油桐尺蠖核型多角体病毒的空斑测定

在油桐尺蠖卵巢细胞系上对油桐尺蠖核型多角体病毒(BsNPV)进行了空斑测定。用此方法测定了BsNPV的感染力,并将所得的结果与其TCID_(50)进行比较,结果显示这两种方法在测定病毒感染力时敏感性相似。     

基于TCID50检测AAV9载体制品感染性滴度的方法

目的:建立一种基于半数组织培养感染剂量(median tissue culture infective dose,TCID₅₀)检测9型腺相关病毒(adeno-associated virus type 9,AAV9)载体制品感染性滴度的方法。方法:利用含AAV2 rep和cap基因的1型单纯疱疹病毒(herpes simplex virus type1,HSV1)做为辅助病毒与梯度稀释的AAV9载体制品共同感染HEK-293细胞,培养48 h后用实时荧光定量PCR(quantitative real-time PCR,qPCR)扩增AAV特异性反向末端重复序列(inverted terminal repeats,ITR),根据阳性及阴性感染孔数,利用Kärber法计算样品的TCID₅₀。结果:采用携带增强绿色荧光蛋白报告基因的AAV9载体制品确定辅助病毒HSV1-rc最佳感染复数(multiplicity of infection,MOI)为5,AAV9-101的感染性滴度为1.6×10⁹ TCID₅₀/mL。结论:对AAV9载体制品进行感染性滴度检测,且具有可重复性。     

细胞密度和感染复数对SARS病毒在Vero细胞中增殖的影响

阐明宿主细胞密度和病毒感染复数(MOI)对SARS冠状病毒增殖的影响,为SARS灭活疫苗的研究奠定基础。采用析因设计方法,考虑MOI(0.01、0.05和0.1)与细胞密度(2×104、4×104和8×104/cm2)2个3水平实验因素,在各水平组合条件下培养SARS病毒,以组织培养半数感染量(TCID50)作为观测指标,分析SARS冠状病毒滴度在不同增殖条件下的差异。结果表明,MOI、宿主细胞密度和二者之间的交互作用对SARS病毒滴度的影响分别具有非常显著性差异(F=12.70,P<0.01)、显著性差异(F=6.94,P<0.05)和非常显著性差异(F=8.22,P<0.01)。在0.01MOI和8×104/cm2条件下,病毒滴度达5.57×105TCID50/mL。说明SARS冠状病毒在培养细胞中的增殖能力显著依赖于宿主细胞密度、病毒感染复数和二者的交互作用。     

藤黄节杆菌β-1,3-葡聚糖酶基因在大肠杆菌中的克隆及表达

以藤黄节杆菌基因组为模板,克隆获得β-1,3-葡聚糖酶基因,分别构建至原核表达载体pET-28a(+)与pBAD18上,诱导获得高效表达,粗酶液对酵母多糖的裂解活性达到161 U/mL。在裂解酵母试验中,粗酶液也表现出较高的活性。研究中得到一株突变株,其对于研究β-1,3-葡聚糖酶在裂解酵母中多糖结合域的地位和作用有着重要的价值。     

牛磺胆酸钠在大鼠急性胰腺炎模型中的半数致死量(LD50)研究

目的:通过使用不同浓度的牛磺胆酸钠(TC)建立急性胰腺炎(AP)模型,观察相应的死亡率,进而计算其半数致死量。方法:使用不同浓度的TC(0%(wt/vl)、1%、2%、3%、4%、5%、9%)观察AP造模72小时后各组的死亡率。同时分析TC浓度与组织病理评分、血清淀粉酶和外周血细胞变化的相关性。结果:TC的半数致死量为3.409%。并且,TC的浓度与组织病理评分、血清淀粉酶和外周血细胞变化密切相关。结论:TC所致AP造模的最佳剂量为3.409%。     

