MDV-1 CVI988/Rispens疫苗毒体外感染期间VP22的表达及细胞间转导作用

利用CVI988 VP22蛋白C端94~243 aa片段作为抗原制备特异性抗体, 并用于检测MDV-1不同毒株感染鸡胚成纤维细胞(CEF)时, 在不同感染时间内的表达情况. 结果发现, 当感染量PFU=50时, MDV各不同致病力的毒株(GA, RB1B和CVI988株)VP22最早在3 h时开始向病毒感染细胞的邻近细胞核内扩散; 8 h时, VP22几乎扩散到所有细胞的核内. 这说明VP22在感染细胞形成空斑之前就已经开始表达, 并高效转导入其他正常的细胞核内. 实验中发现血清I型马立克氏病病毒(MDV-1)弱毒株CVI988/Rispens的VP22蛋白缺失²⁰¹TKSERT²⁰⁶. 结果证实这一缺失对VP22蛋白转导功能并没有明显影响, 即CVI988 VP22仍具有高效的细胞内转导作用. 这为深入研究和开发MDV CVI988株的VP22蛋白转导功能奠定了基础.     

MDV-1 VP22羧基端在大肠杆菌中高效可溶性表达

VP22是血清Ⅰ型马立克氏病病毒(MDV-1)的复制和传播必不可少的组分.本研究从MDV-1无致病性的CVI988/Rispens疫苗感染的鸡胚成纤维细胞DNA中扩增得到VP22基因,并在大肠杆菌中表达其C端功能区.SDS-PAGE电泳发现,VP22 C端得到高效可溶性表达,大小为42kDa左右.将获得的阳性条带经切胶免疫和细菌超声波裂解的上清作为抗原免疫6周龄Balb/C小鼠,均能诱导产生特异性抗VP22 C端抗体.通过免疫荧光试验,检测到VP22在感染MDV CEF所有细胞核中呈特异性表达.这一抗体对深入研究VP22蛋白转导功能起到重要的作用.     

MDV-1 VP22羧基端在大肠杆菌中高效可溶性表达

VP22是血清I型马立克氏病病毒(MDV-1)的复制和传播必不可少的组分。本研究从MDV-1无致病性的CVI988/Rispens疫苗感染的鸡胚成纤维细胞DNA中扩增得到VP22基因,并在大肠杆菌中表达其C端功能区。SDS-PAGE电泳发现,VP22C端得到高效可溶性表达,大小为42kDa左右。将获得的阳性条带经切胶免疫和细菌超声波裂解的上清作为抗原免疫6周龄Balb/C小鼠,均能诱导产生特异性抗VP22C端抗体。通过免疫荧光试验,检测到VP22在感染MDVCEF所有细胞核中呈特异性表达。这一抗体对深入研究VP22蛋白转导功能起到重要的作用。     

与α疱疹病毒VP22蛋白融合增强“自杀性”DNA疫苗的免疫反应

α疱疹病毒VP22具有独特的蛋白转导特性,能通过一种不依赖于高尔基体的非经典途径从原始表达细胞转导到邻近的非表达细胞中,而且VP22还能使与之融合的外源蛋白在细胞间转导.因此,VP22是一种极具开发潜力的免疫增强分子.本研究以牛疱疹病毒1型(BHV- 1)的VP22为研究对象,以β-半乳糖苷酶（β-gal）为模式抗原,构建了BHV-1 VP22(BVP22)与β-gal融合的“自杀性"DNA疫苗表达质粒pSCAB-gal,转染BHK 21细胞.X-gal染色结果表明,表达的融合蛋白BVP22-gal仍具有蛋白转导能力,而单独表达β-gal的“自杀性"DNA疫苗表达质粒pSCA-gal不具有这种能力.进一步将pSCAB-gal和pSCA-gal分别免疫BALB/c小鼠,结果pSCAB-gal免疫能显著增强β-gal特异性ELISA抗体和细胞毒T细胞（CTL）活性,表明与BVP22融合能显著增强“自杀性”DNA疫苗的体液免疫和细胞免疫反应.     

