三种结核分枝杆菌检测方法的比较

目的:比较三种结核分枝杆菌检测方法的阳性检出率,并且评价其检测成本等因素,为基层医院快速、准确诊断结核病提供科学依据。方法:对学院附属医院2010---2012年确诊为肺结核病的98例患者标本用抗酸染色涂片法、血清学胶体金法以及聚合酶联链式反应(PCR)分别进行检测。结果:三种检测方法的阳性率分别为:17.3%,76.5%和79.5%。结论:综合三种方法的优缺点,建议基层医院联合使用抗酸涂片染色法和血清学胶体金法进行结核分枝杆菌的检测。     

16S DNA用于结核性胸膜炎的快速诊断

目的建立聚合酶链反应—毛细管电泳（PCR-CE）的方法直接检测结核性胸膜炎患者胸水中的结核分枝杆菌,以达到快速诊断结核性胸膜炎的目的。方法在大连市结核病医院收集2006年11月至2007年2月结核性胸膜炎患者的胸水120份,所有标本都经过结核分枝杆菌抗酸染色镜检和结合菌培养,其中115份为阴性标本,5份为阳性标本。利用16S DNA集保守性和变异性于一体的特点,设计合成通用引物G1：5′-FAM-GGC GGACGG GTG AGTAA-3′,G2：5′-ROX-GGA CTG CTG CCTCCC GTA G-3′,然后将标本进行DNA提取并进行PCR扩增,扩增产物用限制性内切酶HaeⅢ消化,用毛细管电泳来检测结核分枝杆菌。结果115份阴性标本中检测出结核分枝杆菌的有19份,未检测出结核分枝杆菌的有96份,其阳性率为16.52%;5份阳性标本中检测出结核分枝杆菌的有5份,阳性率为100%。结论PCR-CE方法检测结核分枝杆菌具有快速、准确、灵敏的特点,可用于结核性胸膜炎的快速诊断。     

结核分枝杆菌重组38kD蛋白用于新疆南疆维吾尔族和湖南湘中汉族血清学诊断的研究

目的：对结核分枝杆菌38kD蛋白编码基因进行克隆表达及纯化,建立基于重组38kD蛋白的酶联免疫吸附法（EusA）检测结核病人血清标本,评价重组38kD蛋白用于结核病血清学诊断抗原的价值。并比较分析其在汉族和维吾尔族人群中的血清学诊断的差异。方法：用PCR方法扩增38kD蛋白的编码基因,构建重组质粒,转化到大肠杆菌BL21中,经IPTG诱导表达,得到纯化的38kD蛋白,建立以38kD蛋白为包被抗原的ELISA,并检测临床确诊的结核病人血清标本。结果：ELISA检测结核病患者血清标本的维吾尔族阳性率为34％（52／153）,汉族为52．4％（65／124）,两者对比有统计学差异（x2=9．538,P〈O．005）。在阴性对照中的维吾尔族特异度为96．4％（159／165）,汉族为98．8％（130／133）,结果无统计学意义（x2=0．111,P〉0．5）。结论：重组38kD蛋白用于血清学诊断的敏感度在维吾尔族和汉族中有差异,而其诊断特异度无差别。     

逆转录-聚合酶螺旋反应检测结核分枝杆菌的应用

目的:建立并应用逆转录-聚合酶螺旋反应(RT-PSR)快速检测结核分枝杆菌(MTB)。方法:针对结核分枝杆菌16S rRNA基因设计特异性引物,通过反应条件的优化初步建立结核分枝杆菌的RT-PSR扩增方法;随后,用2株结核分枝杆菌和11株其他致病菌进行RT-PSR、RT-LAMP和荧光定量PCR法的特异性与敏感性试验;利用RT-PSR法、罗氏培养法、RT-LAMP法和荧光定量PCR法对83名结核病患者的痰液标本进行诊断对比。结果:成功建立并优化了MTB的RT-PSR检测方法,与RT-LAMP法相比,两者特异性均为100%;RT-PSR法的检测灵敏性为1 CFU/mL,为荧光定量PCR法的10倍,且检测下限可达0.1 pg/μL;临床患者痰液样本检测结果表明,与罗氏培养法相比,RT-PSR法和RT-LAMP法的阳性率分别为98.80%(P0.05)和96.39%(P0.05),差异均具有统计学意义。结论:与传统检测法相比,RT-PSR法对于诊断临床样本中的MTB具有良好的特异性和敏感性,适合基层医疗单位防治MTB的推广和应用。     