MEK1/2抑制剂U0126抑制肠道病毒71型的复制

为了揭示肠道病毒71型(enterovirus71,EV71)的复制与宿主细胞Raf/MEK/ERK信号通路(简称ERK通路)的相互关系,本研究应用临床诊断为手足口病的患儿疱疹液,通过易感细胞分离培养、RT-PCR及序列测定,以及Western印迹技术等方法,成功分离到EV71临床株.进一步用该分离株感染易感细胞,通过观察宿主细胞p-ERK1/2蛋白磷酸化水平、病毒特异性衣壳蛋白VP1水平、病毒半数组织培养感染量(50%tissue culture infectious dose,TCID50),以及感染细胞的CPE等指标,以期揭示ERK通路在EV71复制的作用.结果表明,EV71的复制可引起细胞ERK通路的活化;而用MEK1/2特异性的抑制剂U0126预先抑制ERK通路的活化,可显著地降低受染细胞上清液中的病毒的感染滴度(以TCID50表示)、受染细胞中EV71VP1蛋白水平、受染细胞中EV71核酸水平,以及受染细胞的细胞病变效应(cytopathic effect,CPE).提示ERK信号通路的活化对EV71的复制具有重要的作用.本研究为进一步阐明EV71在宿主细胞内的复制机制、寻找新型抗病毒靶标等研究奠定了良好的基础.     

H5N1型禽流感病毒广谱中和单克隆抗体的筛选及其中和机制初步研究

利用杆状病毒-昆虫细胞表达H5N1型禽流感病毒的血凝素蛋白(HA),纯化后的重组蛋白HA免疫小鼠并制备杂交瘤单克隆抗体,用H5N1型禽流感病毒的全病毒进行筛选,成功地获得了抗H5N1型禽流感病毒血凝素蛋白HA的单抗.MDCK细胞微量中和试验表明,单抗8G10D7可对clade2和clade9的H5N1型禽流感病毒起中和作用.Western-blot及血凝抑制实验进一步证明了该单抗的结合位点位于HA蛋白的HA1亚基上.鸡胚感染病毒预防试验结果表明,8G10D7对禽来源的和人来源的H5N1型禽流感病毒均可达到100%的保护率;在治疗试验组中,8G10D7对禽来源的病毒感染具有较高的保护率,可达100%,对人来源的H5N1型禽流感病毒最高也可达87.5%的保护率.该抗体的获得不仅为H5N1型高致病性禽流感病毒的预防和治疗带来了希望,同时其中和位点的发现也为以后亚单位疫苗的研制提供新的思路.     

牛磺胆酸钠在大鼠急性胰腺炎模型中的半数致死量（LD50）研究

目的：通过使用不同浓度的牛磺胆酸钠（Tc）建立急性胰腺炎（AP）模型,观察相应的死亡率,进而计算其半数致死量。方法：使用不同浓度的TC（0％（wt／v1）、1％、2％、3％、4％、5％、9％）观察AP造模72小时后各组的死亡率。同时分析TC浓度与组织病理评分、血清淀粉酶和外周血细胞变化的相美性。结果：TC的卓数致死量为3．409％。并且,TC的浓度与组织病理评分、血清淀粉酶和外周血细胞变化密切相关。结论：TC所致AP造模的最佳剂量为3．409％。     

甲型流感HIN1病毒抑制NK细胞杀伤效应及治疗策略展望

NK细胞是天然免疫系统的重要成员之一,在控制某些病毒感染与抗肿瘤中发挥着重要作用。根据表面标志表达水平的差异,将NK细胞分为CD56bright和CD56dim两大亚群;此外根据NK细胞在免疫应答过程中功能的不同又将NK细胞分为辅助性NK细胞、调节性NK细胞、杀伤性NK细胞与     

