果实特异性RNAi介导的Lcy基因沉默来增加番茄中番茄红素的含量

根据GenBank中番茄的番茄红素β-环化酶(Lcy)基因序列和八氢番茄红素去饱和酶基因(Pds)启动子序列设计特异引物从番茄基因组DNA中分别扩增出了Lcy基因的高度保守的长302bp的DNA片段和长1790的Pds启动子片段。根据RNAi的原理,将Lcy基因的DNA片段以正反两个方向通过一段内含子序列连接在一起形成RNAi片段,将该片段与Pds启动子一起插入到pVCT2020的表达载体中,通过农杆菌介导的方法转化番茄,获得转基因植株5棵,PCR检测证实外源片段已成功导入番茄基因组中。收获转色期后20d左右的完全成熟的番茄果实提取番茄红素进行含量分析,结果显示转基因番茄果实中番茄红素的含量极大的增加了。上述结果表明通过RNAi果实特异性的抑制类胡萝卜素代谢途径中生物合成酶基因的表达能够极大的增加番茄果实中番茄红素的含量。这为通过基因工程手段提高番茄果实中的营养价值提供了参考。     

番茄抗病基因Cf9的3‘UTR区含有内含子序列

从番茄抗病品种“中杂９号”基因组ＤＮＡ中扩增并克隆了番茄抗叶霉病基因Ｃｆ９。序列分析结果表明,该基因全长２７５１ｂｐ,含有一个编码８６３个氨基酸的开放阅读框架。在该基因的３＇ＵＴＲ区发现了一段未曾报道的内含子序列,长１１５ｂｐ,它所处的位置与番茄另一个抗叶霉病基因Ｃｆ２内含子的位置相似,其５＇和３＇边界序列为一重复序列,ＴＣＣＡＧＧ（Ｔ）ＡＴＴＣ,并与Ｃｆ２基因内含子边界序列高度同源。与已报道的Ｃ     

加工番茄多聚半乳糖醛酸酶（PG）基因的cDNA克隆的全序列测定

以加工番茄“87－5”为材料,采用反转录PCR（RT－PCR）技术将加工番茄G基因的cDNA序列克隆到pGEM-T载体上,并进行了全序列测定分析,结果表明,加工番茄的PG基因的cDNA与国内外报道的番茄PG基因的cDNA,在碱基序列及氨基酸序列上均有差异,说明番茄的PG基因具有多态性。     

番茄RAPD分析有效引物3′端序列的偏倚分布及其与基因组序列结构的关系

对番茄RAPD分析的有效引物与Operon引物系列（OP系列）的3′端序列作了统计比较,研究结果指出,翻茄有效引物系列不是OP系列的随机样本,而是3端序列的种类和分布上有偏倚性的选择性样本,虽然两个系列的引物都具有3’端同序现象,但对其分布频率正交比较结果差异极显,此类同序性3’端在番茄基因组的RAPD座位中是普遍分布 的,RAPD引物3’端序列的非随机分布,反映了番茄基因组内的多态性区段侧翼具有序列的特异性,这种特异性结构应是番茄基因组序列的一种属性,这种属性为番茄属基因组所共有。     

利用de novo组装策略解析猪的基因组变异

正猪(Sus scrofa)是人类最早驯化的动物之一,在农业生产和生物医学研究中具有重要价值。据统计,目前全球约有730多个品种,其中约2/3分布在中国和欧洲。国际家猪基因组测序协作组于2012年完成了欧洲家猪——杜洛克猪(Duroc)的全基因组序列,为后续的遗传变异检测、种群进化与选择性分析等相关研究提供了宝贵的基础资源。目前,大量非模式生物的参考基因组序列往往是不完整的,不能准确涵盖该物种的全部遗传信息,     

果实特异性RNAi介导的Lcy基因沉默来增加番茄中番茄红素的含量

根据GenBank中番茄的番茄红素β-环化酶（Lcy）基因序列和八氢番茄红素去饱和酶基因（Pds）启动子序列设计特异引物从番茄基因组DNA中分别扩增出了Lcy基因的高度保守的长302bp的DNA片段和长1790的Pds启动子片段。根据RNAi的原理,将Lcy基因的DNA片段以正反两个方向通过一段内含子序列连接在一起形成RNAi片段,将该片段与Pds启动子一起插入到pVCT2020的表达载体中,通过农杆菌介导的方法转化番茄,获得转基因植株5棵,PCR检测证实外源片段已成功导入番茄基因组中。收获转色期后20d左右的完全成熟的番茄果实提取番茄红素进行含量分析,结果显示：转基因番茄果实中番茄红素的含量极大的增加了。上述结果表明：通过RNAi果实特异性的抑制类胡萝卜素代谢途径中生物合成酶基因的表达能够极大的增加番茄果实中番茄红素的含量。这为通过基因工程手段提高番茄果实中的营养价值提供了参考     

