基因体外随机突变的两种方法的研究

引导蛋白质功能进化常用的方法是模拟和加速蛋白质基因自然重组的进程,即在蛋白质的基因中引进随机突变。因此,蛋白质基因体外随机突变的方法影响着引导蛋白质功能进化的效果。本文描述两种简单而有效的基因体外随机突变发生方法。一种是化学诱变法：将蛋白质基因用1.0mol/L硝酸钠在室温下处理1h,然后将突变基因插入质粒,导入大肠杆菌中表达;另一种方法是延伸诱变法：将10个随机氨基酸短肽基因连接到蛋白质基因上,使蛋白质C末端连接随机短肽,通过增大蛋白质分子来达到延伸蛋白质序列空间的目的。来自嗜热脂肪芽孢杆菌的过氧化氢酶I基因用这两种方法进行了随机突变,获得了大量突变体酶基因。通过对突变体酶基因表达产物性质变化的测定,证明这两种基因诱变方法能够有效地诱发基因的随机突变。 Abstract:Two novel and simple methods were described in the paper for in vitro mutagenesis and recombinatin of polynucleotide sequence to mimic and accelerate nature's recombination strategy to direct the evolution of protein function.One is chemical mutagenesis: protein gene was inserted into M13mp18,and the single－stranded DNA was treated with 1．0mol/L sodium nitrite at room temperature for 1h for mutation and converted into duplex,then the mutated gene was ligated to plasmid for expression.Another is elongation mutagenesis: random peptide of 10 amino acid was connected at C－terminal of protein to expand the sequence space by increasing proteins dimensions,then the elongation mutated gene expressed in E.coli.We have used these two methods to recombine the thermostabilized catalase I, and these two methods were found to be efficient to form a lot of catalase I mutates by identifying the properties of mutated enzyme.     

人肌球蛋白7A基因非同义单核苷酸多态性位点潜在致聋突变的预测分析

目的:人肌球蛋白7A(MYO7A)基因是遗传性耳聋分子筛查的候选基因之一。从已知的MYO7A非同义单核苷酸多态性(ns SNPs)位点数据库中筛选可能与致病表型相关的ns SNPs位点,以提高MYO7A基因耳聋分子诊断的有效性和准确率。方法:首先,从NCBI数据中心的db SNP数据库(db SNP)和Deafness Variation Database数据库获得MYO7A基因的SNPs数据和基因的相关信息;然后,通过SIFT、Poly Phen-2、PANTHER、Ph D-SNP、Mutation Taster、SNPGO和Mut Pred软件进行ns SNPs表型致病性分析,预测潜在致病位点;接着,应用Clustal X2和Gene Doc软件进行同源氨基酸序列比对,分析潜在致病的ns SNPs位点保守性;最后,应用Swiss Model平台选择性地对某些突变蛋白质的三维结构进行建模,并分析结构域的变化。结果:预测出MYO7A的104个高风险致病的ns SNPs位点,包括25个已报道的耳聋相关ns SNPs位点;高风险致病的ns SNPs位点中,有42个位于肌球蛋白马达(myosin motor)结构域,其中12个预测有致病风险的ns SNPs位点与MYO7A基因致聋的突变研究报道一致。肌球蛋白马达结构域中包含30个新预测的潜在致病性ns SNPs位点,其中仅L366P位点在7个预测软件中具有高度一致性。通过对L366P位点位点突变前后的三维模型构建,发现存在蛋白结构的改变,且同源性比对结果显示了该位点的高度保守性。结论:MYO7A的L366P为潜在高风险致病性ns SNP位点,推测该基因突变可能与耳聋表型相关。本研究所采用的分析筛选方法对MYO7A基因突变的临床筛查及其他致病基因的ns SNPs筛选具有重要的参考价值。     

人参多肽基因的酶法体外随机——定位诱变

本文报道了酶法体外随机——定位诱变人参多肽基因的原理和方法。该法把传统的随机诱变和现代的定位诱变融合起来,可灵活控制基因突变的随机性和定位性。我们用双脱氧末端终止法测定了三个突变株的结果证实了该法的合理性和可行性,     

SNP标记对角膜混浊小鼠 突变相关基因的精细定位

为深入研究前期工作中以ENU诱变技术建立的遗传性角膜混浊突变系小鼠(B6-Co)的遗传机制, 利用 SNP标记对其突变基因进行精细定位, 将该品系中具有角膜混浊表型的小鼠(B6-CoP)与DBA/2小鼠(简称D2)配种得到F₁代, 再回交D2亲本品系得到F₂代, 提取F₂代角膜混浊小鼠鼠尾DNA。在MGI数据库中选取小鼠13号染色体已定位区间附近5个在C57BL/6(简称B6)和D2两个品系之间有差异的SNP, 应用聚合酶链反应-限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)技术及连锁分析方法对B6-Co小鼠突变基因进行精细定位。结果表明: B6-Co小鼠突变基因定位于13号染色体上112 546 283~113 397 654 bp之间, 因该区间内有5个已知基因, 其中Map3k1基因与小鼠眼睛形态生成和眼睑闭合密切相关, 提示Map3k1是B6-Co小鼠突变的强力候选基因。     