SHIV1157ipd3N4细胞适应株的制备及其生物特性

目的体外制备SHIV1157ipd3N4病毒中国恒河猴细胞适应株,在细胞水平和中国恒河猴体内评价其生物学特性。方法用SHIV1157ipd3N4病毒阴道感染中国恒河猴,在血浆病毒载量高峰期采血分离外周血单核淋巴细胞（PBMCs）,与正常中国恒河猴PBMCs共培养。定期测定培养液中的P24抗原水平。当病毒复制达高峰期时收集培养上清,分装并冻存。测定病毒RNA载量、P24抗原浓度和TCID50。静脉感染中国恒河猴,研究该批次SHIV1157ipd3N4在体内的病毒学、免疫学指标变化及变异情况,分析其基本的生物学特性。结果本研究共制备了243 mL SHIV1157ipd3N4病毒原液,gp120序列分析表明病毒未发生变异,CCR5的嗜性也未发生改变。病毒载量为1.586×108 copies/mL,P24抗原水平为1.16×103 pg/mL,TZM-bl细胞测定病毒的TCID50为3.16×103/mL。1 mL SHIV1157ipd3N4静脉成功感染中国恒河猴G1004V,高峰期病毒载量达到1.0×106 copies/mL以上。结论此次制备的SHIV1157ipd3N4细胞适应株生物学特性稳定,适合作为毒种库构建SHIV1157ipd3N4/中国恒河猴模型。     

RT-SHIV中国恒河猴适应株细胞水平生物学特性分析

目的体外增值、制备动物感染来源的RT-SHIV病毒中国恒河猴适应株,比较PBMCs和CEMx174两种细胞制备出病毒的差异,同时用TZM-bl、CEMx174、PBMC三种细胞滴定测定病毒TCID50。方法用RT-SHIV病毒静脉感染中国恒河猴,定期采血测定血浆病毒载量,当病毒载量达高峰时采血分离外周血单核淋巴细胞（PBMCs）,与正常恒河猴PBMCs或CEMx174细胞共培养,定期测定培养液中的P24抗原水平,当病毒复制达高峰期时收集培养上清,分装并冻存;测定病毒RNA载量、P24抗原浓度,滴定病毒的TCID50。结果本研究共制备了78 mL PBMCs来源的RT-SHIV病毒和85 mL CEMx174细胞来源的RT-SHIV病毒。RT基因序列和原始序列的相似度为99%,仅在第254和265位的氨基酸发现突变。RT-SHIV（PBMC）和RT-SHIV（CEMx174）病毒载量分别为1.641×108 copies/mL和8.375×108 copies/mL,P24抗原水平分别为20.745 ng/mL和4.28 ng/mL,TZM-bl、CEMx174、PBMC细胞测定病毒的TCID50分别为3.16×105 TCID50/mL和1×104 TCID50/mL,5×102 TCID50/mL和5×105 TCID50/mL,5×102 TCID50/mL和5×103 TCID50/mL。结论 PBMCs细胞来源制备的病毒较CEMx174制备的病毒具有更高的感染性。     

利用RNA干扰机制抑制猪繁殖与呼吸综合征病毒的增殖

本文探讨依靠RNAi技术对猪繁殖与呼吸综合征病毒( PRRSV) 增殖的干扰作用.筛选到针对编码PRRS病毒核衣壳蛋白的N基因的两处靶序列作为候选片段,在MARC-145细胞上进行基因干扰实验研究.成功观测到由载体表达的小干扰RNA (siRNA)在MARC-145细胞中对PRRS病毒增殖的抑制现象.通过选取不同时间段对病毒进行TCID50检测,以及对CPE出现时间进行观察和免疫荧光技术,得到RNA干扰对PRRS病毒增殖抑制作用的动态数据.证实在真核细胞水平上,RNA干扰机制可以抑制PRRS病毒的增殖.实验结果表明,依靠载体表达的RNA干扰技术将会对今后针对PRRS病毒的新型疫苗开发提供一个新思路.     

