基于重叠延伸PCR法的定点突变技术

目的:建立一种高效而经济的定点突变方法。方法:采用重叠延伸PCR定点突变技术,引物设计时引入目的突变,以前两次PCR产物为模板,进行第三次PCR,即可获得突变后的目的DNA片段。将此片段连入pMDTM18-T载体后测序验证突变结果。结果:DNA测序表明,待突变位点已由ATTGG突变为ATTTT。结论:成功实现了目的位点的定点突变,重叠延伸PCR法是一种高效且经济的定点突变方法。     

重叠延伸PCR法构建小鼠IL-35单链融合基因及其真核表达载体

目的:构建小鼠IL-35单链融合基因及其真核表达载体.方法:将10 ug LPS和等体积的完全福氏佐剂乳化后皮下注射C57BL/6小鼠,7天后,取小鼠脾脏,提取脾细胞总RNA,通过RT-PCR克隆小鼠EBI3和IL-12p35 cDNA;采用重叠延伸PCR,通过编码疏水性多肽接头(Gly4Ser)3的DNA序列连接小鼠EBI3全长基因和IL-12p35成熟肽基因,构建小鼠IL-35单链融合基因(Inouse sigle chain IL-35,mscIL-35),并将其克隆至pcDNA3.1/V5-His TOPO TA载体.通过酶切和测序鉴定阳性重组载体.结果:DNA序列分析结果表明:小鼠IL-35单链融合基因中EBI3、IL-12p35和linker的连接顺序、方向及序列完全正确.结论:成功构建了小鼠IL-35单链融合基因及其真核表达载体,为进一步探讨IL-35的生物学功能奠定了基础.     

改进重叠延伸PCR技术构建定点双突变

目的:目的DNA片段中快速构建位点不同的定点双突变体。方法: 借鉴DNA shuffling技术中DNA小片段延伸扩增获得全长DNA片段的工作原理,与常规基因定点突变技术相结合,改进重叠延伸PCR技术构建定点双突变。结果:对嗜酸热脂肪杆菌(Alicyclobacillus acidocaldarius)Tc-12-31的甘露聚糖酶基因AamanA中两个可能的活性位点E151和E231进行双点突变,先后经过无引物和有引物两步PCR,扩增获得全长DNA,测序结果表明得到预期的定点双突变体;酶活性检测和薄层层析结果表明双点突变体丧失了酶的活性。结论: 改良的重叠PCR技术,能经济、简便、高效地获得双点定点突变体,在酶的催化机理的阐述、蛋白质结构改造等分子生物学领域中具有较高的应用价值。     

重叠延伸PCR对DNA片段进行定点双突变

探讨如何利用重叠延伸PCR对同一靶DNA片段中的两个不同位点实施联合突变。先用野生型DNA作模板,通过一轮重叠延伸PCR,获得突变一个预期位点的DNA片段,再用此突变DNA片段作模板,通过另一轮重叠延伸PCR获得两个预期位点均突变的DNA片段。重叠延伸PCR能对DNA片段进行双突变甚至多点突变,具有简便、快速、经济等特点,在阐明基因的调控机理、改造蛋白质结构等分子生物学领域中具有极大的应用价值。     

用改进的重叠延伸PCR技术构建三位点突变载体

目的:改进传统重叠延伸PCR方法,实现引入3个不同DNA突变位点的简便的多位点定点突变。方法:根据前期构建的包含人线粒体12S rRNA(NC 01290)3个热点突变位点的野生型质粒序列,利用Muta Primer 2.0软件设计针对3个热点突变位点的3对互补的定点突变引物,以野生型质粒为模板,结合重叠延伸PCR反应和冷冻析出法,产生同时包含3个突变位点的突变目的片段,酶切后克隆到载体中,测序确证是否突变成功。结果:DNA测序证实3个不同突变位点同时成功引入,定点突变载体构建成功。结论:用改进的重叠延伸PCR技术能简便、高效地获得多位点定点突变载体,在分子生物学领域有较高的使用价值。     

改进重叠延伸法引入DNA定点突变的新方法

目的：改进重叠延伸PCR法,实现一种引入DNA定点突变的准确简便方法。方法：通过应用不同的扩增酶和反应体系,以重叠延伸PCR的方法产生引入突变位点的DNA片断,然后再亚克隆到载体中。该文以人cyclin D1启动子的NF-κB位点（-39/-30）为例。结果：通过DNA测序证明定点突变成功引入。一次引入4个突变碱基。突变引入率为100%。     

