家蚕化学感受蛋白BmCSP4表达谱及结合特性分析

化学感受蛋白(chemosensory proteins, CSPs)是昆虫体内存在的一类主要识别和运载非挥发性的气味分子和化学刺激物的可溶性蛋白。本研究运用半定量RT-PCR方法分析了BmCSP4的时空及组织表达谱。结果表明： BmCSP4在家蚕Bombyx mori各发育阶段均表达, 但表达量从4龄到蛹期逐渐减少, 且在雌成虫头部、 胸部和腹部表达量较少。用1-NPN作为荧光探针, 测定了15种外源配基与BmCSP4蛋白的结合特性, 结果显示： 仅芳香醛类和芳香酮类化合物在浓度10 μmol/L能将1-NPN从BmCSP4中替换50%, 苯甲醛解离常数为3.20 μmol/L, 对甲氧基苯甲醛解离常数为2.24 μmol/L, 2-戊基-3-苯丙基-烯醛解离常数为2.88 μmol/L, 1-苯基-1-丁酮解离常数为2.04 μmol/L, 苯乙酮解离常数为2.52 μmol/L。据此推测, BmCSP4在不同的发育阶段执行不同的生理功能, 并可能参与对芳香醛、 芳香酮类气味识别过程。     

小地老虎化学感受蛋白AipsCSP8的表达及配体结合特性分析

【目的】本研究旨在解析小地老虎Agrotis ipsilon化学感受蛋白AipsCSP8的表达谱及配体结合特征。【方法】利用qRT-PCR方法测定了AipsCSP8在小地老虎成虫头、胸、腹、足、翅、性腺(附腺)、触角、喙和下唇须以及雌雄虫羽化前后触角中的表达水平。体外重组表达AipsCSP8蛋白,通过荧光竞争结合实验测定重组蛋白AipsCSP8对24种性信息素、22种植物挥发物和10种化学农药的结合特性。【结果】qRT-PCR检测结果显示,AipsCSP8在小地老虎雄成虫的足和下唇须中表达量最高,在附腺和触角中的表达量次之;在雌成虫的触角中表达量最高,在足、性腺、下唇须中的表达量次之。另外,雄、雌虫触角中AipsCSP8表达量分别在成虫羽化前1 d和羽化当天达到顶峰。荧光竞争结合实验结果表明,重组蛋白AipsCSP8对植物挥发物邻苯二甲酸-丁酯(解离常数Ki=14.6 μmol/L)、苯乙醛(Ki=17.2 μmol/L)以及化学农药阿维菌素(Ki=12.9 μmol/L)均有较强的结合能力。【结论】化学感受蛋白AipsCSP8可能参与小地老虎嗅觉行为及味觉识别,并可能在小地老虎感受化学农药的过程中发挥作用。     

甜菜夜蛾化学感受蛋白SexiCSP3结合特性分析

本研究构建夜蛾科昆虫化学感受蛋白系统进化树,发现化学感受蛋白在种间保守性强,并与气味结合蛋白明显分为两类。运用反转录RT-PCR方法克隆了Sexi CSP3基因,并在大肠杆菌中正确表达,重组Sexi CSP3蛋白纯化后通过荧光竞争结合实验测定其与24种外源气味分子的结合特性。结果表明:Sexi CSP3与苯甲醛、苯乙酮、2-戊基-3-苯丙基-烯醛、1-苯基-1-丁酮、对甲氧基苯甲醛的结合能力较强,解离常数为0.76、1.39、2.23、3.23和5.30μmol/L,推测Sexi CSP3可能参与了甜菜夜蛾对这5种化学物质的识别过程。     