应用基因芯片快速检测分枝杆菌

目的:将临床疑似分枝杆菌感染患者的标本用基因芯片方法进行分枝杆菌菌种鉴定,并将基因芯片检测的结果与传统的抗酸染色方法进行对比。方法:采用基因芯片PCR扩增、分子杂交、微阵列芯片扫描的方法检测379例临床疑似标本。结果:基因芯片阳性检出率为16.3%(62/379),涂片抗酸染色法阳性检出率为15.3%(58/379),两者差异无统计学意义(χ2=0.16,P>0.05);62例基因芯片检测阳性患者中有52例为结核分枝杆菌,另有10例为非结核分枝杆菌(其中3例偶然分枝杆菌,1例龟/脓肿分枝杆菌,1例堪萨斯分枝杆菌,4例浅黄分枝杆菌,1例海分枝杆菌)。结论:结合临床病例分析结果显示,基因芯片检测对鉴别结核分枝杆菌和非结核分枝杆菌分型具有快速、特异性高的特点,在分枝杆菌感染的早期诊断和治疗上具有重要的临床价值,值得推广和应用。     

猕猴结核分枝杆菌PCR检测方法的建立与初步应用

目的建立猕猴结核分枝杆菌PCR快速检测方法。方法根据GenBank中报道的人型结核分枝杆菌标准株H37RV全基因序列,针对其中致病性结核分枝杆菌所特有的保守区域ESAT-6设计一对引物进行TouchdownPCR反应,利用此方法对100份野生来源猕猴全血标本进行检测,并与传统的PPD实验和咽拭子抗酸染色实验结果作比对。结果抽取33份野生来源猕猴的外周血,提取DNA进行扩增,扩增片段经纯化、回收克隆测序后用BLAST软件进行同源性对比,与GenBank中报道的序列基本相同,检测标本中有4份（4／33）为阳性,其中3份（3／33）标本与结核菌素试验和咽拭子抗酸染色试验结果相符合。结论建立了从猴全血中直接检测猴结核分枝杆菌DNA的TouchdownPCR方法,具有敏感性和特异性高,且简便的优点。     

孕妇尿液人巨细胞病毒DNA筛查及血液HCMV抗体测定的对照研究

目的对于孕妇尿液进行HCMV—DNA筛查,减少和有效地避免胎儿及新生儿的HCMV感染。HCMV．DNA筛查同时进行HCMV抗体检测,明确诊断HCMV感染的灵敏、准确方法。方法应用荧光定量PCR（FQ．PCR）方法进行尿液HCMV-DNA测定。血液HCMV IgM、IgG抗体检测应用酶联免疫（ELISA）方法。结果筛查6568例孕妇尿HCMV．DNA,阳性273例,阳性率为4．2％。孕妇在12—20周者,阳性率为10．3％;孕妇在21～30周者,阳性率为33．3％;孕妇在31～39周者,阳性率为56．4％。在273例尿液HCMV—DNA阳性者中,56例同时进行血液HCMV IgM、IgG抗体检测,Igi抗体阳性者2例,IgG抗体阳性者22例。结论在孕妇HCMV感染的筛查与诊断中FQ．PCR是灵敏准确的方法。孕妇中HCMV—DNA筛查是保证母婴健康,提高人口素质的保障。     

应用PCR技术检测结核分枝杆菌的临床分析

采用聚合酶链反应（Ｐｏｌｙｍｅｒａｎｓｅ Ｃｈｉａｎ Ｒｅａｔｉｏｎ,即ＰＣＲ）技术检测结核分枝杆菌Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ,一年多来共检测了１００例结核（肺、肾结核）患者的痰和尿液标本,结果ＰＣＲ检出阳性率为８１％,对照用储菌涂片抗酸染色法,阳性率为５８％,用常规培养法阳性率为２０％。而对５０例非结核患者的痰和尿液标本的检测,ＰＣＲ法仍有６％的阳性率,而用涂片或常规培     