转录因子AP-4基因真核表达载体构建及表达分析

本研究利用生物信息学分析AP-4与胃癌患者临床病理信息的相关性,根据GenBank中人AP-4基因cDNA序列设计并合成特异性引物,以胃癌细胞总RNA逆转录的cDNA为模板,利用高保真酶扩增AP-4基因CDS (Coding DNA sequence)序列并构建入pcDNA3.1+载体,并通过限制性内切酶酶切分析和测序法进行进一步验证;脂质体法将AP-4重组表达载体及对照pcDNA3.1+载体转染胃癌细胞,qRT-PCR(Quantitative real time polymerase chain reaction)和Western blotting检测分别检测AP-4在m RNA和蛋白水平的表达。生物信息学分析发现,AP-4的表达与胃癌分期及预后显著相关;酶切及测序分析表明,转录因子AP-4真核表达载体构建成功,并能够在胃癌细胞中实现转录和蛋白水平的高效表达。此研究为深入研究转录因子AP-4在胃癌等肿瘤发生发展中的作用及分子机制奠定了基础。     

改进的多片段重叠延伸PCR制作基因多位点突变

为在研究工作中提高制作目标基因多位点突变体的效率,对常规重叠延伸PCR进行适当改进:对于相距较近的两个突变位点,只需设计一对突变引物各自涵盖其中一个位点即可一次突变;对于相距较远的两个位点,可以采用三片段重叠延伸PCR的办法解决;两者结合则可一次性突变多个位点。以制作RBCT的6位点突变体PSM6为例,利用上述策略,设计两对突变引物;采用OE-PCR法,第一轮PCR扩增出三个片段,第二轮PCR同时利用三片段重叠延伸产物作为模板扩增出目标基因突变体,再按常规分子克隆方法将其连入质粒载体。经测序检测,发现得到了预期的目标基因多位点突变体。因此,采用灵活的引物设计策略,结合多片段重叠延伸PCR即可一次性制作基因的多位点突变体,此方案可解决研究工作中大多数多位点突变问题。     

重叠延伸PCR法扩增EB病毒BZLF1N-BLRF2融合基因及生物信息学分析

利用重叠延伸PCR技术扩增EB病毒BZLF1N-BLRF2融合基因,构建原核表达载体pGEX-4T-1-BZLF1N-BLRF2,并进行了蛋白的诱导表达。通过序列测定和ORF软件分析,该融合基因含有1个1 005 bp的ORF,编码335个氨基酸。应用生物信息学方法,对该融合基因编码的蛋白ZtaN-p23从氨基酸组成、理化性质、信号肽、疏水性/亲水性、二级结构、亚细胞定位、功能域和高级结构等方面进行了预测和分析。结果表明,该蛋白的预测分子量为46.2 kD,理论等电点约为8.97,是亲水性蛋白,推测它定位于细胞质中。序列分析表明,该蛋白可能具有信号转导、转录调控、免疫应答等功能。预测的二级结构及三级结构都表明该蛋白含有较多的不规则卷曲和α-螺旋,三级结构上呈对称形状。     

重叠延伸PCR法合成EV71 VP1-LTB融合基因及其原核表达

目的用重叠延伸PCR（overlap extension PCR）法获得人肠道病毒71型vp1与大肠埃希菌不耐热肠毒素B亚单位（ltb）的融合基因,构建EV71 VP1-LTB融合表达质粒并在原核系统表达。方法设计14对引物通过重叠延伸PCR技术合成vp1基因,以ETEC（44815）质粒DNA为模板,PCR扩增ltb基因,将vp1基因与ltb基因连接并测序,连接产物插入原核表达质粒pBEX,构建重组质粒pBEX-VP1-LTB,转化E.coliB1221（DE3）进行表达,SDS-PAGE及W estern blotting分析其表达。电转法将重组质粒转入双歧杆菌。结果合成的vp1基因全长891 bp,测序结果与预期相符,重组表达质粒pBEX-VP1-LTB经PCR及双酶切鉴定,表明构建正确;目的蛋白在E.coliBL21（DE3）中获得了表达,Western bloting分析结果表明该蛋白具有与EV71 VP1抗体的反应原性;电转法成功将重组质粒转入双歧杆菌。结论应用重叠延伸PCR技术成功构建了EV71 VP1-LTB融合表达质粒,并在E.coliBL21（DE3）中获得有生物学功能的VP1表达产物,重组质粒双歧杆菌转化及VP1-LTB融合蛋白的表达研究,为研制EV71分子内佐剂疫苗打下了基础。     