Expression and intercellular trafficking of the VP22 protein of CVI988/Rispens vaccine strain of Marek’s disease virus

The viral protein 22 (VP22) in the tegument of Marek’s disease virus serotype 1 (MDV-1) plays an im-portant role in cell-to-cell spread and viral propagation. Antiserum against the carboxyl terminus of VP22 was prepared by immunizing mice with recombinant VP22 expressed in E. coli, and used to in-vestigate its expression in chicken embryo fibroblast (CEF) cells infected with different MDV-1 strains. At an infection dose of PFU=50, intercellular trafficking of the VP22 into the nuclei of the surrounding receipt cells was detected as early as 3 hours post infection. By 6 hours after infection (before viral plague formation), the protein was detected in the whole nuclei of the recipient cells with no difference among MDV-1 strains CVI988/Rispens, GA and RB1B. Intra-nuclear accumulation of the VP22 protein was further increased when the viral plagues started to form. These results indicate that, albeit the ex-istence of the 201TKSERT206 deletion, the VP22 of the CVI988/Rispens vaccine strain has also intercel-lular-trafficking function, which might serve as a potential alternative delivering protein instead of virulent strains VP22.     

Expression and intercellular trafficking of the VP22 protein of CVI988/Rispens vaccine strain of Marek’s disease virus

The viral protein 22 (VP22) in the tegument of Marek’s disease virus serotype 1 (MDV-1) plays an im-portant role in cell-to-cell spread and viral propagation. Antiserum against the carboxyl terminus of VP22 was prepared by immunizing mice with recombinant VP22 expressed in E. coli, and used to in-vestigate its expression in chicken embryo fibroblast (CEF) cells infected with different MDV-1 strains. At an infection dose of PFU=50, intercellular trafficking of the VP22 into the nuclei of the surrounding receipt cells was detected as early as 3 hours post infection. By 6 hours after infection (before viral plague formation), the protein was detected in the whole nuclei of the recipient cells with no difference among MDV-1 strains CVI988/Rispens, GA and RB1B. Intra-nuclear accumulation of the VP22 protein was further increased when the viral plagues started to form. These results indicate that, albeit the ex-istence of the ²⁰¹TKSERT²⁰⁶ deletion, the VP22 of the CVI988/Rispens vaccine strain has also intercel-lular-trafficking function, which might serve as a potential alternative delivering protein instead of virulent strains VP22.     

HIV-1 TAT蛋白转导肽的研究进展

TAT蛋白转导肽是人类免疫缺陷病毒1型(human immunodeficiency virus type 1, HIV-1)编码的一段富含碱性氨基酸、带正电荷的多肽,属于蛋白转导域家族的一员。长期研究发现其全长及11个碱性氨基酸富集区的核心肽段(YGRKKRRQRRR)不仅能够在包括蛋白质、多肽及核酸等多种外源生物大分子的跨膜转导过程中具有重要作用,而且能够携带这些外源生物大分子通过活体细胞的各种生物膜性结构(如细胞膜和血脑屏障等)并发挥生理功能,但其跨膜转导机制仍不明确。新近研究还发现TAT核心肽段在促进外源蛋白高效表达过程中也具有重要作用,能够显著增加外源蛋白高效、可溶性表达的水平,显示了TAT蛋白转导肽的新功能。以TAT蛋白转导肽跨膜转导作用的长期研究背景为基础,分别从TAT蛋白转导肽的结构特点、其跨膜转导作用的影响因素及其作用机制等方面进行了系统综述,进一步结合TAT蛋白转导肽的最新研究进展分别从药物研发、机制探索及新功能的开发等方面展望了后续研究方向与应用价值,不仅为深入阐述TAT蛋白转导肽的跨膜转导作用的功能意义提供了参考依据,而且为TAT蛋白转导肽在微生物工程及蛋白质工程等领域的潜在应用价值提供了重要参考信息。     

牛疱疹病毒Ⅰ型VP22和猪繁殖与呼吸综合征病毒GP5融合基因DNA疫苗的免疫效应

为了提高表达GP5的猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）DNA疫苗的免疫效应,将具有蛋白转导功能的牛疱疹病毒1型（BHV-1）VP22基因插入到经过修饰具有更好免疫原性的PRRSV修饰型ORF5基因（ORF5M）上游,构建VP22和ORF5M融合表达的真核表达质粒pCI-VP22-ORF5M。经间接免疫荧光试验（IFA）和Westernblot检测证实体外表达后,免疫BALB/c小鼠,检测小鼠免疫后的GP5特异性ELISA抗体、抗PRRSV中和抗体和脾淋巴细胞增殖反应,并与非融合的真核表达质粒pCI-ORF5M进行比较。结果显示,融合表达VP22-GP5的DNA疫苗 pCI-VP22ORF5M诱导的体液免疫和细胞免疫反应均明显高于非融合表达的DNA疫苗pCI-ORF5M,表明蛋白转导相关蛋白BHV-1 VP22能显著增强表达GP5的PRRSV DNA 疫苗的免疫效应,有效发挥了基因免疫佐剂效应;这为研制PRRSV高效DNA疫苗奠定了基础,同时也为其它疾病的高效新型疫苗研究提供了思路。     

