甘露聚糖酶基因在毕赤酵母中的表达及酶学性质研究

采用PCR的方法,以枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis基因组 DNA 为模板,克隆出甘露聚糖酶MAN的成熟肽编码序列,将其插入巴斯德毕赤酵母Pichia pastoris表达载体pPIC9K中,并位于α-因子信号肽序列的下游,获得重组质粒pPIC9K-MAN。重组质粒线性化后用聚乙二醇法导入毕赤酵母Pichia pastoris菌株GS115中,经大量筛选,获得高效分泌表达甘露聚糖酶的毕赤酵母工程菌株MAN22。将此菌株在5 L发酵罐中进行高密度发酵,测定酶活最高达1102IU /mL,同时对重组甘露聚糖酶的性质进行了初步研究。     

灰葡萄孢菌激发子pebC1在毕赤酵母中的分泌表达及其生物活性分析

为了实现激发子PebC1编码基因在毕赤酵母中的分泌表达,采用PCR方法从灰葡萄孢菌BC-4-2-2-1菌株中扩增获得激发子PebC1的编码序列,将其亚克隆至酵母分泌型表达载体pPIC9K中,以此片段构建了pPIC9K-pebC1重组表达质粒。重组表达质粒经Bgl Ⅱ线性化处理,电击转化至毕赤酵母宿主菌GS115,经MD、G418-YPD平板和PCR法筛选,获得了重组毕赤酵母菌GS115/pPIC9K-pebC1。用甲醇诱导重组酵母菌表达目标蛋白,发酵液经SDS-PAGE电泳分析,在约39 kDa处出现特异目标条带。Western blotting检测结果说明,重组表达产物具有良好的抗原性。生物活性检测表明,酵母重组表达蛋白PebC1能够诱导拟南芥和黄瓜幼苗对灰霉病的抗性。     

猪PR-39抗菌肽基因在毕赤酵母中的表达

[目的]在毕赤酵母中表达抗菌肽PR-39基因,获得有抗菌活性的PR-39。[方法]根据酵母和猪密码子偏好性,对其密码子进行优化改造。将经SOE-PCR获得的PR-39基因与毕赤酵母表达载体pPIC9K连接,构建重组载体pPIC9K-PR-39。经SacⅠ线性化电击转化毕赤酵母GS115,取阳性克隆进行髙拷贝转化子筛选和诱导表达。[结果]pPIC9K-PR-39重组质粒构建成功,pPIC9K-PR-39菌株发酵产物检测结果对DH5α大肠杆菌和金黄色葡萄球菌都有抑菌效果。[结论]获得了PR-39基因的重组酵母,并用毕赤酵母系统成功地分泌表达了具有明显抗菌活性的抗菌肽PR-39。     

人胸腺素α1基因在毕赤酵母中的分泌表达

根据质粒pPIC9K中信号肽基因和质粒pPIC3.5K/hTα1-RP,构建表达质粒pPIC9K/S-hTα1-RP,通过电激法转化到毕赤酵母GS115菌株中。甲醇诱导表达融合蛋白,SDS-PAGE和Western blot结果证明,重组基因hTα1-RP在酵母中得到了表达。     

黑曲霉Z6植酸酶基因phyA的克隆及表达

目的:克隆植酸酶基因phyA,构建毕赤酵母表达载体,转化毕赤酵母,并对重组工程菌的表达产物进行初步酶学性质研究.方法:以植酸酶高产菌株-黑曲霉Z6染色体DNA为模板,PCR扩增得到植酸酶基因phyA,序列鉴定后连接到毕赤酵母穿梭载体pPIC9K上,构建重组质粒pPIC9K-phyA,电击转化毕赤酵母KM71,筛选得到重组转化子.对重组工程菌表达产物进行SDS-PAGE分析和酶活性研究.结果:phyA序列分析表明该基因具有典型的植酸酶活性位点保守序列ArgHisGlyAlaArgTyrPro,与NC-BI已发表的植酸酶基因同源性较高,达到94%以上.该序列已提交GenBank,序列号为DQ318022.重组工程菌KM71-phyA7的PCR扩增证实了植酸酶基因已整合到酵母基因组中,植酸酶能有效分泌和表达,粗酶液酶活可达875U/mL.结论:植酸酶基因phyA在毕赤酵母中成功表达,为今后的定向改组奠定了基础.     