果实特异性RNAi介导的Lcy基因沉默来增加番茄中番茄红素的含量

根据GenBank中番茄的番茄红素β-环化酶（Lcy）基因序列和八氢番茄红素去饱和酶基因（Pds）启动子序列设计特异引物从番茄基因组DNA中分别扩增出了Lcy基因的高度保守的长302bp的DNA片段和长1790的Pds启动子片段。根据RNAi的原理,将Lcy基因的DNA片段以正反两个方向通过一段内含子序列连接在一起形成RNAi片段,将该片段与Pds启动子一起插入到pVCT2020的表达载体中,通过农杆菌介导的方法转化番茄,获得转基因植株5棵,PCR检测证实外源片段已成功导入番茄基因组中。收获转色期后20d左右的完全成熟的番茄果实提取番茄红素进行含量分析,结果显示：转基因番茄果实中番茄红素的含量极大的增加了。上述结果表明：通过RNAi果实特异性的抑制类胡萝卜素代谢途径中生物合成酶基因的表达能够极大的增加番茄果实中番茄红素的含量。这为通过基因工程手段提高番茄果实中的营养价值提供了参考     

番茄SlmiR393基因超表达载体的构建及其靶基因鉴定

为研究番茄(Lycopersicum esculentum)的SlmiR393基因功能,采用生物信息学方法从番茄基因组数据库中获得SlmiR393的前体序列及其潜在的靶基因。以基因组DNA为模板,克隆了番茄SlmiR393前体基因并整合到pLP35S-100植物表达载体;采用5′ RACE RT-PCR技术验证SlmiR393对预测靶基因mRNA的剪切作用,采用定量PCR技术检测SlmiR393及其靶标基因在番茄不同组织的表达。结果表明,SlmiR393的前体序列含有完整的茎环结构;成熟miR393与3个生长素受体同源基因(SlTIR1、SlTIR1-like1和SlAFB)之间具有识别作用位点。SlmiR393可对番茄3个靶基因的转录本进行剪切降解;SlmiR393与3个不同靶基因(SlTIR1、SlTIR1-like1和SlAFB)的表达模式在叶和茎、花蕾、花中存在一定的互补关系。因此,推断番茄中的SlmiR393可能在特定的组织或发育时期介导特定的靶基因mRNA的剪切降解, 初步证实生长素受体同源基因为SlmiR393的靶基因。此外,成功构建以CaMV 35S为启动子的植物表达载体pLP35S-pre-SlmiR393, 为深入研究SlmiR393在番茄生长素信号转导中的功能奠定了基础。     

番茄COBRA基因克隆、表达模式及生物信息学分析

COBRA作为一种重要的胞外糖基磷脂酰肌醇(GP-I)锚定蛋白,影响植物细胞壁中纤维素含量及细胞的定向伸长。目前已有多个拟南芥、玉米及水稻的COBRA基因的突变体被研究。而有关番茄COBRA基因克隆的研究尚未见报道。本研究利用RT-PCR技术克隆了一个假定编码番茄COBRA蛋白的SlCOBRA基因,并在GenBank注册(JN398667)。序列测定和分析表明,该序列由6个外显子组成,编码444个氨基酸残基;氨基酸序列中存在COBRA蛋白的CCVS保守基序,N端的跨膜信号肽及C-末端的疏水性尾部和GPI锚定ω-位点。系统进化分析表明番茄SlCOBRA与拟南芥AtCOB具有80%氨基酸序列同源性,聚在一个分支上。Real-time PCR分析番茄各个组织中COBRA基因的表达结果表明番茄COBRA为组成型表达,在营养器官(根、茎、叶)中的表达量高于花和果实,尤其在成熟的果实中(从转色期到红熟期)表达量明显减少。     

番茄抗病基因Cf9的3′UTR区含有内含子序列

从番茄（ＬｙｃｏｐｅｒｓｉｃｏｎｅｓｃｕｌｅｎｔｕｍＭｉｌ．）抗病品种“中杂９号”基因组ＤＮＡ中扩增并克隆了番茄抗叶霉病基因Ｃｆ９。序列分析结果表明,该基因全长２７５１ｂｐ,含有一个编码８６３个氨基酸的开放阅读框架。在该基因的３′ＵＴＲ区发现了一段未曾报道的内含子序列,长１１５ｂｐ,它所处的位置与番茄另一个抗叶霉病基因Ｃｆ２内含子的位置相似,其５′和３′边界序列为一重复序列,ＴＣＣＡＧＧ（Ｔ）ＡＴＴＣ,并与Ｃｆ２基因内含子边界序列高度同源。与已报道的Ｃｆ９的ｃＤＮＡ序列相比,它的第３７１位的核苷酸Ｔ突变成了Ｃ,从而使其编码蛋白的ＬＲＲ区第１２１位的亮氨酸突变为脯氨酸。     

