提高糖基化的酶蛋白可结晶性研究

糖基化修饰是一类重要的翻译后修饰,对蛋白质的表达调控、折叠、分泌和功能等方面发挥着关键作用。酶是由活细胞产生的具有高度特异性和高效催化性的生物催化剂,酶的糖基化修饰对其生物催化特性和稳定性具有重要影响。研究糖基化修饰对酶蛋白的影响机制需要获取糖基化酶蛋白的结构,X-射线晶体衍射学是获得结构信息的重要技术手段,在糖基化酶蛋白的晶体衍射研究中,复杂、多样、不均一的糖基化修饰限制了该类酶的晶体生长,这是影响糖基化的酶蛋白结构解析的关键瓶颈问题。因此,如何提高糖基化的酶蛋白可结晶性是当前蛋白质结构研究的热点和难点。糖苷酶的去糖基处理、糖基转移酶抑制剂的引入和异源表达体系优化等手段都是当前研究领域提高糖基化的酶蛋白可结晶性的重要策略,这些手段可以在避免损害糖基化的酶蛋白稳定性和催化活性的同时提高其均一性。     

提高糖基化的酶蛋白可结晶性研究 *

糖基化修饰是一类重要的翻译后修饰,对蛋白质的表达调控,折叠,分泌和功能等方面发挥着关键作用.酶是由活细胞产生的具有高度特异性和高效催化性的生物催化剂,酶的糖基化修饰对其生物催化特性和稳定性具有重要影响.研究糖基化修饰对酶蛋白的影响机制需要获取糖基化酶蛋白的结构,X-射线晶体衍射学是获得结构信息的重要技术手段,在糖基化酶蛋白的晶体衍射研究中,复杂,多样,不均一的糖基化修饰限制了该类酶的晶体生长,这是影响糖基化的酶蛋白结构解析的关键瓶颈问题.因此,如何提高糖基化的酶蛋白可结晶性是当前蛋白质结构研究的热点和难点.糖苷酶的去糖基处理,糖基转移酶抑制剂的引入和异源表达体系优化等手段都是当前研究领域提高糖基化的酶蛋白可结晶性的重要策略,这些手段可以在避免损害糖基化的酶蛋白稳定性和催化活性的同时提高其均一性.     

SARS冠状病毒PLpro蛋白酶的结构与功能

SARS冠状病毒基因组编码2种病毒蛋白酶,即木瓜样蛋白酶（PLpro）和3C样蛋白酶(3CLpro).其中,PLpro蛋白酶结构与功能研究是近年来冠状病毒分子生物学研究的热点之一. PLpro蛋白酶参与SARS冠状病毒1a(1ab)复制酶多聚蛋白N端部分的切割加工,是SARS冠状病毒复制酶复合体(RC)形成的重要调节蛋白分子;最新研究表明,SARS冠状病毒PLpro蛋白酶是一种病毒编码的去泛素化酶（DUB）,对细胞蛋白具有明显去泛素化作用;而且对泛素(Ub)和泛素样分子ISG15均具有活性. PLpro蛋白酶对宿主抗病毒天然免疫反应具有负调节作用,是SARS冠状病毒的一种重要干扰素拮抗分子.PLpro蛋白酶是一种多功能病毒蛋白酶.本文结合作者课题组研究工作,对SARS冠状病毒PLpro蛋白酶结构和功能研究最新进展进行综述.     

基于TurboID的植物蛋白邻近标记实验方法

邻近标记作为近些年发展起来的一项检测活细胞内蛋白互作关系和亚细胞结构蛋白组的新型技术,已成功应用于多种动植物体系的研究。该技术通过给诱饵蛋白融合一个具有特定催化连接活性的酶,在酶的催化作用下将小分子底物(如生物素)共价连接到酶邻近的内源蛋白,通过富集和分析被标记的蛋白可获得与诱饵互作的蛋白组。经定向进化产生的生物素连接...     

