中华蜜蜂化学感受蛋白基因Acer-CSP1克隆与表达特征分析

化学感受蛋白(chemosensory proteins, CSPs)是昆虫化学感受系统中重要的组成部分之一。本研究克隆了中华蜜蜂Apis cerana cerana化学感受蛋白基因Acer-CSP1, 其核苷酸全长351 bp （GenBank登录号为FJ157352）, 编码116个氨基酸残基, 预测蛋白分子量为13.85 kD, 等电点为4.89, 且含有4个保守的半胱氨酸残基, 均符合昆虫CSPs的一般特征, 且与意蜂CSP1基因具有99.1%的相似性, 与其他昆虫也有45.3%~68.0%的相似性。利用2^-ΔΔCt法及绝对定量法的real-time PCR技术对Acer-CSP1在中蜂不同器官表达特征进行了研究, 得出的一致结论为Acer-CSP1显著水平地高丰度表达于中华蜜蜂触角, 其次大量表达于头部。由于触角为中华蜜蜂最主要的嗅觉器官, 而头部则具有发达的感觉神经系统和味觉系统, 这也提示Acer-CSP1极有可能参与中华蜜蜂的嗅觉以及其他化学感受功能。     

棉花粉蚧热休克蛋白基因的鉴定

热休克蛋白(heat shock proteins,Hsps)是生物体或细胞受到热胁迫后新合成的一类遗传上高度保守的蛋白,在昆虫应对外界环境因子胁迫时起着重要作用。为了系统研究棉花粉蚧Phenacoccus solenopsis Hsp基因家族,对棉花粉蚧转录组基因注释信息进行分析、获得目标序列,并应用NCBI上Blast X等软件进行比对、共鉴定出24条热激蛋白(Hsp)基因,包括3个Hsp90、8个Hsp70、2个Hsp60和11个s Hsp(small heat shock protein,s Hsp)基因。对棉花粉蚧与模式昆虫家蚕Bombyx mori、黑腹果蝇Drosophila melanogaster、赤拟谷盗Tribolium castaneum系统进化关系分析显示,昆虫的小分子量热休克蛋白s Hsp具有很强的种属特异性,Hsp70家族的保守性比s Hsp强。棉花粉蚧热激蛋白基因的鉴定为深入研究该虫Hsp与生长发育、抗逆境的相互关系奠定了基础。     

温度胁迫下棉花粉蚧热激蛋白基因的表达分析

【目的】为了研究热激蛋白 Hsp70, Hsp70-4和Hsp90在棉花粉蚧Phenacoccus solenopsis抵抗逆温中的作用。【方法】在测序棉花粉蚧转录组的基础上,分析了该虫热激蛋白Hsp70基因家族的2个序列［Pshsp70（GenBank登录号为KJ909505）和Pshsp70-4（GenBank登录号为KJ909506）］和Hsp90基因家族的1个序列,［Pshsp90(GenBank登录号为KJ909507)］,采用实时荧光定量 PCR（RT-qPCR）检测了在不同温度（18和32℃恒温, 37, 39, 41, 43和45℃热激1 h 后26℃恢复1 h)下棉花粉蚧不同发育阶段（2龄若虫、3龄若虫、雌成虫）3种热激蛋白基因的表达量。【结果】Pshsp70 cDNA序列包含1 923 bp的开放阅读框,编码641个氨基酸,理论分子量和等电点分别为70.9 kDa和5.65; Pshsp70-4 cDNA序列包含1 962 bp的开放阅读框,编码654个氨基酸,理论分子量和等电点分别为71.8 kDa和5.38;Pshsp90 cDNA序列包含2 172 bp的开放阅读框,编码724个氨基酸,理论分子量和等电点分别为83.5 kDa和4.93。Pshsp70 和Pshsp70-4均含有Hsp70基因家族高度保守的基序,Pshsp70编码的氨基酸序列与烟粉虱Bemisia tabaci和家蚕Bombyx mori等昆虫的Hsp70 的氨基酸序列一致性为 85%;Pshsp70-4编码的氨基酸序列与白蜡蚧Ericerus pela和点蜂缘蝽Riptortus pedestris等昆虫的Hsp70的氨基酸序列一致性高达95%;Pshsp90也含有Hsp90基因家族高度保守的基序,Pshsp90编码的氨基酸序列与赤拟谷盗Tribolium castaneum和东亚小花蝽Orius sauteri等昆虫的Hsp90 的氨基酸序列一致性为 87%。热激蛋白基因表达量分析结果表明,在18℃恒温条件下,粉蚧2龄若虫的3个PsHsps基因的mRNA相对表达量均比对照(26℃)低,在32℃恒温条件下,各龄期的Hsp70基因的相对表达量均显著高于对照。在37~45℃下热激1 h并在26℃下恢复1 h,棉花粉蚧3个龄期的3个热激蛋白PsHsps基因的相对表达量随温度的升高总体呈增加趋势,相关性分析表明,除Pshsp70-4在雌成虫中的表达量与热胁迫温度的相关系数为0.225外,各龄期中3个基因的表达量与温度的相关系数均大于0.6,显著相关;43℃和45℃胁迫下,各龄期的3个热激蛋白基因相对表达量均显著高于对照组（P<0.05）。【结论】棉花粉蚧热激蛋白基因的表达与温度呈正相关,在该虫应对高温中起着重要作用。     

