ATP：RNA腺苷酰转移酶的纯化及其应用

绝大多数真核细胞mRNA的3＇-端带有一段多聚腺苷酸即poly(A)的结构,在基因工程的研究中经常以这样的mRNA作为模板,以寡聚(dT)12—18作为引物,通过反转录酶的作用得到互补于该mRNA的DNA(即cDNA),再经克隆增殖等技术可得到相当量的基因,从而能进一步进行各种研究。近年来这些技术也常用于病毒RNA基因组的研究。Devos等人利用ATP:RNA腺苷酰转移酶使3＇端无poly(A)的病毒RNA基因加上一段poly(A),     

甲胎蛋白(AFP)信息核糖核酸的纯化——Ⅱ.人胚肝和正常大鼠肝信息核糖核酸(mRNA)的制备

应用寡聚胸腺嘧啶纤维素(简称OdC)柱层析从哺乳动物RNA样品中提取mRNA已被人们普遍采纳。这一方法首先需要用改良的酚-氯仿法提取总RNA,然后再经OdC柱层析分离得到mRNA(下称此法为间接法)。近年来,有人用0.5％十二烷基磺酸纳(SDS)解聚多聚核糖核蛋白体(简称多聚核糖体)后,直接经OdC柱层析分离某些mRNA获得成功。据报道这一方法(下称直接法)具有条件温和、产率较高及不影响翻译活力等特点。     

猴头多糖分离纯化的初步研究

目的：确定适合于猴头多糖分离纯化的方法。方法：以液体发酵生产的猴头菌丝为材料,提取猴头菌丝多糖进行分离纯化,以得到多糖纯品。结果：猴头菌丝粗多糖采用Sevag法除蛋白的次数应该控制在5-8次,而且Sevag法除蛋白所得的HMP,经DEAE-纤维素柱层析初步纯化,多糖主要分布在蒸馏水洗脱部分,命名为HMPⅠ,其含量为67.5%;HMPⅠ经Sephadex G-100凝胶柱层析纯化,得到两个组分：HMPⅠa、HMPⅠb;HMPⅠa为多糖主要组分,含量为71.8%;HMPⅠa经纯度鉴定为多糖纯品。结论：DEAE-纤维素柱层析结合Sephadex G-100凝胶柱层析的纯化方法,可以获得猴头多糖纯品。     

猪胸腺末端脱氧核苷酰转移酶的分离纯化及性质的研究

 本文报道了一种较简便的从猪胸腺中分离纯化末端脱氧核苷酰转移酶(TdT)的方法。经一次磷酸纤维素柱层析,使TdT与DNA聚合酶分离;经三次柱层析,可获得SDS-电泳纯,分子量约60K的产品。其酶学性质与牛胸腺TdT相似。     

北京鸭卵对蛋白mRNA的提纯及某些性质的鉴定

 本文报道了从产卵期北京鸭输卵管中提取总RNA,经Olilo(dT)-纤维素柱层析,再经sepharose 4B柱层析步骤,得到了纯化的鸭卵清蛋白mRNA。我们建立了麦胚无细胞体系并探索了鸭卵清蛋白mRNA在此体系中翻译的最适条件。在此条件下测定了各纯化步骤的总mRNA翻译活性,并用免疫沉淀法测定其中卵清蛋白mRNA的活性。测定结果表明我们从mRNA中分离得到了纯鸭卵清蛋白mRNA。用变性的琼脂糖凝胶电泳对各纯化步骤的核酸样品进行组成分析,确定出鸭卵清蛋白mRNA的大小约为21S。     

枯草芽孢杆菌BS12乳酸脱氢酶的分离纯化与部分性质的研究

枯草芽孢杆菌ＢＳ１２的乳酸脱氢酶经硫酸铵分级沉淀、ＣＭ－纤维素、ＤＥＡＥ－纤维素离子交换柱层析、ＳｅｐｈａｄｅｘＧ—２００柱层析,得到了凝胶电脉均一的样品。用ＳＤＳ—ＰＡＧＥ测得其亚基分子量为２８０００Ｄａ。酶反应的最适ｐＨ为７．０,最适温度为３５℃。     

腺苷对大鼠心肌钙蛋白Ⅰ及磷脂酰基醇磷酸化的抑制作用

 用差速离心及等密度梯度离心法从大白鼠心肌细胞分离收缩蛋白质及质膜,分别与[γ-~(32)P]ATP保温以观察细胞成分的磷酸化,以及腺苷和腺苷类似物对磷酸化的影响。结果表明,在收缩蛋白质组分,~(32)P主要参入肌钙蛋白I(Troponin I,29000Da);在质膜组分,~(32)P主要参入磷脂酰肌醇-4-一磷酸(PtdIns4P),亦即ATP使磷脂酰肌醇(Ptd Ins)磷酸化。腺苷对此两种磷酸化都有抑制作用,尤以对PtdIns磷酸化的抑制最强烈。cAMP对肌钙蛋白Ⅰ的磷酸化有刺激作用,这与文献报道相符。作者认为,腺苷和cAMP对肌钙蛋白Ⅰ磷酸化的拮抗作用与腺苷和肾上腺素对心肌调节的拮抗作用有明显的相关性。鉴于近年发现,肌醇磷脂转换在调节细胞活动中起重要作用,腺苷对磷脂酰肌醇磷酸化的抑制作用可能有重要的生物学意义。     