副粘病毒血凝素-神经氨酸酶蛋白结构与功能的研究进展

副粘病毒的血凝素-神经氨酸酶和融合蛋白具有重要的生物学活性,其中前者具有受体识别活性、神经氨酸酶活性和促进融合蛋白的细胞融合作用.本文对近年来血凝素-神经氨酸酶结构和功能方面的研究进展进行了综述.     

乙型肝炎病毒多聚酶末端蛋白的结构和功能研究

乙肝病毒蛋白结构和功能是当前研究乙肝病毒的热点之一。HBV多聚酶的末端蛋白在病毒复制过程中起重要作用,主要包括前基因组RNA包装和DNA合成的蛋白引发等,并可抑制细胞对干扰素的反应。本文综述了乙肝病毒多聚酶末端蛋白的结构和功能,还比较了乙肝病毒与逆转录病毒多聚酶结构和功能的异同。     

人源γ-分泌酶的重要亚基nicastrin蛋白表达与纯化

γ-分泌酶是具有天冬氨酸内切酶活性跨膜蛋白复合物,与阿尔茨海默症的病理特征的β-淀粉样蛋白(amyloid proteinβ,Aβ)生成有关。Nicastrin(NCT)是Ⅰ型单次跨膜糖蛋白,具有709个氨基酸。它是γ-分泌酶的重要组分,具有募集和结合γ-分泌酶底物的功能,参与γ-分泌酶的组装过程。本研究中,利用昆虫杆状病毒表达系统表达人源NCT全长和胞外结构域,得到了纯度较好的蛋白,用于晶体初筛。由于nicastrin自身高度糖基化,使用Endo H和PNGase F去糖基化酶进行体外脱糖基作用,使得蛋白均一度提高,纯化到较稳定的胞外结构域蛋白,为下一步对人源nicastrin蛋白进行结构生物学研究奠定了基础。     

超高温菌酶构象的刚性和热稳定性的相互关系

超高温菌酶具有优良的高温热稳定性,其酶蛋白结构中的氢键、离子对、盐桥和极化表面面积等均高于中温酶,有利于增强其构象的刚性,从而增加其热稳定性。超高温菌酶在中温时比它们的中温同系物更具有刚性,并且刚性是超高温菌酶在高温环境下保持其热稳定性的先决条件。     

多结构域酶的结构域进化关系

近年来随着生命科学新技术、新方法的涌现,酶蛋白结构和功能研究逐渐深入。具有多结构域的酶蛋白中各个结构域常具有独立的催化或结合底物的功能,在重组酶和组合生物合成研究中具有极大的研究和应用价值。这些结构域功能和组织方式的多样性,是研究分子进化的基础。对结构域进行进化分析对于研究多结构域酶的进化过程、功能相近酶之间的关系,以及对酶的分类鉴定等有重要意义。本文从结构域的重复性、结构域的水平基因转移和结构域的重组等方面出发,对多结构域酶中结构域之间进化关系的研究成果进行综述。     

工业酶结构与功能的构效关系

工业酶是绿色生物制造的"芯片",支撑着下游数十倍甚至百倍的产业。解析工业酶结构与功能关系是对其设计改造并应用于工业生产的基础。近年来随着蛋白结构解析技术和计算模拟技术的发展,酶结构与功能的构效关系得到更加深刻的认识,使得酶理性设计,甚至是从头设计成为可能。文中围绕酶结构的可塑性及其催化功能的多样性,综述工业酶结构与功能构效关系的研究进展及应用,并展望该领域的未来发展前景。     

黑曲霉EIM-6 pelA基因的克隆及生物信息学分析

目的:克隆黑曲霉EIM-6果胶裂解酶A基因pelA,用于分析果胶裂解酶A的功能与结构。方法与结果:根据GenBank上黑曲霉pelA保守序列设计引物,采用RT-PCR获得黑曲霉EIM-6pelA基因;序列分析表明,pelA基因具有4个内含子,开放读框为1140 bp,编码379个氨基酸残基,含有由20个氨基酸残基构成的信号肽序列;生物信息学分析表明,果胶裂解酶A为具有一定亲水性的稳定酸性分泌蛋白,具有明显的跨膜结构域,β片层结构是该蛋白的主体结构,空间结构是由反平行的β片层结构为基础包围组成的大环,保守功能区域为Pec_lyase_C结构域。结论:克隆获得黑曲霉EIM-6pelA基因,并进行了生物信息学分析,为蛋白质工程改造果胶裂解酶A奠定了基础。     