梨小食心虫化学感受蛋白cDNA的克隆、序列分析及原核表达

为了研究梨小食心虫Grapholita molesta化学感受蛋白（chemosensory proteins, CSPs）在化学感受系统中的作用, 本研究利用RT-PCR和RACE技术克隆到一条梨小食心虫化学感受蛋白的全长cDNA序列, 命名为GmolCSP （GenBank 登录号： JQ821389）。序列分析表明, GmolCSP开放阅读框序列为384 bp, 编码127个氨基酸残基, 预测N末端含有18个氨基酸组成的信号肽序列, 其成熟蛋白的预测分子量为12.80 kD, 等电点为8.33。该基因编码的氨基酸序列与其他鳞翅目昆虫化学感受蛋白的氨基酸序列具有较高同源性。RT-PCR结果显示, GmolCSP在梨小食心虫成虫触角、 去触角的头、 胸、 腹、 足和翅中都有表达。将GmolCSP重组到表达载体pET-32a中, 转入大肠杆菌Escherichia coli BL21（DE3）进行表达。SDS-PAGE和Western 印迹检测结果显示, 梨小食心虫化学感受蛋白基因在大肠杆菌中成功地表达出一个分子量约为29 kD的融合蛋白, 与预测的融合蛋白分子量大小一致。本研究结果为进一步研究该蛋白的分子结构和功能奠定了良好基础。     

西花蓟马化学感受蛋白的cDNA克隆、时空表达分析及组织定位

【目的】研究西花蓟马Frankliniella occidentalis化学感受蛋白(chemosensory proteins,CSPs)在其嗅觉及化学感受系统中的作用。【方法】利用RT-PCR和RACE技术克隆西花蓟马化学感受蛋白基因,用DNAMAN软件进行序列分析,使用BLAST进行同源性比较,采用MEGA6的Neighbor-joining法构建了进化树。通过实时定量PCR(real-time quantitative PCR,qRT-PCR)检测了西花蓟马不同发育期以及成虫不同组织(触角、头、足、胸、腹)中该基因的表达谱。免疫新西兰大白兔制备了Focc CSP1蛋白抗体,与样品切片中Focc CSP1蛋白以及10 nm胶体金颗粒偶联的羊抗兔二抗反应,经透射电镜观察,对该蛋白在西花蓟马成虫组织中进行免疫定位。【结果】克隆并鉴定了一个西花蓟马化学感受蛋白基因,命名为Focc CSP1(Gen Bank登录号:KM527949)。该基因c DNA序列全长597 bp,完整开放阅读框(ORF)288 bp,编码95个氨基酸,成熟蛋白分子量11.377 k D,等电点4.72,具有化学感受蛋白典型的4个保守半胱氨酸位点特征。Focc CSP1与东亚飞蝗Locusta migratoria Lmig CSP(Gen Bank登录号:CAJ01476.1)的氨基酸序列一致性最高,进化关系最近。Focc CSP1在西花蓟马不同发育阶段和成虫不同组织中均有表达,在羽化1 d的雌虫中相对表达量最高,其次是2龄若虫,蛹和成虫后期表达量最低;在触角和足中相对表达量较高。成功构建了重组表达质粒p ET-30a/Focc CSP1,并诱导表达,经Ni柱纯化,获得目的蛋白;免疫定位表明,该蛋白在西花蓟马触角、足、头等部位血淋巴中均大量存在。【结论】明确了西花蓟马化学感受蛋白基因Focc CSP1的核苷酸、氨基酸序列特征。Focc CSP1广泛分布在西花蓟马多个组织及各个发育期,据此推测该基因可能在西花蓟马嗅觉识别、感受机械刺激以及调节生长发育等方面扮演重要角色。     

