玫烟色棒束孢(Isaria fumosorosea)侵染小菜蛾的表达谱分析

【背景】昆虫病原真菌对寄主的侵染是一个十分复杂的过程,是多基因共同作用的结果。玫烟色棒束孢(Isaria fumosorosea) IFCF01菌株对小菜蛾具有很高的致病力,然而有关玫烟色棒束孢对小菜蛾致病的相关基因少见报道。【目的】筛选玫烟色棒束孢侵染小菜蛾相关基因,为更好地利用玫烟色棒束孢防治小菜蛾提供基因靶点。【方法】采用第二代高通量测序技术RNA-Seq,对玫烟色棒束孢侵染小菜蛾2–3龄幼虫4、8、12、16、24、30、36 h的虫菌混合样品(处理组)及纯培养玫烟色棒束孢(对照组)进行测序分析并筛选差异表达基因,结合生物信息学方法分析差异基因涉及的功能模块和信号通路。【结果】玫烟色棒束孢侵染小菜蛾混合样品与纯培养玫烟色棒束孢对照组对比分析共获得28 384个差异基因,其中显著差异表达基因274个,上调表达118个,下调表达156个。筛选获得的显著差异表达基因,特别是上调表达基因可能与玫烟色棒束孢对小菜蛾的侵染有关。GO二级分类显示,差异表达基因能够注释到36个GO条目中,包含18个生物学过程、9个细胞组分和9个分子功能。KEGG通路分析显示共有171个差异表达基因(differentially expressed gene,DEG)注释到132个通路中,其中有66个DEG显著富集在14个通路中。这些显著差异表达基因中大部分为玫烟色棒束孢侵染过程中潜在致病毒力相关基因。【结论】本研究为筛选玫烟色棒束孢侵染小菜蛾致病相关基因提供重要数据库,也为阐明玫烟色棒束孢对小菜蛾的侵染机制提供基础。     

小菜蛾血淋巴对玫烟色棒束孢入侵的生理防御反应

为了探讨小菜蛾Plutella xylostella血淋巴对玫烟色棒束孢Isaria fumosorosea的防御机制, 利用吉姆萨染色法在光镜下观察了小菜蛾4龄幼虫血细胞感染不同致病力玫烟色棒束孢后的免疫反应。结果表明： 玫烟色棒束孢的入侵可导致小菜蛾血细胞数量发生改变, 表现为入侵初期血细胞总数增加, 不同类型血细胞比例改变等。体表接种后8-45 h, 高致病力菌株PFCF-001处理的幼虫血细胞总数在24 h出现最高值6 250个/mm³, 而低致病力菌株PFCF-D58处理在36 h达到最高值3 000个/mm³, 比高致病力菌株处理滞后12 h。不同菌株处理下虫体参与防御反应的主要血细胞类型为浆血细胞和粒血细胞。小菜蛾幼虫血细胞在感菌初期能够产生粘附、吞噬、包被及形成结节等一系列防卫反应, 但最终无法抵挡高致病力菌株PFCF-001的侵染。结果说明小菜蛾幼虫血淋巴对玫烟色棒束孢的防御反应只有短暂的抑制作用, 不能从根本上清除、 消灭玫烟色棒束孢。     