副结核荧光PCR试剂盒研制与应用

采用TaqMan荧光标记探针技术原理, 建立副结核分枝杆菌特异的实时荧光PCR快速检测鉴定方法并组装形成临床诊断试剂盒。试剂盒提供荧光PCR与样品核酸提取试剂, 检测全程包括样品处理可在1 d内完成。特异性试验结果表明, 试剂盒对8株副结核分枝杆菌标准菌株的检测均呈典型阳性反应, 对牛分枝杆菌、结核分枝杆菌等其它12种分枝杆菌标准菌株以及大肠杆菌、肺炎链球菌等多种常见微生物均呈阴性反应。试剂盒检测灵敏度可达单个菌细胞、15个基因拷贝, 比常规PCR检测灵敏度提高100倍。对每份添加50~100个菌细胞的20份阴性牛奶样品进行检测, 均呈阳性反应。重复性试验结果显示, 试剂盒组内变异系数为1.41%, 组间变异系数为2.42%。采用所研制的副结核分枝杆菌荧光PCR试剂盒对来自广东地区7个奶牛场的250份牛奶样品和粪便样品、来自10个养猪场的143份猪血清样品, 以及3批次进口食蟹猴共100份血清样品进行检测, 检出牛奶样品中副结核分枝杆菌阳性率为7.7%, 牛粪样品中阳性率为3.7%, 猪血清样品中阳性率为8.2%, 进口猴血清样品中阳性率为3.0%。     

PCR法快速检测临床标本中结核杆菌DNA

应用聚合酶链反应（ＰＣＲ）快速检测临床标本（脑脊液、胸水、腹水、血、痰液）中的结核杆菌ＤＮＡ,特异性扩增片段１２３ｂｐ,为结核杆菌的特异性重复序列ＩＳ６１１０部分基因。ＰＣＲ检测人型结核杆菌的敏感性达１０ｆｇＤＮＡ。临床标本的ＰＣＲ检测阳性率（２３．３％）明显高于抗酸染色涂片（２．９％）和细菌培养（５．７％）的阳性率（Ｐ〈０．０５）。通过设立对照系统及对扩增产物酶切分析,表明该法无假阴性结果（特异     

一期梅毒实验室诊断差异性研究

目的通过梅毒螺旋体初筛试验、确认试验和鉴别诊断试验,探讨一期梅毒实验室诊断差异性,最大限度减少漏诊与误诊,为深入研发新型早期梅毒诊断试剂奠定基础。方法依据2000年中国卫生部防疫司颁布的性病诊断标准,临床筛选一期梅毒患者86例（研究组）和非梅毒患者100例（对照组）,对患者血清进行甲苯胺红不加热血清试验（TRUST）初筛和梅毒螺旋体明胶颗粒凝集试验（TPPA）确认。筛选临床体征、TRUST法和TPPA法三者结果有差异的患者进一步鉴别诊断,鉴别诊断主要应用荧光定量PCR（FQ-PCR）法、免疫PCR法与自身抗体检测等试验。结果初筛TRUST法灵敏度和特异性分别为62．8％、93．0％;确认TPPA法灵敏度与特异性分别为66．3％、100％。TRUST法和TPPA法两者结果差异占12．8％;临床体征诊断、TRUST法和TPPA法三者结果差异占41．9％。TPPA法与TRUST法两者均阴性的一期梅毒患者中,FQ-PCR阳性率达88．0％,免疫PCR阳性率占40．0％。TPPA法阳性、TRUST法阴性的一期梅毒患者免疫PCR法与TPPA法结果一致;TPPA法阴性、TRUST法阳性11例患者中结核抗体阳性2例,类风湿因子阳性3例与抗Sm抗体结果阳性6例。结论一期梅毒患者实验室诊断结果差异性较大,漏诊与误诊的比例较高,有待研发新型的诊断试剂和提高诊断水平。     

痰涂片标本用于结核分枝杆菌耐药性检测的研究

目的 研究抗酸染色结核分枝杆菌(简称结核杆菌)阳性痰涂片标本直接用于耐药性检测的方法。方法 对18株临床分离培养的结核杆菌用利福平进行药敏试验。分别提取菌株DNA和与之对应的痰涂片标本的菌体DNA,用聚合酶链反应(PcR)扩增ropB基因后进行固相杂交和核酸测序检测结核杆菌的耐药性。结果 18株结核杆菌中有12株对利福平耐药。经PCR扩增的ropB片段与探针杂交后,敏感菌株未发现rpoB基因的突变,自耐药菌株提取的DNA中rpoB突变体的检出率为100％(12／12),痰涂片提取DNA的检出率为91．7％(11／12)。所有耐药菌株DNA与痰涂片DNA核酸测序结果相吻合,都有rpoB基因核心区域碱基突变。结论 抗酸染色痰涂片阳性标本可直接用于检测结核杆菌利福平耐药基因rpoB突变体,是一种值得临床实验室推广使用的耐药菌诊断方法。     

