神经生长抑制因子研究进展

神经生长抑制因子(neuronal growth inhibitory factor, GIF) 又名金属硫蛋白-Ⅲ (metallothionein-Ⅲ,MT-Ⅲ),特异分布于中枢神经系统(CNS),是神经系统中第一个被鉴定的具有神经元生长抑制功能的蛋白. GIF一级序列、高级结构、金属结合特性类似于其他MTs,基因结构也与其他MTs高度同源,但表达调控途径相异. GIF可能以其β结构域的CPCP区,与脑组织提取物中的相关因子结合,进而表现其生物学功能. 有研究认为GIF与阿尔茨海默等脑相关疾病均有密切关系.     

人神经生长抑制因子β结构域的高效表达及性质研究

神经生长抑制因子（ Ｇ Ｉ Ｆ）是一种特异存在于哺乳动物脑中的金属硫蛋白（ｍ ｅｔａｌｌｏｔｈｉｏｎｅｉｎ, Ｍ Ｔ）类似物,又称 Ｍ Ｔ Ⅲ．它与 Ｍ Ｔ 有相同的结合 Ｚｎ（Ⅱ）, Ｃｄ（Ⅱ）, Ｃｕ（Ⅰ）等金属的能力,但与 Ｍ Ｔ 不同的是它能够抑制神经细胞的生长,并发现在患 Ａｌｚｈｅｉｍ ｅｒ ｄｉｓｅａｓｅ（ Ａ Ｄ 症）病人的大脑中 Ｇ Ｉ Ｆ蛋白量和ｍ Ｒ Ｎ Ａ 的量均显著下降,研究证明 Ｇ Ｉ Ｆ对神经细胞的抑制活性主要存在于其 β结构域中．为进一步研究 β结构域结构和功能的关系,将 β结构域的 ｃ Ｄ Ｎ Ａ 克隆入融合表达载体ｐ Ｇ Ｅ Ｘ ４ Ｔ １ 中, Ｉ Ｐ Ｔ Ｇ 诱导并高效表达了 β结构域蛋白,通过氨基酸组成和质谱的测定,证明得到了目的蛋白．利用金属重组的方法,分别得到了结合 Ｃｄ 和 Ｚｎ 的 Ｇ Ｉ Ｆ 的 β结构域,并测定了其巯基和金属含量对蛋白量的比值,证明所得 Ｇ Ｉ Ｆ β与 Ｍ Ｔ β在结合金属能力上十分相似．用紫外光谱学的研究表明, Ｃｄ Ｍ Ｔ 的 β结构域在２５０ ｎｍ 处比 Ｃｄ Ｇ Ｉ Ｆ 的 β结构域有一明显肩峰,从而表明二者的金属—巯基结合簇的结构有明显不同,而这种结构上的差异有可能导致二者在功能上的不同．     

金属硫蛋白α和 β结构域的结构功能比较研究

金属硫蛋白具有α和β两个独立的结构域,它们结构不同,并能独立的行使功能。为了进一步研究这两个结构域之间的区别,分别采用镉和铜重组金属硫蛋白并继以枯草杆菌蛋白酶水解的方法制备α和β结构域,以及利用pGEX-4T-1这种融合表达载体表达α和β结构域。所得产物经凝胶过滤层析分离纯化后,进行了氨基酸组成,巯基和金属含量以及分子量测定,以上性质均与天然的金属硫蛋白α和β结构域相同。然后利用紫外吸收光谱和圆二色吸收光谱来研究它们的巯基金属簇结构,从UV和CD图谱可以看出,通过蛋白水解和基因表达制备的α和β结构域都具有独立的镉硫金属簇结构,但β结构域的镉硫金属簇不如α结构域紧密,其在254nm的吸收峰不象α结构域那么明显。利用DTNB的竞争反应测定了α和β结构域对镉和锌的结合力,实验结果表明,α结构域倾向于结合Cd2+,β结构域倾向于结合Zn2+。以上研究对于进一步了解α和β结构域的生理功能和分子进化提供了有利的证据。     