球孢白僵菌诱导的柑橘木虱免疫应答转录组分析

【目的】筛选柑橘木虱Diaphorina citri Kuwayama应对球孢白僵菌侵染的免疫应答及其网络调控基因,以进一步探讨柑橘木虱对球孢白僵菌的免疫防御机制。【方法】采用Illumina高通量测序平台对感染球孢白僵菌24、48、72 h与健康的柑橘木虱转录组进行了测序,利用生物信息学软件对筛选到的差异表达基因进行了功能注释、分类以及参与的信号通路分析。【结果】组装得到138 313条不可延长的非冗余Unigene,其N50和N90分别为2 532 bp和413 bp,平均长度为1 191.26 bp。在CK vs.S24h、CK vs.S48h和CK vs.S72h 3个转录组里分别获得了971、1 671和752个显著差异表达基因(DEGs),GO富集分析表明分别有405、614和542个DEGs显著富集到56、83和60个GO terms中,KEGG pathway分析结果显示分别有98、333和247个DEGs显著富集到10、27和25条代谢通路里。【结论】差异表达基因主要富集在能量代谢、离子运输、转录和翻译调控、生殖和发育调控以及免疫防御反应等相关通路,大部分编码潜在的与免疫识别及调控相关的基因,并从中筛选到5个显著上调表达的免疫相关基因,为开展柑橘木虱免疫应答虫生真菌的研究奠定理论基础。下一步将进行免疫相关基因的q-PCR验证及表达量分析,研究其在柑橘木虱应对球孢白僵菌侵染过程中的作用。     

两种表面活性剂对玫烟色棒束孢PF904菌株侵染小菜蛾幼虫的影响

[目的]在前期筛选试验的基础上,比较表面活性剂对玫烟色棒束孢Isaria fumosoroseus PF904菌株侵染小菜蛾Plutella xylostella 3龄幼虫的增效作用,获得可提高玫烟色棒束孢PF904防治效果的助剂.[方法]通过扫描电镜观察和室内致病力试验,测定喷施分别添加表面活性剂聚二甲基硅氧烷(OF...     

玫烟色棒束孢侵染对小菜蛾幼虫体内不同酶活的影响

在实验室条件下,测定了昆虫病原真菌玫烟色棒束孢Isaria fumosorosea的侵染对小菜蛾Plutella xylostella3龄幼虫体内酚氧化酶(PO)和不同抗氧化酶类,包括超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化物酶(POD)、过氧化氢(CAT)及谷胱甘肽S-转移酶(GSTs)活力的变化。结果表明,玫烟色棒束孢侵染小菜蛾3龄幼虫后,体内PO、SOD、POD、CAT和GSTs活力均受到明显的影响。其中感病小菜蛾幼虫体内的PO活力始终高于同期未感染的小菜蛾幼虫,当接菌40h时,酚氧化酶活力达到最大37.4U/g,为对照的2.6倍,而SOD、POD、CAT和GSTs活力在感病前期明显高于对照,接菌40–48h各种酶活力均达到最大,当接菌56h酶活力开始下降,64h时酶活力均明显低于对照。可见玫烟色棒束孢的侵染严重干扰了小菜蛾幼虫体内正常的生理活动。     

玫烟色棒束孢侵染小菜蛾的透射电镜观察

利用透射电镜观察了玫烟色棒束孢Isaria fumosorosea(=Paecilomyces fumosoroseus)对小菜蛾Plutella xylostella(L.)的侵染过程及菌体在虫体内的增殖方式。以浓度为1×107孢子/mL的孢子悬浮液接种小菜蛾4龄幼虫,在透射电镜下对虫体各部位的观察结果表明:接种后1h玫烟色棒束孢菌株EBCL03011的分生孢子开始萌芽,至4h可观察到附着孢的形成和穿透,接种后24h已普遍侵入体腔。玫烟色棒束孢在寄主表皮和体腔内,以菌丝段出芽生殖、菌丝分隔及菌丝段分隔3种方式大量增殖,主要以颗粒状的菌丝段在寄主体腔内扩散,菌丝段在穿透表皮和体腔内增殖过程中伴随着机械压力和酶的活动。     