人膜相关蛋白TEB4的结构及其E3连接酶活性

TEB4（MARCHIV）是酵母Doa10的同源体，作为E3连接酶参与内质网相关蛋白的降解。TEB4和酵母Doa10定位于内质网上，包含一个环指域和多个跨膜域。这个环指结构位于蛋白的N端，具有特殊的CAHC3结构。在泛素结合酶UBC7参与的底物第48位赖氨酸特异点的泛素化反应中，分离开的环指域在细胞液中催化泛素的连接。这些特性与E3酶有关，E3酶是参与内质网相关蛋白降解的重要酶。和一些E3连接酶一样，TEB4可能参与神经退行性病变的调节。     

细菌漆酶的生物信息学分析

漆酶是一种含铜的多酚氧化酶。本研究利用生物信息学分析工具对细菌的漆酶蛋白序列的基本性质、保守结构域、系统发育树以及结构等进行了分析。所分析细菌主要分布在变形菌门、放线菌和厚壁菌门。细菌漆酶的物理化学性质相似,但不同细菌来源的漆酶之间序列相似性较低,但其仍然具有容易识别的保守结构域特征。二级结构及三级结构具有明显的相似性。细菌漆酶的生物信息分析为其功能研究及在其他微生物中研究该类酶提供了基础。     

福氏志贺菌硫氧还过氧化物酶的表达、纯化、活性检测及晶体生长的初步研究

Sf2523蛋白属于硫氧还蛋白过氧化物酶(Prx)家族,在有氧代谢过程中消除活性氧,起到保护生命大分子的重要作用.通过构建原核表达体系,可溶性表达并纯化了Sf2523酶蛋白,并对蛋白进行了过氧化物酶活性检测,证明其依然具有天然活性,酶的核心结构并未发生变化.由分子排阻色谱结果发现,酶蛋白体内和体外聚集状态不同,离体蛋白聚集状态不稳定,趋于二体化.将纯化的单体蛋白即时进行了结晶实验,初筛长出了针状晶体.通过进一步切除标签蛋白进行优化处理,最终得到了均匀的三维单晶.     

伸展蛋白的结构、功能、交联和生物合成

伸展蛋白是细胞壁中一类富含羟脯氨酸、具有Ser-Hyp-Hyp-(X)-Hyp-Hyp特征性结构单位的糖蛋白。它们不仅是初生壁的重要结构成分,而且在细胞的防御及抗病抗逆性中起作用。伸展蛋白过氧化物酶能在体外将伸展蛋白单体交联成多聚体。酪氨酸残基参与交联并形成异二酪氨酸(IDT)。伸展蛋白的合成和翻译后修饰分别在细胞质和内质网等膜系统中进行。     

人源脂肪酸合酶在酿酒酵母中的表达纯化和结构的初步分析

[背景] 聚酮类化合物在医药领域有重要的应用,相关药物研发依赖聚酮合酶多变的结构认知,人源脂肪酸合酶的组成结构和催化机制与聚酮合酶相近,研究人源脂肪酸合酶结构可为聚酮合酶的研究奠定基础。[目的] 在酿酒酵母中表达纯化人源脂肪酸合酶蛋白,确定合适的体外纯化条件。[方法] 以酿酒酵母BJ5464为表达载体,构建带有His和Strep双亲和层析标签的重组质粒,诱导表达蛋白后用亲和层析方法获取目标蛋白,并结合凝胶电泳和快速蛋白质液相层析技术,确定合适的蛋白纯化条件。[结果] 成功构建重组表达质粒pxw55-hfas-cSHII, 并在体外纯化得到合适浓度和纯度的人源脂肪酸合酶蛋白,筛选不同缓冲液条件并结合电子显微镜观察结果反馈,确定合适的蛋白体外纯化体系。[结论] 蛋白电镜结构分析需要有高纯度、合适浓度并且形成正确构象的蛋白样品,而人源脂肪酸合酶蛋白纯化体系的建立和纯化条件的确定为其电镜结构分析提供了良好的样品,为人源脂肪酸合酶的结构解析及结构相似但更为复杂的聚酮合酶蛋白解析奠定了良好基础。     