角倍蚜气味结合蛋白和化学感受蛋白基因的鉴定及表达谱

【目的】通过对角倍蚜Schlechtendalia chinensis气味结合蛋白(odorant-binding proteins, OBPs)和化学感受蛋白(chemosensory proteins, CSPs)基因进行鉴定和表达谱分析,为研究OBPs和CSPs在角倍蚜嗅觉感知中的功能提供理论依据。【方法】基于角倍蚜基因组和不同发育阶段转录组数据,通过生物信息学方法鉴定和筛选角倍蚜OBPs和CSPs的基因序列;利用邻接法对角倍蚜与其他半翅目昆虫OBPs和CSPs的氨基酸序列进行系统发育分析;根据角倍蚜OBP和CSP基因在不同发育阶段(干雌、干母、春迁蚜、秋迁蚜、越冬若蚜、雌性蚜和雄性蚜)转录组数据中的TPM(tags per million)值进行表达丰度分析,结合qRT-PCR方法检测角倍蚜OBP和CSP基因在不同发育阶段的相对表达量。【结果】从角倍蚜基因组和转录组数据中鉴定出12个OBP基因(SchiOBP2-10,SchiOBP13-15)和9个CSP基因(SchiCSP1-2,SchiCSP4-10);系统发育分析发现,角倍蚜OBPs和CSPs与其他蚜虫OBPs和CSPs...     

豌豆蚜触角转录组化学感受蛋白的鉴定、表达和结合特性分析

[目的]本研究旨在鉴定豌豆蚜Acyrthosiphon pisum触角转录组中化学感受蛋白(chemosensory protein,CSP)基因,明确触角中高表达的豌豆蚜CSP蛋白与蚜虫报警信息素、性信息素以及植物挥发物的分子结合特性.[方法]通过对豌豆蚜成蚜触角进行转录组测序,鉴定触角中候选CSP基因;采用RPKM...     

一种新的家蚕信息素相关蛋白基因BmP218的生物信息学分析及功能预测

在进行抑制性减法杂交实验中,我们获得一条差异基因片段,EST拼接终获得了这一个654bp ORF阅读框,NCBI数据库检索未发现同源基因.但在家蚕数据库检索有同源基因存在为一种信息素相关的结合蛋白,PCR实验结果表明该基因确实在家蚕多种组织中存在转录,证明是一种新的基因,暂命名为BmP218.进一步生物信息学分析表明该定位在家蚕的第23号染色体上,有7个外显子.其同源物物有8个,虽然基因结构不同,但结构域非常相似.蛋白质分析中发现蛋白结构中包含有6个α螺旋,12个不规则卷曲,在氨基酸序列中存在有一段与昆虫细小病毒表壳蛋白类似的区域(100-183).     

梨木虱化学感受蛋白CchiCSP8与梨树挥发物的结合特性分析

【目的】梨木虱Cacopsylla chinensis是我国重要的梨树害虫。本研究通过分析梨木虱化学感受蛋白8(chemosensory protein 8, CchiCSP8)与梨树挥发物的结合特性,综合研究CchiCSP8的嗅觉功能,为今后阐释梨木虱定位梨树的嗅觉机理提供前期基础。【方法】采用PCR方法克隆CchiCSP8的全长开放阅读框序列,并对推导的氨基酸序列与其他半翅目昆虫CSPs进行同源比对和进化分析;构建pET30a(+)-CchiCSP8的原核表达载体,通过大肠杆菌Escherichia coli体外表达、组氨酸标签蛋白镍磁珠纯化技术和荧光竞争性结合实验,共测定了重组蛋白CchiCSP8与41种梨树挥发物的结合能力。随后对CchiCSP8进行同源建模和分子对接分析。【结果】克隆获得了CchiCSP8全长序列,开放阅读框全长426 bp,编码141个氨基酸,N端有一个包含21个氨基酸的信号肽。成熟的CchiCSP8蛋白的预测分子量和等电点分别为15.02 kD和9.77;与其他半翅目昆虫CSPs的序列比对发现,CchiCSP8具有4个保守的半胱氨酸位点,并与柑橘木虱Diaphorina citri化学感受蛋白DcitCSP11的进化关系最近;pET30a(+)-CchiCSP8在IPTG诱导下在大肠杆菌中成功表达,并通过镍磁珠纯化获得纯净的CchiCSP8蛋白;采用荧光竞争性结合实验分析重组蛋白CchiCSP8的结合特性,结果显示CchiCSP8对18种梨树植物挥发物具有不同程度的结合能力(Ki=14~30 μmol/L),包括4种烯烃、6种醇类、4种醛类、1种酮、1种酯类和2种芳香类物质,CchiCSP8与配体的结合力表现出了随碳原子数不同而变化的特点;分子对接结果显示CchiCSP8和每个配体之间的结合能相差不大(-4.2~6.0 kJ/mol),这与上述荧光竞争结合实验的结果一致。在CchiCSP8与不同配体结合过程中,存在多个共有氨基酸残基,其中5个非极性残基(A38, A42, L93, L99和V100)以及2个极性残基(Q107和K46)的作用最为突出。【结论】CchiCSP8能够结合18种不同类型的梨树挥发物,推测其在梨木虱识别梨树挥发物的过程起到重要作用,本研究结果可为明晰梨木虱在定位梨树过程中的嗅觉机制提供理论基础,并为开发基于扰乱嗅觉行为的新型梨木虱行为调控技术提供新思路。     