玫烟色棒束孢相容性农药筛选及混用对小菜蛾的防效

为了明确玫烟色棒束孢Isaria fumosoroseus与常用农药的相容性,本研究测定了7种常用农药制剂对玫烟色棒束孢菌丝生长、孢子萌发以及产孢量的影响,测试了相容性较好杀虫剂与玫烟色棒束孢混用对小菜蛾Plutella xylostella Linnaeus的防治效果。结果表明,田间使用浓度下,氯虫苯甲酰胺、双丙环虫酯和四氯虫酰胺对菌丝抑制作用相对较小,田间浓度和亚致死浓度的阿维菌素对菌丝生长具有促进作用。所有供试农药在田间使用浓度下对孢子萌发均具有明显抑制作用,抑制作用随农药浓度降低而减弱,其中噻虫啉和四氯虫酰胺对孢子萌发抑制作用相对较小。所有测试药剂对产孢量具有显著抑制作用,抑制作用随农药浓度降低而减弱,其中噻虫啉和氯虫苯甲酰胺抑制作用较小。玫烟色棒束孢3种浓度（9×107、9×106、9×105个孢子/mL）分别与次亚致死剂量四氯虫酰胺混用对小菜蛾的LT50分别为2.19 d、2.94 d、5.16 d,杀虫速度高于单用相应浓度真菌处理（2.34 d、3.29 d、5.33 d）和四氯虫酰胺单独处理（10.60 d）。综合分析结果表明,低剂量的四氯虫酰胺、噻虫啉和氯虫苯甲酰胺与玫烟色棒束孢相容性相对较好,是田间菌药混用可供选择对象;次亚致死剂量的四氯虫酰胺与真菌混用防控小菜蛾具有协同增效作用。     

小菜蛾应对球孢白僵菌感染的免疫应答基因分析

通过室内生物测定,筛选对小菜蛾Plutella xylostella具有高毒力的球孢白僵菌Beauveria bassiana菌株,分析小菜蛾应对球孢白僵菌浸染的免疫应答基因。采用新一代Illumina高通量测序技术对接种/感染48h与未接种的小菜蛾样品分别进行转录组测序,筛选差异表达基因;结合生物信息学分析差异表达基因的功能、分类及涉及的信号通路等。结果表明接种小菜蛾48h后诱导2 434个基因发生差异表达,包括1 080个上调基因和1 354个下调基因。GO分类结果表明,这些差异表达基因（DEGs）被注释到45个GO term中,包括23个生物学过程,12个细胞组分和10个分子功能。KEGG分析表明,1 308个DEGs被富集到25个功能途径,这些DEGs包括497个上调基因和811个下调基因。分析发现,DEGs编码蛋白包含肽聚糖识别蛋白、丝氨酸蛋白酶55、丝氨酸蛋白酶抑制剂以及细胞色素P450 6K1类的免疫相关蛋白。另外,组蛋白、磷酸泛酰半胱氨酸脱羧酶、双链RNA结合蛋白、黑芥子酶等基因在球孢白僵菌侵染过程中也高表达,推测这些基因可能参与小菜蛾应对球孢白僵菌侵染的免疫反应。研究结果为进一步研究小菜蛾免疫相关基因的功能奠定了基础。     

感染球孢白僵菌的烟粉虱若虫免疫应答转录组分析

【目的】筛选烟粉虱Bemisia tabaci(Gennadius)若虫应对白僵菌Beauveria bassiana侵染的应答基因,以进一步研究烟粉虱免疫反应的分子机制。【方法】采用新一代高通量测序技术对感染和非感染白僵菌的烟粉虱4龄若虫进行了测序分析,并筛选了差异表达基因;利用生物信息学工具对转录组测序得到的基因进行了功能注释、分类以及参与的信号通路展示。【结果】组装得到非冗余Unigene 232 554个,其N50和N90分别为1 153 bp和260 bp,平均长度为67 424 bp。对所有的基因进行差异表达分析发现:以P<0.05为标准筛选得到了1 166个差异表达基因,其中上调表达基因有474个,下调表达基因有692个,其中,与免疫相关的基因有405个;GO富集分析发现:有416个GO term有富集现象,包括156个生物学过程(66 402个Unigenes),89个细胞组分(27 645个Unigenes)和154个分子功能(73 417个Unigenes);KEGG代谢通路分析将烟粉虱转录组1 145个DEG匹配到309个通路上,其中76个通路得到了富集。【结论】对405个可能参与到烟粉虱若虫对白僵菌侵染的免疫识别和防御的基因进行了测序。研究结果为从分子水平上开展应用虫生真菌防治烟粉虱的研究奠定信息学基础。     