棉花Lea蛋白D-113基因启动子的克隆及序列分析

为研究植物Lea(late embryogenesis abundant）蛋白基因启动子在种子中的特异性表达,通过PCR扩增,从棉花（Gossypium hirsutum cv.Coker312）中克隆了Lea蛋白基因家庭中D-113基因上游1024bp的调控序列。DNA序列分析结果表明,该片段与已报道的Lea蛋白基因同一家庭该基因的对应序列同源性达90%以上。将将启动子序列与GUS基因融合,构建成表达载体后,通过基因抢轰击导入到经ABA诱导处理的棉花胚性愈伤组织和油菜种子以及棉花的根、茎、叶中,组织化学分析结果表明,D-113基因启动子在胚中特异性表达。     

小菜蛾化学感受蛋白基因PxylCSP1的克隆和表达

利用RT-PCR和RACE技术克隆到小菜蛾Plutella xylostella 化学感受蛋白（CSP）基因PxylCSP1（GenBank登录号: FJ361903）,其核苷酸序列全长405 bp,编码134个氨基酸残基,预测N-末端包含19个氨基酸组成的信号肽序列,估测其成熟蛋白分子量为13.56 kD,等电点为6.12。该基因编码氨基酸序列和其他鳞翅目昆虫CSP的氨基酸序列比对同源性较高（70%~80%）。RT-PCR结果表明PxylCSP1不仅存在于小菜蛾的触角中,还存在于头、足、腹和翅中。Real-time PCR结果表明PxylCSP1的表达水平因被测小菜蛾的性别、日龄、组织不同和交配与否而异。     

角倍蚜气味结合蛋白和化学感受蛋白基因的鉴定及表达谱

【目的】通过对角倍蚜Schlechtendalia chinensis气味结合蛋白(odorant-binding proteins, OBPs)和化学感受蛋白(chemosensory proteins, CSPs)基因进行鉴定和表达谱分析,为研究OBPs和CSPs在角倍蚜嗅觉感知中的功能提供理论依据。【方法】基于角倍蚜基因组和不同发育阶段转录组数据,通过生物信息学方法鉴定和筛选角倍蚜OBPs和CSPs的基因序列;利用邻接法对角倍蚜与其他半翅目昆虫OBPs和CSPs的氨基酸序列进行系统发育分析;根据角倍蚜OBP和CSP基因在不同发育阶段(干雌、干母、春迁蚜、秋迁蚜、越冬若蚜、雌性蚜和雄性蚜)转录组数据中的TPM(tags per million)值进行表达丰度分析,结合qRT-PCR方法检测角倍蚜OBP和CSP基因在不同发育阶段的相对表达量。【结果】从角倍蚜基因组和转录组数据中鉴定出12个OBP基因(SchiOBP2-10,SchiOBP13-15)和9个CSP基因(SchiCSP1-2,SchiCSP4-10);系统发育分析发现,角倍蚜OBPs和CSPs与其他蚜虫OBPs和CSPs...     