中华蜜蜂化学感受蛋白AcerCSP3的配基结合功能分析

为研究中华蜜蜂Apis cerana cerana化学感受蛋白AcerCSP3在化学感受系统中的生理功能, 本实验通过对AcerCSP3进行原核表达、分离纯化后, 利用荧光法研究了体外重组AcerCSP3与1-NPN以及候选化学配基的结合特征。Scatchard方程显示AcerCSP3与1-NPN的解离常数K_D为8.29 μmol/L, 结合位点数约等于1。在候选配基竞争1-NPN与AcerCSP3结合的实验中, 5种配基均能在200 μmol/L浓度下使1-NPN的相对荧光强度下降至50%以下, 其中β-紫罗兰酮甚至能使1-NPN的相对荧光强度下降至10%左右, 表明候选配基均与AcerCSP3有较强的结合能力, 而3, 4-二甲基苯甲醛与中蜂AcerCSP3的结合能力最强, K_D达到18.77 μmol/L。本研究所用化学配基均为植物花与叶片的挥发性的次生代谢产物, 表明AcerCSP3可能作为中蜂化学感受系统的一部分, 在其搜寻某些植物花粉蜜源时作为气味分子运载体发挥一定的作用。     

家蚕信息素结合蛋白BmPBP2和BmPBP3基因的初步鉴定及表达分析

嗅觉对昆虫的生存、繁殖等起着重要的作用。依据家蚕Bombyx mori全基因组序列设计特异引物,扩增得到了两个信息素结合蛋白BmPBP2和BmPBP3基因的cDNA片段。结合已报道的家蚕信息素结合蛋白BmPBP1和两个普通气味结合蛋白BmGOBP的信息,对其基因结构分析表明,这5个基因均由3个外显子组成,具有保守的外显子/内含子边界和典型的6个Cys残基,且3个PBP基因在基因组上串联分布。序列同源性分析表明,BmPBP2和BmPBP3与烟草天蛾的PBP2和PBP3的同源性高达69%和63%。半定量RT-PCR分析结果显示,BmPBP2和BmPBP3基因在成虫触角中特异表达,且雌雄表达水平相当。这些结果表明BmPBP2和BmPBP3可能起着性信息素识别的作用。     

家蚕保幼激素结合蛋白Bmtol基因的克隆及功能分析

家蚕头部是一个神经中枢和感受的器官,其头部含有触角和感觉毛,感受外界的信号,并将外界信号传送到大脑进行反应。保幼激素主要是由咽侧体合成和分泌的,而保幼激素结合蛋白是保幼激素转运和发挥功能的载体,在昆虫体内具有极其重要的功能。文中通过Silk DB和NCBI数据库筛选并鉴定到一个新的具有保幼激素结合蛋白家族保守结构的蛋白Bm TOL,其编码基因编号为BGIBMGA003404(Gen Bank登录号:KY681053)。利用原核表达系统成功表达了该蛋白,通过Ni-NTA亲和层析的方法获得了Bm TOL的重组蛋白并制备了多克隆抗体。组织表达分析发现无论是转录水平还是蛋白水平Bm TOL在头部都是高量表达,且Bmtol基因在起蚕时表达量较高,在5龄和蛹期表达量较低,而在化蛾后表达量又开始上调。免疫组化结果显示Bm TOL蛋白定位在头部的皮层、触角和脑中,推测其可能与头部信息传递有关,为家蚕的生长发育和行为调控提供重要的信息来源。     