TAT蛋白转导肽介导的秀丽线虫体内外源蛋白的跨膜转导研究

TAT蛋白转导肽是HIV-1病毒编码的一段富含碱性氨基酸序列的多肽,能够高效介导多种外源生物大分子通过多种膜性结构,如细胞质膜和血脑屏障等。为探索TAT蛋白转导肽介导的秀丽线虫体内外源蛋白跨膜转导作用,以EGFP为报告基因结合常规分子克隆技术构建了原核表达载体pET28b-EGFP和pET28-TAT-EGFP,继而利用诱导剂IPTG(终浓度1mmol/L)诱导表达了靶蛋白并结合荧光显微观察、SDS-PAGE和Western blot等鉴定技术获得表达靶蛋白的大肠杆菌BL21(DE3)细胞,最后将其涂布到含有Kana⁺的LB固体培养基上直接饲喂野生型N2株系线虫,利用荧光显微镜观察绿色荧光信号在线虫体内的分布。结果证明,TAT-EGFP融合蛋白较之于EGFP可高效、可溶性表达,而且通过直接饲喂秀丽线虫表达靶蛋白的大肠杆菌48小时后,TAT-EGFP荧光信号明显分布于线虫肠壁细胞,而EGFP荧光信号则分布在秀丽线虫肠腔,空载体对照组未见任何荧光信号,说明TAT蛋白转导肽能够高效介导外源蛋白在秀丽线虫体内跨膜转导。同时,通过比较空载体对照组与实验组线虫微分干涉图像,未见线虫出现明显的细胞形态变化,说明TAT蛋白转导肽介导的外源蛋白跨膜转导作用是安全的,为在秀丽线虫体内直接研究外源蛋白的功能以及进行蛋白药物的研发提供了重要参考。     

MDV-1 VP22增强鸡传染性法氏囊炎病毒VP2 DNA免疫作用

马立克氏病病毒（Marek’s disease virus,MDV）被膜成分中的VP22具有蛋白转导功能．将鸡传染性法氏囊炎病毒（infectious bursal disease virus,IBDV）VP2与MDV—VP22同时插入pcDNA3．1构建融合蛋白表达载体,在COS-1细胞中进行暂态表达．结果表明：VP22并不能促进VP2向周围未转染细胞转导,即VP22对VP2没有明显的蛋白转导作用,相反,VP2影响VP22在细胞内的正常定位．然而,通过小鼠股四头肌免疫注射PEI包裹的裸质粒DNA进行DNA免疫,以间接ELISA测定VP2抗体效价,FACS检测T细胞亚类．发现,虽然VP22没有明显促进VP2的体液免疫应答,但脾脏淋巴细胞分群结果表明,VP22-VP2融合蛋白表达载体免疫组和VP2质粒免疫组的CD3^＋T细胞数量显著高于eGFP-VP2组和对照组（P〈0．05）,融合蛋白表达载体免疫组小鼠CD8^＋／CD4^＋T细胞的比例与VP2质粒免疫组相比,明显增强（P〈0．05）,与对照组相比差异极显著（P〈0．01）．这表明VP22对VP2的特异性细胞免疫反应具有一定增强作用．     

一株具有急性致瘤特性的马立克氏病病毒的分离与鉴定

应用鸭胚成纤维细胞(DEF)从免疫过CVI988/Rispens疫苗株患马立克氏病(MD)的三黄鸡中分离到一株马立克氏病病毒(MDV)(命名为YL040920株)。从该分离株蚀斑克隆获得的9个克隆在蚀斑形成时间及其形态大小上均无明显差别,表明它较为单一;应用聚合酶链式反应(PCR)技术扩增并测定了毒株的致瘤相关基因meq的核苷酸序列,并与其他MDV-1参考毒株的序列进行比较分析,发现其序列具有MDV-1强毒株的特征;用基于抗MDV-1 MEQ蛋白的单克隆抗体3G12E6的免疫荧光试验(FA)对毒株的DEF培养物进行检测,发现有特异性的荧光定位于细胞核内;应用毒株感染霞烟鸡,最早在接种后(PI)21d即可诱发明显的内脏器官,在各器官肿瘤中以心脏、肝脏和皮肤的肿瘤发生率最高;用禽肿瘤病三重PCR鉴别诊断技术对毒株的DEF培养物以及感染鸡的内脏器官组织进行检测,均能扩增到MDV-1强毒株的特异性带,而网状内皮增生症病毒(REV)和禽白血病病毒(ALV)的检测则均为阴性。研究的结果表明,分离株YL040920为单一的MDV-1强毒株,无REV、ALV以及疫苗株CVI988/Rispens的混杂,并具有以心脏、肝脏和皮肤肿瘤为主的急性致瘤特性。     