烟草花叶病毒RNA双链复制型的分离和鉴定

用”P标记感染了TMV‘的普通烟草,从叶组织中提取总RNA,井用纤维素柱层析分离,得到了TMV-RNA的复制型。它在高离子强度下抗Rnase,在低离子强度下对Rnase敏感,并具有能自我退火和能与TMV-RNA杂交等性质。用聚丙烯酰胺凝胶电泳法测得其分子量为3．8×106。根据以上性质可以确认它是对TMV-RNA有专一性的双链RNA。     

蛋白激酶C活力的非同位素酶解测定法

在磷脂酰丝氨酸和Ca²⁺存在下,活化的蛋白激酶C以ATP为磷的供体使组蛋白H1磷酸化。用Dowex-1柱层析分离反应后的ADP与ATP,再用酸性磷酸酶水解ATP的磷酸酯键,测定磷的含量,建立了蛋白激酶C活力的非同位素酶解测定法。此法可靠易行。CV=5.2％。     

几种不同分离polyA—RNA方法的比较

本实验采用四种方法:(1)冷酚法。(2)琼脂糖凝胶2 B柱层析(3)超速离心。(4)镁离子沉淀,从大鼠肝中分离出poly A RNA。用(1)法提取总RNA,用其他方法分别抽提pRNA,再分别经Oligo(dT)—纤维素柱层析分离出poly A RNA。从A260/A280,A280/A260,A260/A230,比值、收得率、电泳行为作一比较,初步认为:冷酚法所得polg A RNA收得率较好,但有其他RNA;2 B拄层析法收得率最高,可是纯度较差;超离心法仪器昂贵,不宜普及,镁离子沉淀法则是一个操作简便而又适用的方法。     

DNA连接酶、RNA连接酶、多核苷酸激酶和DNA聚合酶的同时分离纯化

本文报道从T4amN82噬菌体诱导的大肠杆菌E.coliB 同时分离和纯化四种酶的一般方法。先用硫酸链霉素沉淀把RNA连接酶,DNA连接酶与多核苷酸激酶和DNA聚合酶加以分离。然后用DEAE纤维素柱层析把DNA连接酶与RNA连接酶加以分离,用DEAE-Sephadex-A50柱层析把多核苷酸激酶与DNA聚合酶加以分离。本文着重介绍T4DNA聚合酶的分离纯化。     

鲤鱼垂体mRNA反转录模板活性的研究

 本实验用不同方法研究鲤鱼垂体mRNA反转录为互补DNA的活性。用硫氰酸胍法,从垂体中提取总RNA,经过Oligo(dT)-纤维素柱层析,得到poly(A)~+RNA。 以mRNA为模板,30％反转录成单链cDNA。利用RNaseH-DNA聚合酶Ⅰ-E.coli DNA连接酶合成双链cDNA。单链cDNA拷贝成双链cDNA。经放射自显影分析,证明合成了全长cDNA。用水解法合成双链cDNA,大多数为不完整的双链cDNA。平末端的双链cDNA连接上Eco RI-linker经Sepharose-4B分离,收集大片段cDNA,与pUC 19载体相连接,经转化构建成10~5克隆/μg mRNA的cDNA文库。     

北京鸭珠蛋白mRNA的分离纯化及其cDNA的合成

 从人工贫血的北京鸭网织红细胞中直接提取总RNA,经Oligo(dT)-纤维素柱层析分离获得珠蛋白mRNA,并经蔗糖密度梯度离心首次得到了电泳单一条带的北京鸭球蛋白mRNA。从凝胶电泳以及蔗糖密度梯度离心鉴定其沉降系数为9S。在麦胚无细胞体外翻译体系中测定了它们的蛋白翻译活力。鸭珠蛋白mRNA促进了~3H-亮氨酸参入新生蛋白的活力,达到对照组的10倍。所翻译的蛋白产物在SDS-聚丙烯酰胺凝胶上的电泳行为与天然鸭珠蛋白一致。 经Oligo(dT)-纤维素及蔗糖密度梯度离心提纯的珠蛋白mRNA,在AMV反转录酶及DNA聚合酶的作用下,分别合成了单链及双链cDNA。其双链链长,经凝胶电泳分析,约为500碱基对。     