利用套叠PCR技术改造人可溶性TRAIL cDNA片段及真核表达载体的构建

利用套叠PCR技术对可溶性TRAIL基因片段(sTRAIL,114aa-281aa)的“KEX2”位点及“ATTTA”位点分别进行改造,并构建真核表达载体;结果表明:成功获得了3种突变基因:sTRAILK、sTRAILA以及sTRAILAK,并成功构建了4种分泌型酵母表达载体:pPICZα-A-sTRAILK,pPICZα-A-sTRAILA,pPICZα-A-sTRAILAK以及pPICZα-A-sTRAIL.     

基于PCR的质粒快速定点诱变方法建立与评价

基因突变对生命的进化具有重要意义,针对质粒的DNA定点诱变技术也是基因工程、蛋白质工程研究中的重要手段之一。为了提高质粒定点诱变的效率,本研究利用引物部分重叠的设计方案,使用Tm值相对固定的引物设计模式,将同一引物分为重叠区（Tm=50±2℃）和非重叠区（Tm=60±2℃）,并在严格控制模板用量（2 pg/kb）的基础上,通过20个PCR循环对目标质粒进行定点诱变扩增,随后取0.5 μL产物直接用于转化。在FastPfu Fly酶系中,利用此法构建了6个含碱基替换、缺失和插入的质粒,均获得成功,突变效率可达96%以上,阳性克隆获得数达70个以上。此外,利用4种不同PCR酶系对该法的适用性进行了评价,结果表明突变效率均可达93%以上,阳性克隆获得数均在10个以上。通过适当增加PCR模板用量（10 pg/kb）并使用纯化后的PCR产物进行转化,该法可适用于转化效率大于106（cfu/μg）的任意感受态细胞,对应的突变效率可大于91%,阳性克隆获得数大于20。根据本法的作用原理,该方案适合质粒中10～20 bp（因重叠区GC含量及碱基序列的不同而改变）以内的任意碱基替换和插入,以及任意长度的DNA片段缺失。且具有通用性强、耗时少、诱变成功率高、成本低、对感受态及转化效率无特殊要求等优点,适合各实验室的日常研究使用。     

优化重叠PCR法进行单链抗体基因扩增和点突变

利用重叠PCR技术扩增单链抗体基因或位点突变是抗体文库构建或稳定表达的关键和难点,国内外文献未见其方法学的系统报道.以不同VH、VL和Linker基因为拼接模板进行重叠PCR,针对影响重叠PCR扩增的拼接类型,引物设计,反应条件等进行优化.结果表明两段重叠连接比三段更容易实现,且扩增效果好;引物的互补序列长度一般应大于15 bp,且在18～24 bp 时扩增效果最好;退火温度在52～60℃,Mg2+浓度在1.5～2.5 mM时对拼接的效果影响较小;直接或间接使用拼接模板均可以实现重叠PCR的扩增.利用优化策略,首次构建了抗除虫菊酯的scFv基因文库并引入抗XAC糖蛋白scFv基因的点突变,为除虫菊酯抗体文库构建和抗XAC重组抗体的稳定表达奠定了基础.     

利用套叠PCR和高保真DNA聚合酶进行基因多位点突变的研究

利用套叠PCR和高保真DNA聚合酶对人工合成的牛口蹄疫病毒VPI基因(FMDV-VPI,Foot-Mouth Disease Vims-VPI)的5个突变位点进行修复,修复的成功率为100％。     

利用套叠PCR技术改造酵母表达载体pAO815的研究

利用套垒PCR技术将α-factor信号肽基因插入pA0815之EcoRⅠ位点,构建成分泌型表达载体pA0815α-A。在不改变原克隆位点EcoRⅠ的条件下,借助pA0815之第873位的HindⅢ位点,将pA0815AOX1启动子873-940片段连同α-factor信号肽基因序列（246bp）插入pA0815之HindⅢ/EcoRⅠ之间,构建成含α-factor信号肽基因的分泌型表达载体pA0815α-A。