Structure of Bombyx mori chemosensory protein 1 in solution

Chemosensory Proteins (CSPs) represent a family of conserved proteins found in insects that may be involved in chemosensory functions. BmorCSP1 is expressed mainly in antennae and legs of the silkworm moth Bombyx mori and was cloned from antennal cDNA. Here we report the determination of the structure of Bombyx mori CSP1 (BmorCSP1) by NMR. The overall fold of BmorCSP1 is globular and comprises six alpha-helices. These helices span residues 10-14, 17-27, 35-49, 57-72, 75-85, and 92-100. The internal hydrophobic sides of the helices are formed mostly by leucine and isoleucine residues and, therefore, well suited to constitute a binding site for hydrophobic ligands.     

Expression analysis of chlorophyllid a binding protein a secretory,red fluorescence protein in the midgut of silkworm,Bombyx mori

Chlorophyllid a binding protein （ chbp） was recently characterized by its ability to bind the prosthetic group of chlorophylls and little information is known regarding its expression. In the present study, we found that chpb was expressed highly and exclusively in the midgut of silkworm, Bombyx mori. The expression level of chbp was very high in the newly molted fifth instar larvae followed by gradual decline in the same instar. Our results demonstrated that CHBP was a secretory protein and located mainly in the apical of midgut epithelial cells. Real-time polymerase chain reaction analysis results showed that chpb highly expressed in the anterior midgut, threefold and sixfold higher compared with that of the middle midgut and posterior midgut, respectively, and chpb expression declined in darkness. In addition, the expression of chbp was affected by high-dose virus or bacterium infection.     

家蚕BmChd64基因的克隆与表达定位分析

Chd64是含有钙结合蛋白同源（Calponin homology,CH）结构域的蛋白,在果蝇蜕皮激素与保幼激素信号通路中发挥重要作用。本研究以家蚕Bombyx mori为研究对象,利用PCR克隆了与果蝇Drosophila melanogaster DmChd64同源的BmChd64基因,与表达载体pET-28a连接后,成功获得体外原核表达的BmChd64蛋白,并对其进行了亚细胞定位分析。家蚕BmChd64基因开放阅读框（ORF）的序列为567 bp,编码188个氨基酸,预测分子量大小为20.9 kDa,理论等电点为8.41,编码的蛋白在第27~130个氨基酸处存在CH结构域。同源性比对与进化分析显示,BmChd64与赤拟谷盗Tribolium castaneum和果蝇的Chd亲缘关系较近。qRT-PCR结果显示,BmChd64在家蚕5龄游走期的不同组织中均有表达,且在翅原基中的表达趋势与家蚕体内蜕皮激素（20-hydroxyecdysone,20E）滴度变化规律一致。亚细胞定位结果显示,BmChd64在细胞核与细胞质中均有分布,细胞核内荧光信号较强,且在细胞核外围较弱,推测细胞质中BmChd64也可入核,最终定位在细胞核中。研究结果表明BmChd64可能主要通过20E信号通路调控翅原基等的变态发育,这为进一步完善20E调控昆虫变态发育的分子机制提供了实验基础。     

家蚕半乳糖凝集素BmGalectin-4的表达、纯化及性质分析

【目的】鉴定一种新的家蚕Bombyx mori半乳糖凝集素(galectin)基因,分析其序列和结构特征,测定其在微生物感染后的表达变化,分析其重组表达蛋白与微生物及微生物表面多糖分子的结合特性。【方法】利用TBlastN从家蚕基因组数据库中搜索得到一种新的半乳糖凝集素基因,命名为BmGalectin-4。利用生物信息学分析其序列和结构特征,用半定量RT-PCR检测家蚕分别感染病原菌绿脓杆菌Pseudomonas aeruginosa、金黄色葡萄球菌Staphylococcus aureus和白色念珠菌Candidiasis albicans后BmGalectin-4在不同组织中的表达变化,采用原核表达技术对该基因进行重组表达,并利用亲和层析得到纯化的蛋白。通过ELISA检测BmGalectin-4与细菌和真菌的结合;通过Western blot检测它与多糖的结合。【结果】序列分析显示,BmGalectin-4是一种串联重复型半乳糖凝集素,含有2个糖识别结构域,其结构非常保守。RT-PCR检测表明,BmGalectin-4在家蚕脂肪体、血细胞和中肠中都有表达,且感染细菌和真菌后其表达有显著变化。纯化的重组BmGalectin-4与革兰氏阳性菌、阴性菌和真菌有较强的结合,与微生物表面多糖的结合试验表明其识别有较高的特异性。【结论】BmGalectin-4 是一个典型的串联重复型半乳糖凝集素,可能参与家蚕对病原微生物的免疫防御反应。本研究为进一步研究昆虫中半乳糖凝集素的功能奠定了基础。     