中英美科学家宣布启动“国际千人基因组计划”

由中国、英国和美国的科学家组成的“国际协作组”，22日在深圳、伦敦和华豆顿同时宣布：国际“千人基因组计划”正式启动。这一宏伟计划将测定选自全世界各地的至少一千个人类个体的全基因组DNA序列，绘制迄今为止最详尽的、最有医学应用价值的人类基因组遗传多态性图谱。     

LeETR1反义基因对番茄的遗传转化

从番茄果实中提取总RNA,根据GeneBank中LeETR1序列,设计合成特异性引物,利用RT-PCR及技术克隆了LeETR1基因3’端非编码区313bp的cDNA,经酶切图谱和序列分析鉴定无误后,反向插入到植物表达载体pPZP11A中,构建了表达LeETR1反义RNA的双元载体。经农杆菌途径转化番茄品种B1后,通过PCR检测从抗卡那霉素再生植株中筛选到13株阳性植株,Southern blot杂交确证反义基因已经整合到番茄染色体中。对果实乙烯释放的测定结果表明,转基因番茄乙烯释放高峰的出现比对照果实推迟10天,番茄红素的合成受到显抑制,果实不能形成正常的红色。推测LeETR1和番茄的成熟有着密切的关系。     

靶向番茄SlACS2基因CRISPR-Cas9 sgRNA的设计和分析

番茄为呼吸跃变型果实,伴随呼吸跃变产生大量乙烯,即系统II乙烯,易使番茄果实过熟,导致腐烂变质。SlACS2是番茄系统II乙烯合成的限速酶,通过CRISPR-Cas9基因组编辑系统修饰该基因,调控系统II乙烯过量表达,将迟滞番茄过熟。本研究基于RNA-seq建立了SlACS2基因的数字表达谱,表明该基因呈果实特异性表达,在植株的根、茎、叶等部位不表达。SlACS2位于番茄1号染色体,含4个外显子和3个内含子。利用在线工具CRISPRdirect 和CRISPR-P发现第1、2、3外显子分别具有18、9和11条sgRNA。其中,sgRNA1-14和sgRNA3-8及二者的近PAM的12 nt 种子序列在番茄基因组是唯一序列,GC含量高于40%,不存在TTTT终止序列。BLAST结果表明,sgRNA1-14和sgRNA3-8与GenBank公布的8条SlACS2同源序列高度一致,位于该基因的保守区,而与SlACS4和SlACS6的同源序列存在多个SNP,预示这2条sgRNA可用于番茄不同品种SlACS2基因的靶向编辑,并可规避对SlACS家族其他同源基因的脱靶效应。     

加工番茄多聚半乳糖醛酸酶(PG)基因的cDNA克隆和全序列测定

以加工番茄"87-5”为材料,采用反转录PCR(RT-PCR)技术将加工番茄PG基因的cDNA序列克隆到pGEM-T载体上,并进行了全序列测定分析.结果表明,加工番茄的PG基因的cDNA与国内外报道的番茄PG基因的cDNA,在碱基序列及氨基酸序列上均有差异.说明番茄的PG基因具有多态性.     

序言

正20世纪90年代以来,人类基因组测序推动了世界基因组研究的大潮。过去20年中,大量生物完成了基因组测序。1997年国际水稻基因组测序计划(IRGSP)启动,2005年粳稻品种"日本晴"全基因组序列在Nature杂志上发表。多种生物全基因组序列的获得在给研究工作提供极大方便的同时,也给生命科学研究提出了巨大的挑战。其中一个最主要的挑战是如何确定DNA序列的功能。"功能基因     

通过表达ACC脱氨酶基因控制番茄果实的成熟

乙烯在跃变型果实的成熟过程中起着触发呼吸跃变和促进果实成熟的作用。细菌来源的1-氨基环丙烷-1-羧酸(ACC)脱氨酶能降解乙烯的直接前体ACC,从而抑制植物体内乙烯的合成。我们用PCR方法从假单孢杆菌中克隆到ACC脱氨酶基因并通过农杆菌介导的方法将其转入番茄(Lycopersicun esculentum)中。再生植株经Southern blot检测证明,ACC脱氨酶基因已整合到番茄基因组中并稳定表达。转基因番茄果实成熟期的推迟时间与体内乙烯的抑制程度有相关性。转基因番茄植株乙烯的合成降低80%左右,果实在离体条件下可保鲜75d左右。研究ACC脱氢酶基因在植物体内的作用可阐明高等植物体内乙烯的作用机理并为培育耐贮藏果蔬品种打下基础。     

检测番茄BAC序列中paralogs的blastn参数研究

并系同源(paralog)和直系同源(ortholog)是物种进化过程中产生的两种基本的同源序列类型.目前判断ortholog的方法已经基本确立,而paralog的判断却还没有统一的标准.番茄全基因组测序正在进行中,利用GenBank中已有的番茄BAC序列进行一系列不同参数下的比对(blastn),根据比对结果确定了paralog预测的最佳参数,分别是E值为10-40,匹配序列长度为200 bp,序列一致率为80%.这些参数值的确定为以后在番茄BAC序列中进行paralog预测提供了适用的参数.     