金属硫蛋白及其结构域突变体的紫外和圆二色光谱学研究

采用 p GEX- 4T- 1融合表达载体高效表达所得的金属硫蛋白及其结构域突变体 ,包括 α结构域 ,β结构域 ,α- KKS- α和 β- KKS- β( KKS为金属硫蛋白结构域之间的天然连接区氨基酸 ) ,经纯化和纯度鉴定后 ,利用紫外和圆二色光谱进行结构研究 .在脱金属的上述蛋白中 ,固定 p H为中性 ,改变加入 Cd2 + 的比例 ,或固定 Cd2 + 浓度 ,逐渐调节 p H至中性 ,观察紫外和圆二色光谱中镉硫金属簇吸收峰的形成 .研究结果表明 :镉硫金属簇的形成依赖于加入金属的比例和 p H值 ,所有蛋白均于p H3.1 5以上开始形成明显的吸收峰 .紫外图谱中的吸收峰位于 2 54nm附近 ,但在圆二色图谱中不同蛋白形成的峰的位置不同 ,MT,α结构域和 α- KKS- α在 2 2 5nm和 2 58nm处有吸收 ,β结构域在 2 60 nm处有吸收 ,而 β- KKS- β在 2 4 5nm处有吸收 ;向 α结构域 ,β结构域 ,MT,α- KKS- α和 β-KKS- β中分别加入 4eq,3eq,7eq,8eq和 6eq( eq:equivalent,当量 )的 Cd2 +时 ,吸收峰可达到最大值 .同时发现 α结构域的吸收峰强于 β结构域 ,而且双结构域突变体的镉硫金属簇则明显强于相应的单结构域突变体 ,这表明吸收峰的强弱与金属结合力的大小相关 ,而且结构域之间存在相互作用 ,从而影响与金属的结合 .     

G蛋白Rab3a协同神经生长抑制因子(GIF)抑制神经元的生长

为了研究G蛋白Rab3a与神经生长抑制因子 (growthinhibitoryfactor,GIF ,原称金属硫蛋白 3,MT 3)相互作用对神经元细胞生长的影响 ,以嗜铬细胞瘤株 (pheochromocytoma)PC1 2充当神经元模型 .将hMT 3(humanMT 3)和Rab3a基因分别克隆至真核表达载体pFlag CMV 2和pSV HA中 ,质粒共同转染PC1 2细胞 ,观察转染后细胞的生长状态 .以共转染pFlag CMV 2 hMT 1和pSV HA Rab3a的细胞组作为对照 ,验证hMT 3与Rab3a相互作用对PC1 2影响的特异性 .结果发现 ,共转染pFlag CMV 2 hMT 3和pSV HA Rab3a的PC1 2细胞生长明显受到抑制 ,细胞生长抑制率与GIF在脑提取物存在F的神经元生长抑制作用接近 ,但转染两基因中的任何单个基因以及共转染pFlag CMV 2 hMT 1和pSV HA Rab3a对PC1 2细胞生长无影响 .进一步构建重组表达质粒pGEX 4T 1 Rab3a和pGEX 4T 1 hMT 3,转化大肠杆菌BL2 1 ,经谷胱甘肽 Sepharose 4B亲和层析、凝血酶酶切和SephacrylS 1 0 0纯化 ,得到纯度 95 %以上的Rab3a和hMT 3蛋白 .体外细胞生物学活性检测表明 ,表达的Rab3a蛋白与重组hMT 3蛋白共培养PC1 2 ,对细胞的生长产生了明显的特异性协同抑制作用 ,抑制曲线与GIF在脑提取物存在下的神经元生长抑制曲线极为相似     

生长抑制因子(GIF)与G蛋白Rab3a直接相互作用

生长抑制因子(growth inhibitory factor, GIF), 又称金属硫蛋白-3, 为68个氨基酸组成的脑特异性金属硫蛋白, 具有广泛的生理功能; GIF可能与阿尔茨海默氏症(Alzheimer's)病理相关, 在Alzheimer's脑提取物存在下, 还对神经细胞具有特异的生长抑制活性.然而, 对其发挥生长抑制作用的分子机制并不清楚.运用酵母双杂交系统从人脑cDNA文库中筛选与GIF相互作用因子,从4.1×10⁶个人脑cDNA文库转化子中,首次筛选到Ras家族G蛋白Rab3a C端,包含87个氨基酸的片段能与GIF相互作用;用PCR自人胎盘总cDNA中获得包含完整Rab3a编码序列的cDNA;通过酵母双杂交实验表明,全长Rab3a蛋白亦能与GIF相互作用.免疫共沉淀和蛋白质印迹实验进一步验证了GIF与Rab3a在哺乳动物细胞中可以相互作用; 而且, Rab3a是以GTP结合形式(GTP-Rab3a)与GIF发生相互作用.     