紫云英根瘤菌糖基转移酶基因exoL的定位突变及序列分析

利用转座子Tn5对质粒pJB-B6既定位诱变,经同源交换,筛选获得一株Rhizobiumhuakuii107胞外糖合成缺陷（Exo－）变种RH983。三亲本杂交实验显示,pJB-B6及其亚克隆pJB-B601均可纠正变种RH983的胞外多糖合成缺陷。pJB-B601的2．3kbDNA片段的核苷酸顺序表明,该片段内存在一个完整的开放阅读框架（ORF）。ORF全长1170bp,编码390个氨基酸的蛋白,该蛋白与Rhi－zobiummeliloti的糖基转移酶ExoL有56．7％．的同源性,称为RhexoL。利用启动子探测质粒,构建了RhexoL-lacZ转录融合子,发现RhexoL基因5’上游有较强的启动子活性。     

玉米黄绿叶突变体表型鉴定及基因初步定位

叶色突变体是研究光合作用及叶绿体发育的重要材料。开展玉米叶色突变体的相关研究,对光形态建成、光合作用、基因功能注释、蛋白质功能及抗逆性机制的阐述具有重要的理论意义。本研究以黄绿叶突变体ygl-F17138为材料,与玉米自交系B73进行杂交,构建F2分离群体,进行遗传效应分析和基因初步定位。遗传分析表明,该突变性状由单个隐性核基因控制,且能稳定遗传。利用BSR-seq结合连锁分析的方法将该基因初步定位在第3条染色体上一个约9.2 Mb的区间内(chr.3:173087201~182203992),查询该区间内已知基因功能注释,未发现类似前人报道的调控黄绿叶性状基因,说明YGL-F17138基因可能是一个控制玉米黄绿叶发育未被挖掘的候选基因。     

紫云英根瘤菌糖基转移酶基因exoL的定位突变及序列分析

利用转座子Ｔｎ５对质粒ｐＪＢ－Ｂ６定位诱变,经同源变换,筛选获得一株Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍｈｕａｋｕｉｉ１０７胞外多糖合成缺陷变种ＲＨ９８３。三亲本杂交实验显示,ｐＪＢ－Ｂ６及其亚克隆ｐＪＢ－Ｂ６０均可纠正变种ＲＨ９８３的胞多多糖合成缺陷。     

同义突变SND1慢病毒质粒的构建及回复表达

[目的]构建抵抗shRNA的同义突变SND1慢病毒质粒,并在SND1敲低的卵巢癌细胞系中回复表达SND1。[方法]依据密码子的简并性,针对shRNA识别的序列(TCTCGTCTCAAACTCTATTTG)设计同义突变序列(TAGGTATAACTTTAACCTGCT)并通过重叠延伸PCR的方法将同义突变序列引入SND1的编码序列中,得到recombination SND1(rSND1)目的片段,与pLVX-IRES-Hyg载体连接。测序验证pLVX-FLAG-rSND1质粒序列。pLVX-FLAG-rSND1质粒与包装质粒共转染293T细胞,获得携带FLAG-rSND1的慢病毒毒粒。用慢病毒感染SND1敲低的卵巢癌SKOV3-sh SND1-2细胞株,经潮霉素B筛选后,用Western Blot检测FLAG和SND1的表达。[结果]抵抗shRNA的真核pLVX-FLAG-rSND1重组慢病毒质粒构建成功,可检测到FLAG及SND1的表达。[结论]成功构建了同义突变SND1的pLVX-FLAG-rSND1质粒并在卵巢癌细胞中回复表达,为继续研究SND1蛋白在卵巢癌中的功能奠定了基础。     

成骨不全Ⅰ型家系的基因检测和COL1A2基因新突变的致病性鉴定

为了揭示成骨不全(Osteogenesis imperfecta,OI)Ⅰ型家系的分子遗传学发生机制,文章采用PCR-DNA直接测序法,对患儿COL1A1和COL1A2基因共103个外显子(E)进行突变检测。结果显示:患儿COL1A1基因未发现任何病理性突变,而在COL1A2基因E19内发现一新的杂合错义突变(p.G316C),该突变来自其父,而其母正常,其他表型正常的6位亲属也均未发现该突变;通过DHPLC(Denaturing high performance uid chromatography)筛检,发现患儿与其父均有异常双峰,而其母和所有正常对照均为正常单峰;通过ASA(Allele specific amplification)筛检,患儿与其父均有391 bp的特异扩增带,而其母和所有正常对照均未见特异扩增带;保守性分析结果显示,该突变位点所在甘氨酸在进化上具有高度保守性;SIFT和Poly Phen-2软件预测结果显示,新突变造成的结果是"有害的"和"很可能有害"。上述结果均说明COL1A2基因c.946GT/p.G316C新突变是导致OI-Ⅰ型的致病性突变,是引起患儿发病的真正内因。患儿父母若再次孕育,可在孕早期进行产前基因诊断或孕前期进行PGD(Preimplantation genetic diagnosis)予以防患。     