小地老虎化学感受蛋白AipsCSP8的表达及配体结合特性分析

【目的】本研究旨在解析小地老虎Agrotis ipsilon化学感受蛋白AipsCSP8的表达谱及配体结合特征。【方法】利用qRT-PCR方法测定了AipsCSP8在小地老虎成虫头、胸、腹、足、翅、性腺(附腺)、触角、喙和下唇须以及雌雄虫羽化前后触角中的表达水平。体外重组表达AipsCSP8蛋白,通过荧光竞争结合实验测定重组蛋白AipsCSP8对24种性信息素、22种植物挥发物和10种化学农药的结合特性。【结果】qRT-PCR检测结果显示,AipsCSP8在小地老虎雄成虫的足和下唇须中表达量最高,在附腺和触角中的表达量次之;在雌成虫的触角中表达量最高,在足、性腺、下唇须中的表达量次之。另外,雄、雌虫触角中AipsCSP8表达量分别在成虫羽化前1 d和羽化当天达到顶峰。荧光竞争结合实验结果表明,重组蛋白AipsCSP8对植物挥发物邻苯二甲酸-丁酯(解离常数Ki=14.6 μmol/L)、苯乙醛(Ki=17.2 μmol/L)以及化学农药阿维菌素(Ki=12.9 μmol/L)均有较强的结合能力。【结论】化学感受蛋白AipsCSP8可能参与小地老虎嗅觉行为及味觉识别,并可能在小地老虎感受化学农药的过程中发挥作用。     

热胁迫下棉花粉蚧内参基因的筛选

【目的】筛选出热胁迫下棉花粉蚧Phenacoccus solenopsis的实时定量PCR最适内参基因。【方法】 本研究应用实时荧光定量PCR技术测定了棉花粉蚧2龄若虫、3龄若虫和雌成虫α-tub, β-tub, rpl32, GAPDH, SDHA和TBP共6个候选内参基因在7个不同温度处理（恒温18℃和 32℃, 以及37℃, 39℃, 41℃, 43℃和45℃热激处理1 h并在26℃恢复1 h）下mRNA表达水平的稳定性;应用geNorm, Bestkeeper, Normfinder和RefFinder软件分析6个基因表达的稳定性。【结果】 在不同高温胁迫下2龄若虫6个候选内参基因的稳定值M由小到大依次为α-tub（0.579）< GAPDH（0.654)< TBP（0.663）<β-tub（0.668）< rpl32（0.675）相似文献   

扶桑绵粉蚧组织蛋白酶B基因的克隆、原核表达和不同发育阶段表达分析

昆虫组织蛋白酶B在昆虫代谢过程中发挥重要作用。本研究利用RACE技术克隆了扶桑绵粉蚧Phenacoccus solenopsis Tinsley组织蛋白酶B基因的开放阅读框（ORF）序列, 命名为PsCb （GenBank登录号: JQ727999）。生物信息学分析表明, 该基因的开放阅读框包含927 bp的片段, 编码308个氨基酸。多序列比对表明, 该基因编码的蛋白在N端变异较大, 在C端保守性高。组织蛋白酶B基因的系统进化树结果表明扶桑绵粉蚧组织蛋白酶独自成为一支。原核表达电泳检测到一条大约35 kDa的目的条带, 与预测的蛋白分子量相符。组织蛋白酶B基因在扶桑绵粉蚧各个虫态均有表达, 卵期表达量相对较低, 2龄若虫期达到最高峰, 然后下降。本研究为进一步研究该基因的功能并开发出组织蛋白酶抑制剂, 从而研制出扶桑绵粉蚧杀卵剂和胚胎发育抑制剂等提供理论依据。     

外来入侵害虫棉花粉蚧雄虫生殖能力研究

采用单头雄虫与不同数量雌虫配比的方法研究了棉花粉蚧雄虫的生殖能力。结果表明,与1～7头雌虫配比,雄虫的交配成功率分别为94.4%、91.2%、85.4%、80.7%、77.7%、69.5%、66.2%;产仔雌虫数量与雌雄性比关系符合逻辑斯蒂曲线方程Ff=5.2159EXP(-2.5304EXP (-0.421739N)),1头雄虫平均可以满足4～5 头雌虫生殖需要,最多为5.22头;与单头雄虫交配后雌虫总产仔量由358.8头增大至1274.2头,其数量与雌雄性比关系符合S型增长曲线F?t=1524.589e-1.3922/N,总产仔量最大可达1525头;单雌产仔量先由358.8头上升至427.6头,其后逐渐下降至266.5头;子代性比(♀:♂)变化无规律,为1.13～1.86;子代中雌虫数量由206.1头增大到727.4头,其数量与雌雄性比关系可由F?of=840.1124e-1.2599/N描述,最大值是840头。     