感染球孢白僵菌的家蚕免疫应答差异表达基因分析

【目的】筛选家蚕Bombyx mori应对白僵菌Beauveria bassiana侵染的应答基因, 以进一步研究家蚕抵御真菌侵染的分子机制。【方法】采用新一代Solexa高通量测序技术对感染白僵菌及未感染白僵菌的对照组家蚕进行了测序分析, 筛选差异表达基因; 结合生物信息学工具分析差异表达基因的功能注释、 分类及涉及的信号通路等; 应用荧光定量PCR技术验证10个基因的差异表达。【结果】通过测序和生物信息学分析共获得377个差异表达基因, 其中表达上调基因236个, 下调基因141个; KEGG通路分析表明, 各通路中既有表达上调的基因, 也有下调基因; 12个上调基因、 26个下调基因参与3个显著性富集的KEGG通路, 即核糖体、 氨酰tRNA生物合成和剪接体通路。定量PCR与测序结果显示, 溶菌酶、 热激蛋白、 谷胱甘肽S-转移酶、 肽聚糖识别蛋白等与免疫应激相关的蛋白基因均呈现表达上调。【结论】本研究筛选获得的差异表达基因, 特别是上调表达的基因可能与家蚕应对白僵菌侵染的应答机制有关, 其中与免疫应激相关的蛋白基因如溶菌酶、 热激蛋白、 谷胱甘肽S 转移酶、 肽聚糖识别蛋白基因等可能直接参与了家蚕对白僵菌的免疫识别和防御, 研究结果为从分子水平阐明家蚕抵御真菌侵染的防御机制和白僵菌对家蚕的致病机理提供新的依据。     

牛痘病毒感染人巨噬细胞基因表达谱的RNA-Seq分析

[目的]利用RNA-Seq,分析人巨噬细胞在牛痘病毒(VACV)感染前后基因表达的变化,探索牛痘病毒与宿主细胞相互作用的机制.[方法]用牛痘病毒感染人巨噬细胞,采用RNA-Seq比较感染组和对照组的差异表达基因,并进行KEGG、GO以及STRING网络分析.[结果]感染组与对照组相比,筛选出显著性差异表达基因4796个...     

Identification and comparative analysis of the pearl oyster <Emphasis Type="Italic">Pinctada fucata</Emphasis> hemocytes microRNAs in response to <Emphasis Type="Italic">Vibrio alginolyticus</Emphasis> infection

MicroRNAs (miRNAs) are a class of noncoding RNA molecules that function as negative regulators of gene expression and play important roles in a wide spectrum of biological processes, including in immune response. However, the physiological regulation function of Pinctada fucata miRNAs, specially their immunomodulation has not been explored yet. Here, two small RNA libraries from hemocytes of P. fucata with or without Vibrio alginolyticus infection were constructed and sequenced using the high-throughput Illumina deep sequencing technology. In total, 11,939,992 and 11,083,327 raw reads, corresponding to 10,993,546 and 9,988,179 clean reads, were respectively obtained in the control and infected libraries. A total of 276 miRNAs, including 225 known miRNAs and 51 putative novel miRNAs, were identified by bioinformatic analysis. By using pairwise comparison between two libraries, 93 miRNAs were found to be significantly differentially expressed, with 42 and 51 miRNAs exhibiting up-regulation and down-regulation, respectively. Thereinto, some known miRNAs were considered to be immune-related. Real-time PCR were implemented for 6 miRNAs co-expressed in the control and infected samples, and agreement was confirmed between the high-throughput sequencing and real-time PCR data. After miRNA targets were predicted, GO and KEGG pathway enrichment analysis were performed, and the results indicated that ten of the differentially expressed miRNAs were involved in immune-related pathways, and might participate in the host immune response to V. alginolyticus. These results of identification and comparative analysis of miRNAs might deepen our understanding of host-pathogen interactions and immune defense mechanisms in P. fucata.     