利用TAT多肽增强腺病毒对细胞感染效率的研究

蛋白转导多肽本身或携带生物大分子能以一种不明机制的方式高效地穿过真核细胞质膜并且几乎没有组织选择性。这为生物药物研究、基因治疗等领域带来了新的希望。最近有研究表明:来源于HIV-1的TAT蛋白的蛋白转导结构域多肽可以显著地提高重组腺病毒感染细胞和实验动物的效率。在对。HeLa且和Vero-E62种具有不同病毒易感性的细胞进行重组腺病毒感染实验时发现TAT多肽可以明显地提高重组腺病毒对HeLa细胞的感染及在细胞中外源报道基因的表达,但是对Vero-E6细胞却没有效果,表明TAT多肽增强重组腺病毒的感染与靶细胞类型有关,而并不像转导现象那样没有组织差异。这为蛋白转导技术在病毒载体中的应用提供了参考,但其中涉及的蛋白转导的机制有待进一步实验研究。     

表达传染性法氏囊病毒VP2蛋白的重组马立克氏病毒的构建

用聚合酶链式反应(PCR)方法从真核表达载体pcDNA3.1-VP2中扩增出包含CMV和polyA的VP2表达盒基因片段,经琼脂糖凝胶电泳大小为2.4kb;将该基因片段插入马立克氏病病毒(MDV)CVI988//Rispens的非必需区US10片段中,经SphI酶切分析获得大小为6.0和2.4kb两个片段,表明成功构建出表达VP2基因的MDV CVI988转移载体pUC18-US10-VP2质粒.将质粒与CVI988/Rispens疫苗毒共转染鸡胚成纤维细胞(CEF),通过免疫荧光方法筛选,结果获得了表达VP2基因的重组MDV(rMDV-VP2).用IBDV特异性单克隆抗体进行间接免疫荧光试验(IFA)证实,rMDV-VP2病毒传至第8代仍能稳定表达VP2蛋白,这为进一步研究其免疫学特性奠定了基础.     

表达绿色荧光蛋白的重组CVI988病毒的构建及特性

提取马立克氏病毒I型疫苗毒株CVI988的总DNA为模板,利用PCR技术扩增出病毒生长非必需的US2基因并克隆入T-easy载体.将CMV启动子和增强子控制的含GFP基因表达盒克隆入US2基因中,成功构建了含GFP基因的转移质粒载体pGUS2GFP.用脂质体将其与CVI988 株共转染CEF细胞,用96孔板稀释法得到纯化的表达绿色荧光蛋白的重组CVI988病毒株rCVIGFP,并分别测定其在体内和体外的生长情况.表达EGFP基因的重组病毒在细胞上生长曲线与亲本毒CVI988类似,体外实验表明,1日龄腹腔接种该重组毒后,可以从鸡体内分离到表达绿色荧光的病毒.     

伪狂犬病毒UL49基因核定位信号的初步确定

伪狂犬病毒UL49基因编码的蛋白VP22是一种皮层蛋白,其生物学功能尚不清楚。预测并确定PRV UL49的核定位信号,可为研究其编码蛋白VP22的蛋白转导功能及作用机理奠定基础。通过生物信息学软件分析预测到,PRV UL49基因存在潜在的两个核定位信号:5~21位氨基酸序列(RKTRVA ADETASGARRR)NLS1和241~247位氨基酸序列(PGRKGKV)NLS2。本文将实验分为对照组、NLS1和NLS2同时缺失组、NLS1缺失组和NLS2缺失组四组,并通过PCR扩增、分子克隆等技术获得PRV Ea株UL49基因。以pEYFP-N1为载体,将UL49基因及各组缺失或突变片段插入EYFP上游,成功构建PRV pUL49-EYFP重组质粒及一系列缺失突变体,转染COS-7细胞后观察荧光定位。实验结果表明,确认预测到的NLS1和NLS2具有核输入功能,且位于241-247位的氨基酸序列(PGRKGKV)的入核功能更强,5~21位氨基酸序列(RKTRVA ADETASGARRR)为双向核定位信号,其同时具有核输出的功能。     

伪狂犬病毒VP22蛋白C-端系列缺失突变体的构建及亚细胞定位分析

以绿荧光蛋白(GFP)为标记,构建了一系列伪狂犬病毒VP22蛋白的C-端缺失突变体与GFP融合表达的真核表达质粒,脂质体介导转染Hela细胞,通过荧光显微镜观察分析各个缺失突变体的亚细胞定位,发现伪狂犬病毒VP22蛋白与核定位有关的结构域在第60个到第90个氨基酸残基之间,第111个到第159个氨基酸残基有可能与形成细胞核内的颗粒有关,与微管蛋白结合有关的结构域可能在第187到第241个氨基酸残基之间.上述研究结果为进一步深入研究伪狂犬病毒VP22蛋白的结构与功能奠定了基础.     