扶桑绵粉蚧生物学特性研究

扶桑绵粉蚧Phenacoccus solenopsis Tinsley是近年在我国新发现的一种重要外来入侵害虫, 特别是对我国棉花生产具有潜在的巨大威胁,本文研究了实验室条件下（27±1℃, RH 70%±5%）该虫在棉花上的发育历期、 繁殖能力及各虫态的形态特征。结果表明：扶桑绵粉蚧雌虫生活史包括卵、1龄若虫、2龄若虫、3龄若虫和雌成虫;雄虫生活史包括卵、1龄若虫、 2龄若虫、预蛹、 蛹和雄成虫。卵期很短,雌虫若虫期15~20 d,总历期约为47~59 d;雄虫若虫和蛹期17~22 d,总历期约为20~26 d;雌虫寿命明显长于雄虫。该蚧虫繁殖能力强,雌成虫产卵量200~862粒/头,平均产卵458粒/头。各虫态主要形态特征为：卵呈长椭圆形,橙黄色, 略微透明; 1龄若虫,淡黄绿色,行动活泼;2龄若虫体缘突起显现, 尾瓣突出,至末期可根据体表黑斑的可见程度区分雌、 雄虫;3龄雌若虫, 体表有薄层蜡粉, 在前、中胸背面亚中区和腹部1~4节背面亚中区可见清晰斑点, 形成纵向黑色条斑, 外表形似雌成虫。雌成虫呈卵圆形,体表蜡粉厚实,胸、腹背面的黑色条斑在蜡粉覆盖下呈成对黑色斑点状,体缘蜡突明显,共18对,其中腹部末端2~3对较长; 雄虫蛹包裹于松软的白色丝茧中;雄成虫,虫体较小,黑褐色;触角细长,具一对发达透明前翅,后翅退化为平衡棒,腹部末端具2对白色长蜡丝。本文通过对扶桑绵粉蚧的基本生物学特性和各个龄期发育的形态特征的研究, 为该虫的进一步研究和科学防控提供了基本资料,具有重要的理论和实践意义。     

扶桑绵粉蚧的过冷却点和体液结冰点测定

本文测定了扶桑绵粉蚧Phenacoccus solenopsis Tinsley除卵期以外其它各虫态的过冷却点和结冰点.结果表明,该虫过冷却点以1龄若虫最低,为-24.02℃;雄虫预蛹次之,为-22.13℃;雄虫蛹、雄虫2龄若虫、雌虫3龄若虫、雄成虫、雌虫2龄若虫、雌成虫过冷却点逐渐升高,分别为-21.08℃、-20.25℃、-19.05℃、-18.42℃、-17.91℃、-16.89℃.体液结冰点也以1龄若虫最低,为-23.2℃;雄虫预蛹次之,为-19.09℃;雄虫蛹、雄虫2龄若虫、雌虫3龄若虫、雌虫2龄若虫、雌成虫、雄成虫体液结冰点逐渐升高,分别为-16.64%、-15.81℃、-13.92℃、-13.20℃、-12.85℃、-12.79℃.试验结果表明扶桑绵粉蚧过冷却点低,耐寒性较强,可能适宜在中国北部更广泛的区域生存.     