结核感染T细胞斑点试验对肺外结核诊断价值探讨

目的评价结核感染T细胞斑点试验（T—SPOT．TB）在肺外结核中的诊断价值。方法采用T—SPOT．TB试剂盒对疑诊或待排结核患者外周血中特异性T淋巴细胞进行检测。结果结核感染T细胞斑点试验的对结核病的敏感度、特异度分别为76．7％、84．3％。肺外结核组与肺结核组阳性率分别为92．0％和78．2％,差异有统计学意义（P〈0．05）。该数据显著高于结核菌素试验的31．4％和结核分枝杆菌培养的19．3％,差异有统计学意义（P〈0．05）。结论结核感染T细胞斑点试验是诊断肺外结核的快速敏感方法,值得在临床中推广使用。     

实时荧光聚合酶链反应检测性病患者泌尿生殖道沙眼衣原体的临床分析

采用实时荧光聚合酶链反应（PCR ）检测性病患者泌尿生殖道沙眼衣原体,进行临床和实验室分析。采集380例男女性病患者泌尿生殖道分泌物,进行多形核白细胞数检测和荧光PCR。结果显示,216例男性患者中,尿道多形核白细胞数≥5个者占92．59％,荧光PCR检测沙眼衣原体阳性62例,阳性率为28．70％;沙眼衣原体合并淋病奈瑟菌感染30例,合并感染率为13．89％。164例女性患者中,87例宫颈管内多形核白细胞数≥10个（占53．05％）,荧光PCR检测沙眼衣原体阳性33例（占20．12％）。结果提示,性病门诊开展实时荧光PCR检测沙眼衣原体可提高检测阳性率和控制沙眼衣原体传播。     

复治肺结核患者结核分枝杆菌L型培养结果分析

目的：了解复治肺结核患者的结核分枝杆菌L型培养情况,探讨结核分枝杆菌L型阳性与耐多药的关系。方法：选择180例肺结核患者的痰标本进行结核分枝杆菌培养和结核分枝杆菌L型培养,同时对110例复治组中培养阳性的标本行耐药监测。结果：复治组的L型阳性率为43．6％,初治组的L型阳性率为15．7％,复治组显著高于初治组（P〈0．01）;菌阳复治组的L型阳性率50％,菌阴复治组的L型阳性率39．4％,菌阳组明显高于菌阴组（P〈0．05）;L型菌阳性患者的耐药率显著高于L型菌阴性组（P〈0．05）。结论：结核分枝杆菌L型阳性是引起结核病复发、耐药的重要原因;MDR-TB与结核分枝杆菌L型感染有关。     

纳米磁珠偶联CFP-10特异性单抗富集结核分枝杆菌方法的建立

目的:初步建立基于纳米磁珠偶联培养滤液蛋白10(CFP-10)特异性单抗富集结核分枝杆菌的方法。方法:大肠杆菌表达CFP-10抗原,采用鼠杂交瘤技术制备相应的CFP-10单抗,用NHS修饰的纳米磁珠偶联单抗,用以捕获结核分枝杆菌并进行抗酸染色检测。结果:制备的CFP-10单抗效价为1∶640000;免疫荧光检测显示CFP-10抗体偶联到磁珠上,抗酸染色验证了磁珠偶联的单抗能有效地捕获富集结核分枝杆菌。结论:建立了纳米磁珠偶联CFP-10特异性单抗有效捕获富集结核分枝杆菌的方法,为提高抗酸染色方法的阳性检出率奠定了基础。     

金胺O荧光染色在石蜡组织切片麻风病诊断中的应用

目的为了验证金胺O荧光染色法应用于石蜡组织切片麻风杆菌检测的可行性。方法用金胺O荧光法对6例确诊为麻风病的病理组织切片进行染色,并与抗酸染色结果进行对比。结果荧光染色法6例结果均为阳性,在暗背景下麻风杆菌显示明亮淡绿色荧光;在菌量较少荧光染色片中寻找单根麻风杆菌,较抗酸染色片更为容易。结论金胺O荧光染色法可用于石蜡组织切片麻风病的诊断,麻风杆菌单根散在时比抗酸染色法有一定优势。     

PCR方法检测淋巴结组织中结核菌L型的研究

用聚合酶链反应技术（ＰＣＲ），改良抗酸染色（ＩＫＳ）和结核菌抗体免疫组化染色（ＩＨＣ）三种方法检测６０例淋巴结组织中结核菌Ｌ型感染情况，以病理检查结果分为结核组（１３例），淋巴结非特异性炎症组（３０例）和淋巴结对照组（１７例）。各组三种方法检测阳性率分别为：ＰＣＲ８４．６％（１１／１３），６０％（１８／３０）．２３．５％（４／１７）．ｌＫＳ７６．３％（１０／１３），６６．７％（２０／３０）；１７．６％（３／１７）；ＩＨＣ８４．６％（１１／１３），６３．３％（１９／３０），１１．８％（２／１７）。三者均为阳性者为８０％。结果表明淋巴结非特异性炎症组感染率与结核组相似，与对照组间有显著性差异（Ｐ＜０．０５）。提示：结核菌Ｌ型可能是引起淋巴结非特异性炎症的致病因子之一，ＰＣＲ技术在淋巴结非特异性炎症的病原学诊断上具有重要价值。     