人白介素2受体γ链胞外区在巴斯德毕赤酵母中的表达

目的:在毕赤酵母GS115中表达重组人白细胞介素2受体γ链(rhsIL-2Rγ)胞外区。方法:用RT-PCR法从正常人淋巴细胞中获得IL-2Rγ胞外区基因;构建重组质粒pPIC9K-hsIL-2Rγ,用聚乙二醇法转入感受态GS115菌株,MD平板筛选His+转化子,用BMMY培养基诱导表达rhsIL-2Rγ;对重组蛋白进行免疫酶染色、SDS-PAGE及Western印迹鉴定。结果:克隆到目的片段,构建了重组质粒pPIC9K-hsIL-2Rγ;免疫酶染色、Western印迹等结果显示,重组质粒已成功转化GS115,并获得诱导表达的rhsIL-2Rγ。结论:在毕赤酵母GS115中表达了rhsIL-2Rγ,其蛋白条带有上移现象,分子较大,可能其糖基化过度或存在二聚体。     

小鼠IL-35基因毕赤酵母表达载体的构建及表达

目的构建真核酵母表达载体pPIC9K与小鼠IL-35基因的重组质粒pPIC9K-mIL-35-His,在毕赤酵母GS115菌株中诱导表达,并对其进行鉴定。方法以pET-30a-mIL-35为模板,用PCR扩增出IL-35去信号肽基因全序列,并在3'端引入His标签,构建重组质粒pPIC9K-mIL-35-His,经SalⅠ线性化重组质粒后,用电穿孔方法将该基因转染毕赤酵母细胞内。经G418梯度筛选高拷贝转化子,筛选Mut+表型后经PCR进一步鉴定IL-35基因与酵母染色体是否整合。小量诱导表达筛选出高表达菌株,大量甲醇诱导表达,以SDS-PAGE及免疫印迹(Western blot)鉴定蛋白表达。结果小鼠IL-35基因真核酵母表达载体pPIC9K-mIL-35-His构建成功,并且在GS115中通过甲醇诱导表达,经SDS-PAGE及Western blot分析,可见相对分子质量约为65 000的目的蛋白。结论实验所构建的重组质粒pPIC9K-mIL-35-His可在毕赤酵母GS115中正确的表达小鼠IL-35基因。     

人精氨酸酶在毕赤酵母的高效表达、纯化和活性研究

目的：人精氨酸酶（Arginase, Arg）的基因arg在毕赤酵母高效分泌表达,建立相应纯化工艺路线,研究重组人精氨酸酶的活性。方法：将人精氨酸酶基因arg按正确的阅读框架插入到毕赤酵母表达载体pPIC9α信号肽基因后,构建得到重组毕赤酵母表达质粒。转化毕赤酵母GS115筛选高表达菌株。结果：成功构建了酵母表达载体pPIC-Arg,转化毕赤酵母GS115后筛选到分泌表达目的蛋白Arg的菌株,目标蛋白可以分泌到培养基中。经过膜过滤和凝胶过滤层析对培养基上清进行纯化,即可获得纯度达到95%的活性产物。活性测定表明,纯化的Arg比活性为310 IU/mg。结论：成功构建了Arg的毕赤酵母高效表达菌种,建立了目标物质的分离纯化工艺。     

细极链格孢菌peaT2基因在毕赤酵母中的表达及蛋白功能确定

从细极链格孢菌表达文库获得阳性克隆子,序列分析表明,克隆的DNA片段中含有完整的开放阅读框架,将该基因命名为peaT2(GenBank登录号为EF212880)。用PCR法扩增peaT2基因的编码序列并亚克隆到毕赤酵母表达系统的表达载体pPIC9K上,得到重组质粒pPIC9K/peaT2。重组质粒经SacⅠ线性化后用电穿孔法导入到毕赤酵母(Pichia pastoris)GS115中,采用MD、G418-YPD平板和PCR法筛选Mut 表型,获得了分泌表达的重组毕赤酵母。随机挑取一菌株作为表达菌,用甲醇诱导PeaT2蛋白表达。SDS-PAGE及Western blot检测结果均表明PeaT2在毕赤酵母中成功地分泌表达。用peaT2基因的表达蛋白处理小麦种子,生物测定表明,表达蛋白能明显促进小麦的生长,具有蛋白激发子作用。     

人β干扰素-血清白蛋白融合蛋白在毕赤酵母中的分泌表达

利用重叠PCR技术在体外拼接IFN β和HSA基因,将得到的融合基因插入到毕赤酵母分泌型表达载体pPIC9K中,置于启动子AOX1和α交配因子信号肽的作用下,分泌表达融合蛋白IFNβ-HSA。重组质粒pPIC9K-IFNβ-HSA经SalI线性化,电击转化毕赤酵母KM71,经G418筛选得到高拷贝转化子。PCR鉴定后,用甲醇诱导表达,SDS-PAGE和Western blot分析表达的融合蛋白IFNβ-HSA表明该蛋白分子量约为90kDa且具有HSA的抗原性;用细胞病变抑制法测定发酵液上清中融合蛋白的干扰素活性约为640IU/ml。     