用电镜放射自显影术研究TMV-RNA在烟叶细胞中的复制

在放线菌素D(AMD)抑制细胞RNA合成时,用3H-尿嘧啶核苷标记TMV侵染的和健康的烟草叶片,经固定,包埋,切片,RNA酶处理及放射自显影后,在电镜下观察。结果表明,3H-尿嘧啶核苷向病毒基因组或其复制中间体的掺入主要发生在细胞核内,叶绿体内有少量掺入,线粒体内未发现有掺入。因此认为TMV—RNA的合成主要是在缅胞核内进行的。切片如先经蛋白酶和RNA酶处理,再进行放射自显影,则自显影上的银粒几乎全部消失。从超薄切片后的剩余样品取小样,用酚一SDS法和Serva纤维素柱层析,从TMV侵染的烟叶中分离到了抗RNA酶的’H—ds—RNA。从而推测复制中间体在体内很可能主要是单链的,其复制过程很可能不经过双链复制型(RF)。提取到的’H一‘is—RNA：,可能是提取过程中的人为产物。     

当归多糖的分离化及其部分性质的研究

中药当归经热水提取、乙醇分级沉淀、乙醇分级沉淀、ＤＥＡＥ纤维素和ＳｅｐａｄｅｘＧ－１５０柱层析,得Ａｓ－Ⅲｂ两个多糖级份。Ａｓ－Ⅲａ和ＡｓⅢｂ经醋纤维薄膜电泳、玻璃纤维纸电泳和凝胶柱层析分析,证明都是均二的,经琼脂糖凝胶柱层析测得Ａｓ－Ⅲａ和ＡｓⅢｂ的分子量分别为８５ＫＤ和４９ＫＤ左右。组成分析表明Ａｓ－Ⅲａ由葡萄糖组成,Ａｓ－Ⅲｂ由葡萄糖、甘露糖和阿拉伯糖组成,三者比为１０：１０：４。     

大鼠肝谷胱甘肽转硫酶的制备及其部分性质的研究

本文通过CM-52纤维素柱层析分离得到六种大鼠肝谷胱甘肽转硫酶同工酶;经GSH—亲和层析柱进一步纯化,得到纯酶。讨论了该酶的部分理化性质。抑制实验结果表明,胆酸类化合物对谷胱甘肽转硫酶的抑制作用类型为非竞争性。     

重组酿酒酵母腺苷激酶的表达、纯化和鉴定

腺苷激酶 (adenosinekinase ,AK)是控制细胞中腺苷浓度的一种关键酶 ,在许多细胞和组织中发挥着重要的生理效应子作用。从酿酒酵母 (Saccharomycescerevisiae)中克隆了腺苷激酶基因 (ak) ,并将其接入大肠杆菌pET16b表达质粒中进行表达。重组蛋白质经部分纯化后 ,测定其酶动力学常数 ,结果表明该酶对腺苷的Km 值为 (3.5± 0 .2 ) μmol L ,对ATP的Km 值为(10 0 .0± 11.0 ) μmol L ,对腺苷的kcat值为 (15 30± 2 0 )min- 1 ,对ATP的kcat值为 (14 4 8± 2 5 )min- 1 。该酶对其他核苷和脱氧核苷的Km 值测定数据表明 ,从酵母中克隆得到的该重组腺苷激酶具有较高的底物特异性。     

棕色固氮菌吡啶核苷酸转氢酶的分离纯化及性质的探讨

由棕色固氮菌菌体经超声波破碎处理的无细胞提取液,经50℃加热处理15分钟,硫酸铵区分,DEAE纤维素(DE—32)柱层析,SephadexG—100纯化,得到聚丙烯酰胺凝胶电泳均一的转氢酶制备物(胶浓度7.5％)。酶比活提高了     

球形芽孢杆菌Ts-l毒蛋白的分离纯化

球形芽孢杆菌Ts-1对蚊虫幼虫有高效杀灭能力,其有毒成份为一种蛋白质。纯芽孢一晶体复合物经超声波处理后,以0．05 mol／L的NaoH抽提毒素,经sephadex G-2 00葡聚糖凝胶柱层析纯化,用SDS—PAGE检验柱层析得到的杀虫活性部分,Ts—1的芽孢-晶体复合物中主要为4zkD和43KD的两种蛋白质。经聚丙烯酰胺凝股制备电泳分离纯化,生物活性测定表明这两种蛋白质都有杀蚊毒效,经DEAE纤维素柱层析进一步纯化,获得了分子量为42kD的毒蛋白。     

长角血蜱唾液腺中腺苷三磷酸双磷酸酶的纯化及其酶切机制

利用染料亲和层析(Cibacorn Blue柱)和离子交换层析(Macrosphere WCX柱)对长角血蜱Haemaphysalis longicornis唾液腺的腺苷三磷酸双磷酸酶进行纯化,经SDS-PAGE证实其分子量为66 kD。腺苷三磷酸双磷酸酶可以水解ATP和ADP,但对AMP无水解作用,水解ATP和ADP的K_m值均为0.2 μmol/L,V_max值分别为12.5和15.6 μmol/(min·mg)。腺苷三磷酸双磷酸酶水解ATP的中间产物是ADP,最终产物是AMP和正磷酸。表明腺苷三磷酸双磷酸酶水解ATP的位点是5'-核苷酸的γ-磷酸键,水解ADP的位点是5'-核苷酸的β-磷酸键。