Intrathymic effect of acute pathogenic SHIV infection on T-lineage cells in newborn macaques

We intrarectally infected newborn macaques with a pathogenic simian/human immunodeficiency virus (SHIV) that induced rapid and profound CD4 (+) T cell depletion, and examined the early effects of this SHIV on the thymus. After intrarectal infection, viral loads were much higher in the thymus than in other lymphoid tissues in newborns. In contrast, no clear difference was seen in the viral loads of different tissues in adults. Histological and immunohistochemical observations showed severe thymic involution. Depletion of CD4 (+) thymocytes began in the medulla at 2 weeks post infection and spread over the whole thymus. After in vivo infection, the CD2 (+) subpopulation, which represents a relatively later stage of T cell progenitors, was selectively reduced and development of thymocytes from CD3 (-) CD4 (-) CD8 (-) cells to CD4 (+) CD8 (+) cells was impaired. These results suggest that profound and irreversible loss of CD4 (+) cells that are observed in the peripheral blood of SHIV-infected monkeys are due to destruction of the thymus and impaired thymopoiesis as a result of SHIV infection in the thymus.     

Protective efficacy of nonpathogenic nef-deleted SHIV vaccination combined with recombinant IFN-gamma administration against a pathogenic SHIV challenge in rhesus monkeys

We previously reported that a nef-deleted SHIV (SHIV-NI) is nonpathogenic and gave macaques protection from challenge infection with pathogenic SHIV-C2/1. To investigate whether IFN-gamma augments the immune response induced by this vaccination, we examined the antiviral and adjuvant effect of recombinant human IFN-gamma (rIFN-gamma) in vaccinated and unvaccinated monkeys. Nine monkeys were vaccinated with nef-deleted nonpathogenic SHIV-NI. Four of them were administered with rIFN-gamma and the other five monkeys were administered with placebo. After the challenge with pathogenic SHIV-C2/1, CD4(+) T-cell counts were maintained similarly in monkeys of both groups, while those of the unvaccinated monkeys decreased dramatically at 2 weeks after challenge. However, the peaks of plasma viral load were reduced to 100-fold in SHIV-NI vaccinated monkeys combined with rIFN-gamma compared with those in SHIV-NI vaccinated monkeys without rIFN-gamma. The peaks of plasma viral load were inversely correlated with the number of SIV Gag-specific IFN-gamma-producing cells. In SHIV-NI-vaccinated monkeys with rIFN-gamma, the number of SIV Gag-specific IFN-gamma-producing cells of PBMCs increased 2-fold compared with those in SHIV-NI-vaccinated monkeys without rIFN-gamma, and the NK activity and MIP-1alpha production of PBMCs were also enhanced. Thus, vaccination of SHIV-NI in combination with rIFN-gamma was more effective in modulating the antiviral immune system into a Th1 type response than SHIV-NI vaccination alone. These results suggest that IFN-gamma augmented the anti-viral effect by enhancing innate immunity and shifting the immune response to Th1.     

携带GFP发光基因人猴嵌合免疫缺陷病毒SHIV的构建及活性检测

目的获得正常感染宿主细胞并稳定表达绿色荧光的SHIV毒株,为后期建立发光SHIV/恒河猴感染模型奠定基础。方法通过分子克隆手段,将绿色荧光蛋白基因克隆到携带HIV-1包膜蛋白的SHIV病毒全基因组中,并在细胞水平检测各毒株的感染活性及荧光蛋白表达能力。结果得到一株可表达绿色荧光蛋白的病毒株SHIV-KB9nefGFP,并具有感染TZM-bl细胞系及猴PBMC的能力。结论该毒株在宿主细胞恒河猴PBMC中具有一定复制能力,希望通过后续的猴体内传代实验获得毒力更强的发光病毒。     