神经生长抑制因子相互作用蛋白的分子克隆、鉴定及其生物学特性

为了探讨神经生长抑制因子(Neuronal growth inhibitory factor,GIF)与Alzheimer’s病(Alzheimer’s disease,AD)的关系,将GIF的cDNA全基因克隆到载体pHyblex中,运用酵母双杂交系统从Alzheimer’s病人脑cDNA文库中筛选出与GIF相互作用蛋白的cDNA克隆。免疫共沉淀和蛋白质印迹实验进一步验证了该蛋白在体内与GIF相互作用的特异性。克隆并鉴定了其中1个与GIF特异性结合的蛋白,与人细胞核dUTP焦磷酸酶(DUT)同源。进一步构建了重组表达质粒pGEX-4T-1／DUT,转化大肠杆菌BL21,经谷胱甘肽-Sepharose 4B亲和层析、凝血酶酶切和Sephacryl S100纯化,得到纯度95％以上的dUTPase蛋白。体外生物学活性检测表明,表达的dUTPase蛋白可以与GIF共同作用嗜铬细胞瘤株(pheochromocytoma)PC12,对细胞的生长产生抑制作用。     

Deafl的功能结构域分析和预测

目的分析转录因子Deafl的功能结构域并预测其功能。方法利用现有的数据库和软件对Deafl的转录因子结构域,核定位信号及和输出信号进行分析和预测。结果Deafl含有一个保守的SAND结构域及一个能介导蛋白质一蛋白质相互作用的MYND结构域;有核定位信号和核输出信号;在其N端还有一个富含丙氨酸结构域。结论Deafl除有典型转录因子必需的功能结构域之外,可能还有不止一个结构域能介导与其它蛋白质因子的相互作用,这对Deafl调控外周组织抗原表达至关重要。     

OMgp不同结构域在抑制神经突起生长中的作用

OMgp(oligodendrocyte-myelin glycoprotein)是一种在中枢神经系统表达的GPI连接的糖蛋白。最新发现,它具有诱使生长锥溃变和抑制神经突起再生的作用,这一作用是通过与nogo-66等神经再生抑制因子竞争结合同一受体NgR而实现的。但其相互作用的确切部位尚不能肯定。利用GST融合蛋白表达系统,分段表达了含有不同OMgp结构域的片段,对其与NgR作用的结构域进行了研究。结果表明,在OMgp与NgR的黏附结合过程中,OMgp的亮氨酸富含重复序列结构域是必需的,只有含该结构域的OMgp蛋白片段才能黏附表达有NgR的CHO细胞,并抑制神经突起的生长;在体外,含有丝／苏氨酸富含重复序列结构域的OMgp蛋白片段虽然具有微弱的沉降NgR的功能,但并不能抑制神经突起的生长。该结果将有助于中枢神经系统损伤后神经再生的理论与治疗研究。     

G-蛋白 Rab3a 对神经生长抑制因子 (GIF) 抑制神经元细胞生长作用的影响

为了深入研究 Rab3a 和神经生长抑制因子 (GIF) 的相互作用,在大鼠海马神经元细胞原代培养体系中,用 MTT 还原法定量研究了 Rab3a 对 GIF 神经生长活性的影响,发现 Rab3a 可以替代脑提取物而使 GIF 发挥神经生长抑制活性 . 接着又利用多克隆抗体方法研究了 GIF 与 Rab3a 的相互作用,结果说明 Rab3a 是 GIF 发挥神经生长抑制活性所必需的蛋白质,并且它们的相互作用受空间位置的因素影响较大 . 在随后对它们相互作用的机理和可能的生物学意义进行了讨论 .