利用Solanum pennellii LA0716渐渗系群体初步定位番茄果实硬度QTL

硬度是番茄仅次于风味的品质决定因子。利用来自番茄野生资源S.pennellii LA0716的渐渗系(IL,introgression line)群体,采用穿刺法测定完全红熟期番茄的果实硬度。结果表明,番茄果实果肩、中部和果蒂3个部位的硬度极显著正相关。根据渐渗系遗传图谱,对影响果实硬度的位点进行了初步定位,共检测到5个可明显提高番茄果实硬度的QTL(q F-p-1、q F-p-2、q F-p-3、q F-p-4与q F-p-11),分别位于第1、2、3、4和11号染色体上,其中q F-p-4贡献率最大;2个可显著降低果实硬度的QTL(q S-p-4和q S-p-10),分别位于第4和10号染色体上,其中q S-p-10效应最大。通过比较分析发现,本研究定位的多数QTL与前人在番茄野生种定位的影响硬度的QTL同位,说明番茄硬度在遗传和进化上可能具有一定的保守性。研究结果为番茄硬度QTL的精细定位、克隆及遗传改良奠定了一定基础。     

番茄PPR基因家族的鉴定与生物信息学分析

PPR(Pentatricopeptide repeats)基因家族在植物中广泛存在, 其在植物生长发育过程中至关重要。文章采用生物信息学方法, 利用Pfam已鉴定的PPR保守结构域序列检索番茄(Solanum lycopersicum L.)基因组计划注释的蛋白序列, 最终确定了番茄中可能存在的471个PPR编码基因; 根据拟南芥(Arabidopsis thaliana L.)中鉴定的各个结构域的特点对其进行了蛋白结构分析、分类和保守序列分析, 并对番茄PPR基因家族进行了系统进化树构建、染色体定位、亚细胞定位预测、表达和GO分析等。结果表明：番茄PPR基因家族分为P和PLS两个亚家族, 各占序列数目的一半, PLS亚家族又分为PLS、E、E+和DYW四类, 且在进化树中形成不同的分支; 各个结构域在植物中非常保守; PPR基因家族分布在番茄12条染色体上, 且多数无内含子结构; 大部分PPR蛋白具有线粒体或叶绿体定位序列, GO分析表明PPR蛋白参与RNA相关的生物学过程     

人呼吸道合胞病毒兰州株基因组全长cDNA克隆的构建及鉴定

目的构建用于呼吸道合胞病毒(respiratory syncytial virus,RSV)体外拯救的RSV基因组全长cDNA克隆,并进行鉴定。方法根据RSV Long株基因组序列设计并合成引物,利用RT-PCR技术分6段扩增RSV LZ01/09基因组序列并构建克隆载体;测序后,利用重叠PCR与酶切连接技术,根据基因组序列选择特异性酶切位点,引入Kpn I、Xma I和Sal I酶切位点,构建成4个亚克隆载体;将亚克隆载体的插入片段连接至经过改造且包含T7启动子、锤头状核酶、多克隆位点、丁肝核酶、T7终止子的p RSV1载体中,构建RSV基因组全长cDNA克隆;对克隆全长cDNA序列进行测定,与亲本RSV LZ01/09基因组进行同源性比对分析,并与RSV实验参比株进行系统进化树分析。结果测序结果显示,RSV LZ 01/09的基因组全长为15 204 bp,与GenBank公布的RSV基因组序列长度相当,将完整的序列提交GenBank,登录号为KY782635;酶切及测序结果显示,用于RSV全长cDNA克隆构建的基本载体p BSKS-MCS(简称p RSV1)与预期相符,RSV全长基因组cDNA克隆质粒(简称转录载体p RSV1-4F)酶切片段大小与预期一致;同源性比对结果显示,全长cDNA序列与亲本RSV LZ01/09基因组序列同源性高达99.83%;系统进化树分析结果显示,其与RSV-A亚型序列同属于一个分支。结论测序及酶切分析结果表明已成功构建RSVLZ01/09基因组全长cDNA克隆,为建立拯救RSV重组病毒的反向遗传学系统平台奠定了基础。