SHIV病毒在猴体内的复制与传代

目的为建立SHIV艾滋病动物模型提供毒力较强的病毒株,将新合成的SHIV XJ02170病毒适应猴体,并增强其毒力。方法实验前采集猴血清并进行血清学检查和PCR检测。选出13只无SIV,STLV1,SRV D和B病毒感染的猴。第一批实验,将SHIV前病毒DNA质粒经肌肉注射到猴体内,每只500μg;SHIV病毒液,经静脉注射到猴体内,每只2ml。病毒质粒和病毒液各接种2只猴。当第一批猴体检出病毒后,10ml感染猴的全血,抗凝后静脉注射到第二批猴体内,当第二批猴检出病毒后再将10ml感染猴的全血静脉注射到第三批猴体内,连续传代4次。每批实验均定期采集血液标本,分别用肝素和EDTA抗凝,进行病毒分离;病毒基因PCR检测;CD4,CD8测定;病毒抗体检测。结果SHIV XJ02170病毒和SHIV XJ02170前病毒DNA质粒在猴体内的传代中均能分离出病毒;从传代猴的血浆和外周血单核细胞(PBMC)中检出了病毒DNA和RNA基因;CD4,CD8测定结果显示有暂时性倒置现象,后变为正常倒置与正常交替出现;在传代的猴血清中检测出特异性HIV病毒抗体。结论SHIV XJ02170病毒与SHIV XJ02170前病毒DNA质粒,均能在恒河猴体内复制。     

Expression of plgR in the tracheal mucosa of SHIV/SIV-infected rhesus macaques

Polymeric immunoglobulin receptors (plgR) are key participants in the formation and secretion of secretory IgA (S-IgA),which is critical for the prevention of microbial infection and colonization in the respiratory system.Although increased respiratory colonization and infections are common in HIV/AIDS,little is known about the expression of plgR in the airway mucosa of these patients.To address this,the expression levels of plgR in the tracheal mucosa and lungs of SHIV/SIV-infected rhesus macaques were examined by real-time RT-PCR and confocal microscopy.We found that the levels of both PIGR mRNA and plgR immunoreactivity were lower in the tracheal mucosa of SHIV/SIV-infected rhesus macaques than that in non-infected rhesus macaques,and the difference in plgR immunoreactivity was statistically significant.IL-17A,which enhances plgR expression,was also changed in the same direction as that of plgR.In contrast to changes in the tracheal mucosa,plgR and IL-17A levels were higher in the lungs of infected rhesus macaques.These results indicated abnormal plgR expression in SHIV/SIV,and by extension HIV infections,which might partially result from IL-17A alterations and might contribute to the increased microbial colonization and infection related to pulmonary complications in HIV/AIDS.     

替换HIV-1衣壳蛋白基因SHIV的构建及其活性测定

将猴免疫缺陷病毒(Simian immunodeficiency virus,SIVmm239)中gag基因的衣壳蛋白部分置换成人免疫缺陷病毒(Human immunodeficiency virus type1,HIV-1 HXBc2)的相应部分,构建出替换了衣壳蛋白基因的人/猿嵌合免疫缺陷病毒(SHIV)原病毒DNA.用此SHIV原病毒DNA转染293T细胞,细胞中能够检测到嵌合病毒基因的转录与翻译;在细胞培养液上清中亦可检测到装配出的病毒颗粒.病毒颗粒形态正常,含有基因组RNA,具有反转录酶活性,嵌合的外源衣壳蛋白能够正确剪切,形成棒状的核心.将此嵌合SHIV病毒感染MT4细胞,病毒能够吸附并进入细胞,能完成反转录过程,但不能增殖.     

恒河猴Mamu-A^＊01基因与SIV／SHIV感染相关的研究进展

SIV／SHIV感染的恒河猴是研究艾滋病及艾滋病药物筛选、疫苗评价较理想的动物模型。MHC在细胞免疫中起着关键作用,研究表明,MHC-I类分子的多态性与SIV／SHIV感染者的疾病进展有着明显的关联作用,Mamu-A^＊01是恒河猴中的一种MHC-I类分子,它可以呈递特定的病毒蛋白片段到细胞的表面,从而激发CTL反应。国外发现Mamu-A^＊01阳性的猴艾滋病恒河猴会出现疾病进展缓慢,存活时间长等特征。本文就恒河猴Mamu-A^＊01基因与SIV／SHIV感染相关的研究进展做一综述,以期进一步加深对MHC在疫苗研究中的作用的了解,并促进更行之有效地对HIV／AIDS疫苗进行评价。