的酶催化反应都需要辅因子的参与。因为辅因子价格昂贵,所以,在酶催化工业应用中,需要实现辅因子原位再生。经过几十年研究,出现了酶法、化学法、电化学法、光化学法和基因工程法等手段实现烟酰胺类辅因子（NAD（P）H）、ATP、糖核苷酸等辅因子再生。对辅因子再生研究中取得的进展以及存在的问题进行讨论。     

酶的辅因子

(一)辅因子概念酶的化学本质是蛋白质,它和其它蛋白质一样,主要由氨基酸组成。因此也具有两性电解质的性质,并且具有一、二、三、四级结构。酶和其它蛋白质一样,其中有些是单纯蛋白质,有些是结合蛋白质。脲酶、胃蛋白酶、胰蛋白酶和核糖酸酶等一般水解酶都属于简单蛋白质。这些酶只由氨基酸组成,此外不含其它成份。转氨酶、碳酸酐酶、乳酸脱氢酶及其它氧化还原酶类等均属于结合蛋白质。这些酶除了蛋白质组份外,还含有对热稳定的非蛋白的小分子物质。前者称为酶     

蝶呤型钼辅因子生物合成、运输及组装——潜在的药物靶标

钼辅因子作为氧化还原反应中的重要分子,参与硫、氮、碳的氧化还原代谢.钼辅因子主要分为两类:以铁硫簇为基础的铁钼辅因子和以亚钼蝶呤为基础的钼辅因子.钼-二-亚钼蝶呤-鸟苷二核苷钼辅因子(Mo-bis-MGD)是蝶呤型钼辅因子的重要成员之一,是硝酸盐还原酶的重要辅因子.膜结合硝酸盐还原酶介导的硝酸盐还原为细菌提供了氮源和能...     

微生物辅因子工程研究进展

微生物细胞中的大部分酶促反应都需要各种辅因子的参与,辅因子平衡对维持细胞内的生化反应稳态非常重要,辅因子供应不足会导致细胞生长和化合物生产的紊乱。近年来,辅因子在生化反应过程中的关键作用备受关注,但由于其价格较昂贵、稳定性差,因此限制了辅因子工程的发展。合成生物学和代谢工程的发展为辅因子的可持续供应提供了可行的解决方案,多种加强辅因子供应的策略有效地推动了目标化合物的生物合成。其中,烟酰胺类辅因子NAD(P)⁺、NAD(P)H是微生物代谢过程中最常见的氧化还原辅因子,它们在所有生物体内作为重要的电子受体或供体推动合成与分解代谢反应,对维持胞内氧化还原动态平衡起着决定性作用。从NAD(P)H的主要来源和NAD(P)⁺/NAD(P)H的平衡对天然产物生物合成中的影响出发,重点从三个不同维度讨论辅因子工程策略,综述代谢途径调节、外源氧化还原酶的引入、蛋白质工程等多种辅因子再生策略的最新研究进展及应用,展望辅因子代谢工程在生物合成中的未来发展方向。     

固氮酶铁钼蛋白的氧敏感性

自然界中含有固氮酶的微生物和蓝绿藻,能够把大气中的N_2转变为可被植物利用的氮。这些固氮生物中,好气性自生固氮菌、豆科植物根瘤菌及某些藻类在有氧环境中能高效率固定N_2。而所有固氮生物体内的固氮酶对O_2都非常敏感,其敏感程度随分离、纯化程度的提高而提高。一些生物能在好气环境中固氮是因在他们的体内存在结构(膜、构象)保护、呼吸保护和保护蛋白、豆血红朊等的作用,所以,固氮酶可避免氧的损伤而完成固氮功能。     

微生物辅因子平衡的代谢调控

辅因子平衡对于酶制剂、药品和化学品的生产具有重要的作用。为了满足工业化生产的需求,维持辅因子长期有效的平衡是实现代谢流高效化导向目标代谢产物的必要手段。本文在总结辅因子生理功能的基础上,从生化工程和代谢工程两方面分析归纳了辅因子的代谢调控策略,并展望了辅因子进一步精深调控的发展方向。     

固氮酶铁钼辅基理化特性的研究

在紫外可见光谱区内，固氮酶铁钼辅基均无特征吸收峰，不含高柠檬酸盐。含双钼的铁硫簇的电荷数、颜色与该金属簇中的亚铁量成对应关系，并都有较高的生物重组活性。     

固氮酶铁钼辅基理化特性的研究

在紫外可见光谱区内,固氮酶铁钼辅基〔（Ｍｏ_２Ｆｅ_（１２）Ｓ_（１２））４－〕均无特征吸收峰,不含高柠檬酸盐。含双钼的铁硫簇〔（Ｍｏ_２Ｆｅ_（６～１２）Ｓ_（６～１２））~（１～４）－〕的电荷数、颜色与该金属簇中的亚铁量成对应关系,并都有较高的生物重组活性．     

铁氰化钾氧化固氮酶钼铁蛋白与铁、钼、硫化合物重组的研究

棕色固氮菌固氮酶钼铁蛋白经铁氰化钾氧化后变为“漂白蛋白”,其活性损失约75％,同时释放出80％的钼和50％左右的铁。与铁、钼、硫重组溶液重组,金属组成和乙炔还原活性均得到明显恢复。穆斯鲍尔(M／issbauer)谱表明,重组溶液中的Fe、Mo、S已形成FeMc6原于簇的类似物,“重组蛋白”的M6ssbauer谱和天然MoFe蛋白相似。