Gene Expression Profile of Bombyx mori Hemocyte under the Stress of Destruxin A

Destruxin A (DA) is a cyclo-peptidic mycotoxin from the entomopathogenic fungus Metarhizium anisopliae. To uncover potential genes associated with its molecular mechanisms, a digital gene expression (DGE) profiling analysis was used to compare differentially expressed genes in the hemocytes of silkworm larvae treated with DA. Ten DGE libraries were constructed, sequenced, and assembled, and the unigenes with least 2.0-fold difference were further analyzed. The numbers of up-regulated genes were 10, 20, 18, 74 and 8, as well as the numbers of down-regulated genes were 0, 1, 8, 13 and 3 at 1, 4, 8, 12 and 24 h post treatment, respectively. Totally, the expression of 132 genes were significantly changed, among them, 1, 3 and 12 genes were continually up-regulated at 4, 3 and 2 different time points, respectively, while 1 gene was either up or down-regulated continually at 2 different time points. Furthermore, 68 genes were assigned to one or multiple gene ontology (GO) terms and 89 genes were assigned to specific Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG) Orthology. In-depth analysis identified that these genes putatively involved in insecticide resistance, cell apoptosis, and innate immune defense. Finally, twenty differentially expressed genes were randomly chosen and validated by quantitative real-time PCR (qRT-PCR). Our studies provide insights into the toxic effect of this microbial insecticide on silkworm''s hemocytes, and are helpful to better understanding of the molecular mechanisms of DA as a biological insecticide.     

转录组分析揭示溶藻弧菌感染早期大黄鱼的免疫应答特征

为探究大黄鱼(Larimichthys crocea)抗溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)感染的免疫应答机制, 研究通过转录组测序及生物信息学分析的手段, 在转录组水平分析了溶藻弧菌感染24h后大黄鱼头肾中基因表达水平的变化, 共获得1903个差异表达基因(Differentially expressed genes, DEGs), 其中641个上调表达基因, 1262个下调表达基因。通过Gene Ontology(GO)和Kyoto encyclopedia of genes and genomes(KEGG)富集分析发现, 一些先天性免疫相关基因, 包括补体(C1qbp、C1QL2和C7)、热休克蛋白(hspd1、hspa4、hspa5和hspa9)、抗菌肽(Hepcidin-1)、C型凝集素受体(Clec4e和MR1)、己糖激酶(hex1)、精氨酸酶(Arg-II)和线粒体翻译延伸因子(TUFM)等基因表达水平均显著上调; 而许多与获得性免疫相关基因, 包括T、B淋巴细胞增殖分化(FcR5和CCL17)、T细胞调控(TCRα、TCRβ、CD3ε、CD3γδ、CD3ζ、ZAP-70和ITK)及免疫球蛋白参与抗原识别(Ighv 5A、Ighv 914和Ighv XIG14)等基因表达水平均显著下调。结果表明, 在感染早期, 大黄鱼先天性免疫在抵御溶藻弧菌感染中发挥重要作用, 而此时获得性免疫受到了抑制。     

昆虫天然免疫相关基因研究进展

在长期进化过程中,昆虫形成了强大的天然免疫防御系统,即体液免疫和细胞免疫。体液免疫主要包括Toll、IMD和JAK/STAT 3条信号通路,通过信号转导及免疫途径调控免疫相关基因的表达,诱导产生抗菌肽和其他效应分子。细胞免疫由血细胞介导,主要完成对病原物的包裹、吞噬和集结等。近年来,昆虫基因组学快速发展,通过生物信息学等方法从昆虫基因组数据中已鉴定到大量免疫相关基因,对这些基因的研究加深了人们对昆虫天然免疫分子机制的认识和理解。根据基因功能,免疫相关基因分为识别、信号转导、调制器、效应分子、黑化反应、RNA干扰和其他基因等7类,这些基因通过互作来调控体液免疫和细胞免疫。本文对昆虫免疫相关基因的分类、功能及家族进化等方面的研究成果进行总结,并对今后昆虫免疫的研究重点进行了展望,以期为昆虫免疫分子机制的研究及开发新的害虫防治策略提供依据。