结核分枝杆菌/利福平耐药实时荧光定量核酸扩增检测技术对肺外结核性脓肿的诊断价值分析

摘要 目的：探讨结核分枝杆菌/利福平耐药实时荧光定量核酸扩增检测技术（Xpert MTB/RIF）对肺外结核性脓肿的诊断价值。方法：收集2020年1月至2021年12月无锡市第五人民医院住院的122例高度疑似肺外结核性脓肿患者为研究对象,在超声引导下对脓肿病灶进行针吸穿刺活检,脓液标本分别进行Xpert MTB/RIF检测、结核杆菌脱氧核糖核酸（TB-DNA）检测、MGIT 960培养以及涂片抗酸染色。以临床综合诊断作为参考标准,比较Xpert MTB/RIF检测、TB-DNA检测、MGIT 960培养以及涂片抗酸染色四种方法对肺外结核性脓肿的诊断效能。对比Xpert MTB/RIF检测和MGIT 960药敏试验对利福平的耐药性。观察各类肺外结核性脓肿患者的诊断延迟时间。结果：122例疑似患者中,最终确诊肺外结核性脓肿患者73例,非结核性脓肿者49例。Xpert MTB/RIF检测、MGIT 960培养、TB-DNA检测以及涂片抗酸染色四种方法在肺外结核性脓肿标本中的阳性检出率结果分别为89.04%、20.55%、58.90%、36.99%,四种方法的阳性检出率整体比较差异有统计学意义（P<0.01）,Xpert MTB/RIF检测的阳性检出率明显高于MGIT 960培养、TB-DNA检测以及涂片抗酸染色法,差异均有统计学意义（P<0.05）。以临床综合诊断作为参考标准,Xpert MTB/RIF检测诊断肺外结核性脓肿者的临床诊断价值最高,其敏感度、特异度、阳性预测值、阴性预测值分别为89.04%、100.00%、100.00%、85.96%。Xpert MTB/RIF检测与MGIT 960药敏试验对利福平耐药率之间差异无统计学意义（P>0.05）。肺外结核性脓肿诊断存在明显延迟,尤其以关节结核性脓肿诊断延迟时间最长,平均为103.5天;但在结核性脓胸患者中诊断延迟时间最短,平均为7.6天。结论：与MGIT 960培养、TB-DNA检测以及涂片抗酸染色比较,Xpert MTB/RIF在肺外结核性脓肿中的阳性检出率较高,临床诊断价值最佳,表明其可用作为疑似结核性脓肿患者的快速诊断工具,同时在结核耐药性方面亦可以做到快速筛查。     

3种检测分枝杆菌方法的比较及应用价值分析

目的:比较并评价涂片抗酸染色法(涂片法)、L-J培养法和基因芯片法在分枝杆菌检测中的应用价值。方法:对241例需查抗酸杆菌的临床标本,采用涂片法、L-J培养法和基因芯片法检测分枝杆菌,3种方法检测结果存在分歧的标本再进行DNA测序,以培养鉴定结果阳性或DNA测序得到分枝杆菌序列为确诊标准。结果:241例标本,涂片法、L-J培养法和基因芯片法的检测阳性率依次为18.7%、12.0%、15.8%,经卡方检验三者阳性率的差异没有统计学意义(P0.05);检测灵敏度依次为85.4%、70.7%、93.0%,经卡方检验三种方法的灵敏度总体来说有差别(χ2=7.24,P0.05),涂片法与L-J培养法以及涂片法与基因芯片法的灵敏度差异没有统计学差异,基因芯片法的灵敏度高于涂片法(χ2=6.61,P0.05);检测特异性依次为95.6%、100.0%、100.0%。38例基因芯片检测阳性患者中有28例为结核分枝杆菌,10例为非结核分枝杆菌。结论:与涂片法及培养法相比较,基因芯片法能够鉴别分枝杆菌菌种,同时具有快速、可靠、准确度高的特点,在分枝杆菌感染的早期诊断和抗菌治疗上具有重要的临床价值。