乙醛脱氢酶2基因在毕赤酵母中的表达和分离纯化

将乙醛脱氢酶2（ALDH2）基因整合到质粒pPIC9K上,构建重组表达载体pPIC9K-coALDH2,用电转导将表达质粒pPIC9K-coALDH2转化至毕赤酵母GS115中,在毕赤酵母中表达经密码子改造的ALDH2。结果表明：重组基因工程菌GS115（pPIC9K-coALDH2）发酵液中蛋白质量浓度为8.40 mg/L,1 mL发酵液中酶活为11.35 mU。     

钙网蛋白-N58在毕赤酵母中的表达及活性分析

目的：利用毕赤酵母表达系统表达Calreticulin-N58蛋白。方法：利用重叠延伸PCR方法合成Calreticulin-N58基因,构建成分泌型的重组表达载体pPIC9K-CRT-N58。该重组表达载体经SacI线性化后,电激转化入毕赤酵母GSll5,经MD板和不同浓度G418筛选得到多拷贝重组菌株。经甲醇诱导表达目的蛋白,SDS-PAGE分析重组蛋白的表达情况,在鸡胚中进行活性分析。结果：重组质粒pPIC9K-CRT-N58在毕赤酵母中经甲醇诱导能分泌表达CRT-N58蛋白,摇瓶表达量大约为60mg／L,纯化的目的蛋白有显著的血管生成抑制作用。结论：实验成功地在毕赤酵母表达系统中实现了Calreticulin-N58的分泌表达。为Calreticulin-N58蛋白的进一步药用研究奠定了基础。     

猪传染性胃肠炎病毒纤突糖蛋白在毕赤酵母中的分泌表达

目的:利用巴斯德毕赤酵母表达系统表达猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)纤突糖蛋白S。方法:根据GenBank中猪TGEV纤突糖蛋白S全基因设计一对引物,并在5'引物和3'引物中引入EcoRⅠ、NotⅠ酶切位点,2.2kb的目的基因S经PCR扩增后克隆于pBS-T载体,再将S基因经双酶切从T载体切下并与穿梭质粒pPIC9k连接,SalⅠ线性化重组穿梭质粒pPIC9k-S,电转化于毕赤酵母GS115感受态细胞,G418筛选鉴定阳性重组子,经甲醇诱导,SDS-PAGE检测诱导后上清。结果:对pPIC9k-S重组酵母表达载体的测序证实已成功克隆了猪TGEVS基因;重组酵母菌诱导表达后,SDS-PAGE检测结果显示表达产物的相对分子质量约为82×103,且S蛋白以可溶性形式分泌表达于胞外。结论:利用巴斯德毕赤酵母真核表达系统成功表达了猪传染性胃肠炎病毒(河北分离株)纤突糖蛋白S。     

猪干扰素-γ基因在毕赤酵母中的分泌表达

将去除信号肽的猪干扰素-γ（PoIFN-γ）基因置于酿酒酵母α因子分泌信号的DNA序列后, 构建成pPIC9K-α-PoIFN-γ分泌型重组表达载体, 电转化导入毕赤酵母GS115中,经G418筛选后获得2株多拷贝插入的重组子。SDS-PAGE和Western blot分析结果表明,所获得的重组子能够分泌表达出17kD和23kD左右的PoIFN-γ特异蛋白,其表达量为108mg/L,占培养液总蛋白的60%。实验首次在毕赤酵母表达系统中实现了PoIFN-γ基因的分泌表达。     

重组人白细胞介素21在毕赤酵母中的分泌表达及活性分析

为了获得有活性的重组人白细胞介素21(rhIL-21),本研究建立了在毕赤酵母(Pichia pastoris)中分泌表达rhIL-21的技术。首先,通过RT-PCR从人外周血淋巴细胞中扩增IL-21cDNA,克隆到酵母表达载体pPIC9K中,构建了重组酵母表达载体pPIC9K-hIL21 cDNA;然后,线性化的载体转化毕赤酵母表达菌株GS115,经抗性梯度筛选获得了多拷贝重组酵母菌;加入甲醇诱导培养后,SDS-PAGE和Western blotting检测到培养液中有rhIL-21的分泌表达,相对分子量约为16kD,ELISA结果显示摇瓶表达量可达229.28mg/L;表达上清经阳离子交换介质SPSepharose Fast Flow纯化后,目的蛋白纯度达到95%。细胞增殖试验结果显示该rhIL-21联合刀豆蛋白A(ConA)对人淋巴细胞的增殖具有显著的促进作用。本研究首次成功在毕赤酵母表达系统中分泌表达了有生物活性的rhIL-21,为相关疾病免疫治疗的研究奠定了基础。     