TAT蛋白转导域：蛋白质治疗的新曙光

TAT蛋白转导域是源自人类免疫缺陷病毒Tat蛋白的一段碱性氨基酸多肽,能够将与之共价连接的多肽、蛋白、核酸等生物大分子快速而高效地转导入细胞内部,在药物转运和疾病治疗等领域有着巨大的应用潜力.TAT蛋白转导域首先通过电荷相互作用吸附于细胞膜,然后通过脂筏介导的巨胞饮作用进入细胞.随着体外研究的不断成熟,应用TAT蛋白转导域治疗人类肿瘤、卒中、炎症等疾病的动物模型也获得了成功,TAT蛋白转导域进入临床指日可待.     

超正电荷绿荧光蛋白+36GFP作为核酸载体的细胞穿透性分析

旨在通过原核表达纯化超正电荷绿色荧光蛋白+36GFP,研究其与核酸的结合作用及作为核酸载体的细胞转导功能。将pET+36GFP-HA2质粒转化到大肠杆菌BL21(DE3)菌株中,然后表达纯化+36GFP蛋白。将得到的目的蛋白在特定浓度下分别转导293细胞、HepG2细胞、A549细胞和B16细胞,流式细胞仪检测+36GFP的转导效率;+36GFP蛋白(100 nmol/L)转导A549细胞,激光共聚焦显微镜观察结果;将+36GFP蛋白与质粒DNA按不同比例孵育,凝胶阻滞实验检测+36GFP与DNA的结合能力;激光共聚焦显微镜和流式细胞仪检测+36GFP蛋白携带质粒DNA转导细胞后报告基因的表达。结果显示,+36GFP蛋白具有较高的细胞转导效率,且随浓度升高转导效率增加,呈浓度依赖性。凝胶阻滞实验显示,+36GFP能够与质粒DNA结合,阻滞DNA在凝胶中迁移,且呈现一定的浓度依赖性。+36GFP包裹质粒转导细胞后,可高效携带质粒DNA转导进入细胞,使质粒报告基因得到表达。本研究成功表达纯化了+36GFP蛋白,证实该蛋白具有较高的细胞转导效率,可将外源核酸携带入细胞使外源基因得到表达。     

小分子G蛋白R-Ras介导的细胞信号转导通路及其生物学功能

R-Ras属于小分子G蛋白Ras超家族,在细胞信号转导通路中起着分子开关的作用,具有调控细胞黏附、促进细胞凋亡、抑制细胞运动、调节细胞形态等多种生物学功能。R-Ras和Ras家族的其他成员一样,结合GTP时处于激活状态,即信号通路开启状态,能够与下游因子相互作用;通过上游信号的调节及其下游效应物,将胞外信号转导到胞内,调节细胞的相关生物学功能。最近的研究提示R-Ras与乳腺癌等肿瘤的发生具有相关性,对其深入研究有可能为肿瘤发生机制的阐明提供分子基础。我们对R-Ras介导的细胞信号转导通路及其生物学功能进行简要综述。     

HSV-1间层蛋白VP22转录调控功能的分析

HSV-1间层蛋白是一类重要的功能蛋白,在病毒复制的多个环节中具有重要意义．为了解主要间层蛋白VP22在病毒复制过程中的生物学特性,本实验利用氯霉素乙酰转移酶系统,分析了VP22对病毒启动子的转录调控功能,结果表明VP22对HSV-1觯,TK和gC基因启动子明显具有剂量效应关系的转录抑制作用;VP22也能抑制病毒不同转录调控因子（VP16和ICP0）对启动子的转录激活作用,尤其明显抑制ICP0对TK和gC基因启动子的转录激活作用;VP22能明显抑制组蛋白乙酰转移酶PCAF对ICP0转录激活的促进作用,此抑制作用较VP22抑制ICP0的转录激活作用更为显著．VP22对其他病毒启动子的转录抑制效应,在内对照实验β-gal活性分析中也得到了证明．