利用种特异性COI引物（SS-COI）鉴别扶桑绵粉蚧

扶桑绵粉蚧Phenacoccus solenopsis Tinsley是我国近年新发现的一种严重威胁农林业生产的重要外来入侵害虫。针对扶桑绵粉蚧与其他粉蚧类昆虫难以准确快速识别且适生区广泛的问题, 以扶桑绵粉蚧为靶标, 以我国常见的其他7种粉蚧为参照, 采用基于线粒体DNA细胞色素C氧化酶亚基Ⅰ (mtDNA COI) 基因序列的种特异性(species-specific COI, SS-COI) PCR方法, 研究其快速分子检测技术。通过已知粉蚧的COI基因序列设计通用型引物1对, 获得扶桑绵粉蚧及其他7种粉蚧包括康氏粉蚧Pseudococcus comstocki Kuwana、 南洋臀纹粉蚧Planococcus lilacius Cockerell、 木槿曼粉蚧Maconellicoccus hirsutus (Green)、 甘蔗红粉蚧Saccharicoccus sacchari (Cockerell)、 新菠萝灰粉蚧Dysmicoccus neobrevipes Beardsley、 番石榴粉蚧Planococcus minor Maskel和石蒜绵粉蚧Phenacoccus solani Ferris的COI基因序列, 根据测序结果及数据库中已知粉蚧的COI基因序列设计SS COI引物1对(PSZTF1/PSZTR1), 其扩增片段大小为546 bp。种特异性检验结果表明, 该引物只对扶桑绵粉蚧的COI基因具有扩增能力, 对其他7种粉蚧不具有扩增效果; 该引物不仅对成虫具有良好的扩增能力, 对不同虫态的扶桑绵粉蚧以及来自我国不同省市的14个地理种群和口岸截获的来自巴基斯坦的扶桑绵粉蚧亦具有同样的扩增效能。这些结果表明, 该技术体系完全可用于扶桑绵粉蚧的准确识别及其检测监测, 对有效阻截其进一步扩张蔓延意义重大。     

扶桑绵粉蚧取食为害对棉花萜类化合物释放的影响

在室内条件下采用机械损伤叶片(MW)、外源水杨酸诱导(Me SA)、扶桑绵粉蚧短期(S-MF)及长期为害(L-MF)4种方式处理棉花,对棉花植株释放的萜类化合物进行了定性与定量研究。结果表明,共有5种萜类化合物被定性检出,分别为α蒎烯、β蒎烯、长叶烯、A-柏木烯与雪松烯;扶桑绵粉蚧的取食为害显著提高了棉花α蒎烯、β蒎烯及A-柏木烯的释放量,并且新增加雪松烯与长叶烯的释放;而叶片机械损伤与外源水杨酸诱导处理在一定程度上也提高了α蒎烯、β蒎烯及A-柏木烯的释放量。本研究结果为合理利用虫害诱导植物挥发物进行扶桑绵粉蚧的生物防治提供科学依据。     

班氏跳小蜂对寄主龄期选择的研究

班氏跳小蜂Aenasiusbam bawalei Hayat是扶桑绵粉蚧Phenacoccus solenopsis Tinsley的优势种寄生蜂。本文研究了在限制选择和自由选择的条件下,扶桑绵粉蚧的2龄若虫、3龄若虫和雌成虫对该蜂的寄生率、发育历期、子代性比和个体大小的影响。结果表明:在两种选择条件下,班氏跳小蜂对扶桑绵粉蚧3龄若虫的寄生率显著高于对雌成虫和2龄若虫的寄生率,但寄生粉蚧雌成虫的子代雌雄性比显著高于寄生3龄若虫或2龄若虫的性比;在两种选择条件下,雌蜂在寄主三种虫龄(态)上的发育历期差异不显著,但是雄蜂在粉蚧雌成虫中的发育历期显著长于寄生2龄若虫或3龄若虫的发育历期;在两种选择条件下,寄生于粉蚧雌成虫的子代雌蜂和雄蜂的个体都是最大,其后足胫节长度显著长于寄生于2龄若虫或3龄若虫的子代胫节的长度。     

棉花粉蚧对木尔坦棉花曲叶病毒的获取、存留和传播风险

为明确棉花粉蚧Phenacoccus solenopsis对扶桑Hibiscus rosa-sinensis感染的木尔坦棉花曲叶病毒(CLCuMV)的传播风险,本文应用PCR方法研究了棉花粉蚧获取、存留和传播CLCuMV的规律和能力。结果表明棉花粉蚧各取食危害虫期均可获取、携带CLCuMV,获取病毒所需时间为2-48 h,虫体内病毒最多可存留312 h;但是,粉蚧体内病毒无法侵染健康扶桑,亦不会经卵或者交配进行垂直和水平传播。本研究证明了棉花粉蚧不能传播CLCuMV,为防治该虫、该病毒病提供了依据。