超耐热酸性α-淀粉酶基因在多型汉逊酵母中表达及与在毕赤酵母中表达的比较研究

利用毕赤酵母的质粒载体pPIC9K将极端耐热古菌Pyrococcusfuriosus的超耐热酸性α-淀粉酶(Amy)基因转化到多型汉逊酵母HP-6中,获得重组汉逊酵母。经过甲醇进行诱导,表达产物的酶活性检测和SDS-PAGE电泳,证明α-淀粉酶(Amy)在多型汉逊酵母中利用AOX1启动子和α-因子信号肽有效表达并分泌到胞外。该酶的最适反应温度为90～100℃,最适作用pH为4.0～5.0,较之重组毕赤酵母的最适作用pH还低0.5。此外与毕赤酵母的重组蛋白相比,重组汉逊酵母α-淀粉酶不仅菌株筛选简便、周期短,而且具有更容易筛选到高拷贝转化子以及适用于大规模工业发酵等优点。     

人Mn-SOD cDNA的克隆及其在巴斯德毕赤酵母中的表达

以人肝细胞株(L02)总RNA为模板,用RT-PCR扩增出人锰超氧化物歧化酶(hMn-SOD)cDNA,将其插入含有AOX1基因启动子和α分泌信号肽序列的毕赤酵母表达载体pPIC9k,构建重组质粒pPIC9k-MnSOD,转化毕赤酵母GS115,筛选出整合了多拷贝hMn-SOD基因的Mut^ 表型菌株,摇瓶培养,0．5％甲醇诱导表达。SDS-PAGE分析显示,诱导4d的培养上清中hMn-SOD的表达量约为上清总蛋白的32％,酶比活可达247、7u／mg。hMn-SOD在巴斯德毕赤酵母中实现了分泌性表达。     

HrpN基因在毕赤酵母中的克隆表达与活性检测

将hrpN基因插入毕赤酵母表达载体pPIC6αA的醇氧化酶(AOX1)启动子下游,构建重组表达载体pPIC6αA-hrpN,经电击转化毕赤酵母菌株X-33和杀稻瘟素筛选,得到高效分泌表达harpinEa的毕赤酵母菌株。经初步纯化、SDS-PAGE分析和生物测定,结果显示,诱导96h的此重组菌大量表达harpinEa,表达产物具有诱导烟草超敏感反应的功能,活性高于在大肠杆菌中表达的harpinEa。     

里氏木霉内切-β-葡聚糖酶Ⅱ基因在毕赤酵母中的表达及酶学性质研究

采用外显子拼接的方法,以里氏木霉Trichoderma reesei基因组 DNA 为模板,克隆出内切-1,4-β-D-葡聚糖酶II基因egl2的全编码序列,将其插入巴斯德毕赤酵母Pichia pastoris表达载体pPIC9K中,并位于α-因子信号肽序列的下游,获得重组质粒pQY2025。重组质粒线性化后用电穿孔法导入毕赤酵母Pichia pastoris菌株GS115中,经大量筛选,获得高效分泌表达内切葡聚糖酶II的毕赤酵母工程菌株Gp2025。用甲醇诱导培养基进行摇瓶发酵,培养基中内切葡聚糖酶II的活力可达1573.0U/mL,同时对重组内切葡聚糖酶II的性质进行了初步研究。     

黑曲霉果胶裂解酶基因毕赤酵母在Pichia pastoris GS115中的表达

利用RT-PCR技术从黑曲霉(EIM-6)中扩增得到去除信号肽的果胶裂解酶基因A,将其插入到毕赤酵母表达载体pPIC9k上,构建重组表达质粒pPIC9K-pelA,电击转化毕赤酵母GS115,得到了表达成功的工程菌株。用终浓度为1.5%的甲醇对其进行诱导,将发酵上清液浓缩后,用盐酸法测定其酶活可以达到2.3U/mL。通过对重组毕赤酵母诱导表达产物进行SDS-PAGE鉴定,发现重组毕赤酵母分泌了1个约38kD的蛋白,与该酶基因产物的理论值相符,并通过水解圈法测定验证,均说明果胶裂解酶得到正确的分泌表达.