Expression and functional analysis of the cellular retinoic acid binding protein from silkworm pupae (Bombyx mori)

Cellular retinoic acid binding protein (CRABP) is a member of intracellular lipid-binding protein (iLBP), and closely associated with retinoic acid (RA) activity. We have cloned the CRABP gene from silkworm pupae and studied the interaction between Bombyx mori CRABP (BmCRABP) and all-trans retinoic acid (atRA). The MTT assay data indicated that when BmCRABP is overexpressed in Bm5 cells, the cells dramatically resisted to atRA-induced growth inhibition. Conversely, the cells were sensitive to atRA treatment upon knocking down the BmCRABP expression. Subcellular localization revealed that BmCRABP is a cytoplasm protein, even when treated with atRA, the CRABP still remained in the cytoplasm. These data demonstrated that the function of BmCRABP have an effect on the physiological function of atRA.     

家蚕蛹变态期丝腺组织的退化与细胞凋亡特征

利用形态学观察方法、分子生物学检测方法以及20-羟基蜕皮酮(20-hydroxyecdysone)和放线菌酮(cycloheximide)体外培养方法, 研究了家蚕Bombyx mori 蛹变态期丝腺组织的退化与细胞凋亡特征。显微镜的观察显示家蚕丝腺的逐渐退化发生在吐丝期间。DNA梯度电泳的分析表明程序性细胞死亡(programmed cell death)可能伴随发生在丝腺的退化过程中。在离体培养条件下, 用20-羟基蜕皮酮处理5龄第6天幼虫的丝腺, 导致的细胞凋亡提前于对照, 提示在进入蛹变态期前, 20-羟基蜕皮酮提早激发了介导家蚕丝腺细胞凋亡与水解机制的遗传调控级联系统。上述结果表明, 20-羟基蜕皮酮能够诱导家蚕丝腺组织在蛹变态期发生程序性细胞死亡。     

Analysis of expression and chitin‐binding activity of the wing disc cuticle protein BmWCP4 in the silkworm,Bombyx mori

The insect exoskeleton is mainly composed of chitin filaments linked by cuticle proteins. When insects molt, the cuticle of the exoskeleton is renewed by degrading the old chitin and cuticle proteins and synthesizing new ones. In this study, chitin‐binding activity of the wing disc cuticle protein BmWCP4 in Bombyx mori was studied. Sequence analysis showed that the protein had a conservative hydrophilic “R&R” chitin‐binding domain (CBD). Western blotting showed that BmWCP4 was predominately expressed in the wing disc‐containing epidermis during the late wandering and early pupal stages. The immunohistochemistry result showed that the BmWCP4 was mainly present in the wing disc tissues containing wing bud and trachea blast during day 2 of wandering stage. Recombinant full‐length BmWCP4 protein, “R&R” CBD peptide (CBD), non‐CBD peptide (BmWCP4‐CBD^?), four single site‐directed mutated peptides (M₁, M₂, M₃ and M₄) and four‐sites‐mutated peptide (M_F) were generated and purified, respectively, for in vitro chitin‐binding assay. The results indicated that both the full‐length protein and the “R&R” CBD peptide could bind with chitin, whereas the BmWCP4‐CBD^? could not bind with chitin. The single residue mutants M₁, M₂, M₃ and M₄ reduced but did not completely abolish the chitin‐binding activity, while four‐sites‐mutated protein M_F completely lost the chitin‐binding activity. These data indicate that BmWCP4 protein plays a critical role by binding to the chitin filaments in the wing during larva‐to‐pupa transformation. The conserved aromatic amino acids are critical in the interaction between chitin and the cuticle protein.