亚硝酸钠体外随机突变枯草杆菌纤溶酶基因及其产物性质研究

通过对目的基因随机突变,希望获得纤溶酶活性提高的突变体。方法:采用一种简单方便的突变方法--亚硝酸钠直接突变含目的基因的质粒,然后转化受体菌获得突变体。在亚硝酸钠浓度为40mmol／L,温度为37℃,反应时间为1h条件下,突变带枯草杆菌纤溶酶基因的质粒pUBH,转化受体菌DB403,得到大量突变体。随机挑取约1600个转化子,用纤维平板法筛选。结果:获得酶活不同程度改变的突变体,其中有纤溶酶活性增加高达一倍的突变体;分离纯化了活性最高的突变酶,并证明其活性提高是与比活性提高相关的;序列分析该突变体发现碱基发生8处改变,而氨基酸只发生1处改变即V298A;和序列分析一致,SDS／PAGE和Westernblot检测结果显示其分子量和抗原性质没有改变。同时研究了诱变剂浓度、反应温度和作用时间对随机突变的影响。     

体外突变新技术：DNAShuffling技术

体外DNAshuffling技术是一种快速、高效并且衫的分子定向进化技术,和以往的基因突变技术不同,它是一种高通量的突变筛选技术,可以对靶序列进行多次重组和选择,利用该技术建立的突变文库（嵌合文库）具有容量大、多样性好等优点,且更易于实现有益突变的积累。DNAshuffling技术已广泛应用于酶、药物蛋白及其它功能蛋白的改造,并取得了相当大的成功,显示了该技术在蛋白质改造和分子育种方面的潜在应用价值。     

cIts857基因的克隆、修饰及温敏诱导表达载体

从噬菌体λＤＮＡ（ｃＩｉｎｄｌｔｓ８５７Ｓａｍ７）克隆出９９０ｂＰ的ｃＩｔｓ８５７基因,经缺失,点突变等修饰改造和ＤＮＡ序列测定,获得了带有自身启动子区的修饰型ｃＩｔｓ８５７基因（７７０ｂｐ）。进而利用它构建大肠杆菌表达载体ｐＢＬＭＶＬ２和一套含３种不同阅读框架ｌｉｎｋｅｒ区的表达载体ｐＢＬＭＦＶ４、５Ｂ、６。上述表达载体;用于表达人工合成的牛生长激素（ｂＧＨ）、人干扰素－γΔＣ－１３和酵母ｐｈｏ８５等外源基因,都观察到这些基因产物的温敏表达。这些表明,克隆、修饰并组建到表达载体中的λ噬菌体ｃＩｔｓ８５７基因表达出具有功能作用的转录阻遏蛋白,使上述ＰＬ启动子控制下的大肠杆菌表达载体可经温敏诱导而高效表达外源基因产物．     

cIts857基因的克隆,修饰及温敏诱导表达载体

从噬菌体λＤＮＡ克隆出９９０ｂｐ的ｃＩｔｓ８５７基因,经缺失,点突变等修饰改造和ＤＮＡ序列测定,获得了带有自身启动子区的修饰型ｃＩｔｓ８５７基因（７７０ｂｐ）。进而利用它大肠杆菌表达载体ｐＢＬＭＶＬ２和一套含３种不同阅读框架Ｉｉｎｋｅｒ区的表达载体ｐＢＬＭＦＶ４、５Ｂ、６。上述表达载体,用于表达人工合成的牛生长激素、人干扰素－γ△Ｃ－１３和酵母ｐｈｏ８５等外源基因,都观察到这些基因产物的温敏表达。     

Ⅰ型牛疱疹病毒TK-/gE-基因双缺失突变株生物学特性

目的构建Ⅰ型牛疱疹病毒（BHV-1）的TK-/gE-双缺失突变株,检测其生物学功能,为治疗牛传染性鼻气管炎提供参考。方法构建了带有EGFP表达盒的BHV-1 TK-/gE-双缺失突变株。通过southern杂交、蛋白质斑点印迹、空斑试验、MDBK细胞增殖实验等技术方法,对重组基因所构成病毒突变株的生物学特性进行鉴定。结果 Southern杂交及蛋白斑点印迹表明,课题组成功构建了带有EGFP表达盒的双缺失突变株;该突变株具有与野生株相当的繁殖力,但TK-/gE-成功缺失,毒力大幅减弱;BHV-1 TK-/gE-遗传稳定,不会返强。结论本项目组成功构建了Ⅰ型牛疱疹病毒（BHV-1）的TK-/gE-双缺失突变株,该缺失株具有良好的安全性和稳定性,为该突变株进一步作为生物安全疫苗和多价病毒载体提供了依据,为预防和治疗牛传染性鼻气管炎提供了技术支持。