酪氨酸酶催化氧化对丝素蛋白结构与性能的影响

采用酪氨酸酶对丝素蛋白催化氧化,考察了酶促氧化反应对丝素蛋白结构及丝素膜性能的影响。研究结果表明,酪氨酸酶可催化氧化丝素蛋白中酪氨酸残基生成多巴和多巴醌结构衍生物,并且两者含量随催化反应时间延长呈波动性变化;酶促反应后丝素蛋白中游离氨基含量下降,丝素风干膜断裂强度增加,表明酶促氧化中丝素大分子间发生自交联。XRD结果表明酪氨酸酶催化氧化对丝素蛋白二级结构有一定影响;SEM显示酶促改性可能影响丝素蛋白冷冻干燥膜多孔形态结构。     

植物几丁质酶的结构,基因及其表达

几丁质酶按其蛋白氨基酸序列结构的特征及同源性可分为六类,即：ＣｌａｓｓⅠ－Ⅵ。ＣｌａｓｓＩ在蛋白氨基酸结构上包括三个功能区域,Ｎ－端是富含半胱氨酸的几丁质结合工,约４０个氨基酸;Ｃ－端是酶的催化区,也是酶的主要功能区域,约３００个氨基酸;二者通过一个多变的交联区连接在一起。ＣｌａｓｓⅡ仅具有类似于ＣｌａｓｓⅠ的酶催化区域,而没有几丁质结构区和交联区。ＣｌａｓｓⅢ几丁质酶在氨基酸序列上与ＣｌａｓｓⅠ     

乳铁蛋白抗菌机理研究进展

乳铁蛋白(Lactoferrin,LF)是发现于哺乳动物初乳中具有多种生物活性的单体糖蛋白,对幼体初期免疫具有重要作用。前人研究发现LF蛋白的酶解后其抗菌活性得到增强,是由于酶解后产生了比其本身抗菌能力更强的肽段。目前关于LF蛋白抗菌活性的报道很多,但其抗菌的具体分子机制尚不清楚。以LF蛋白与细菌细胞膜的结合能力和LF蛋白酶解产物的抗菌活性为切入点,揭示了LF蛋白行使抗菌功能的过程,认为LF蛋白与细菌表面相结合而发生结构变化,进而暴露出敏感的酶切位点,经酶解而释放抗菌活性肽,这些抗菌肽破坏细菌的细胞膜结构,达到抑菌或杀菌的目的。对LF蛋白抗菌机理的阐释将为研制抗菌能力更强的活性蛋白提供理论依据。     

布鲁氏菌LS蛋白(BLS)研究进展

LS蛋白(2,4-二氧四氢蝶啶合成酶)广泛存在于动物、植物和微生物中,是催化核黄素生物合成的重要合成酶之一。该酶最显著的特征之一是其在不同物种中具有空间结构差异。布鲁氏菌LS蛋白(BLS)是布鲁氏菌的一种优势抗原,是由两个五聚体组成的结构稳定的十聚体。BLS是光滑型和粗糙型布鲁氏菌所共有的抗原,用于布鲁氏菌病的诊断可提高其敏感性;BLS可以激发抗原特异性细胞应答产生IFN-γ,从而对宿主产生保护力,是一种理想的布鲁氏菌病亚单位疫苗的候选蛋白。本文综述了BLS的结构特性及应用研究进展,旨在为BLS的深入研究和开发应用提供参考。