毕赤酵母细胞工厂工程化改造与应用

毕赤酵母作为细胞工厂在小分子代谢产物发酵和蛋白制品生物合成中扮演着重要角色,具有极其重要的工业应用价值。随着CRISPR/Cas9等新型编辑工具的开发和应用,对毕赤酵母细胞工厂进行多基因高效率的工程化改造已成为可能。本文首先对毕赤酵母工程化改造的遗传操作技术和目标方向进行了归纳总结,其次介绍了毕赤酵母作为细胞工厂的应用现状,同时探讨了毕赤酵母细胞工厂的优点及缺陷,并对其发展方向作出展望;以期为未来的毕赤酵母工程化改造研究提供参考和启示,推动毕赤酵母细胞工厂在生物产业中的创新应用。     

毕赤酵母高密度发酵工艺的研究

高密度发酵是毕赤酵母提高蛋白表达量的一种重要策略,发酵工艺是高密度发酵的一个重要因素。采用下列措施均可以有效地提高表达水平：调节基础培养基,采用变pH和变温发酵,提高DO,选择最适的诱导前菌体密度和比生长速率并降低甘油初始浓度和采用分段式指数流加进行调控。选择合适的甲醇补料策略：甲醇限制补料（MLFB）、氧气限制补料（OLFB）、甲醇不限制补料（MNLFB）和温度限制补料（TLFB）。采用两种方式调控补料：诱导阶段菌体生长时,甲醇比消耗速率(qMeOH)为0.02-0.03gg-1h-1,而菌体不生长时,qMeOH采用较高值。     

重组巴斯德毕赤酵母高密度发酵表达植酸酶

对巴斯德毕赤酵母的高密度发酵条件进行了试验,并根据摇瓶发酵的优化结果进行了补料方式的研究。在摇瓶发酵时,最佳种龄为16h,接种量为3％,甲醇的诱导浓度为15g／L,生长阶段最适pH为5．0,诱导阶段最适pH为5．5。在间歇补料、恒速补料、变速补料三种补料方式中以变速流加最优。     

毕赤酵母工程菌高密度发酵的研究进展

近年来毕赤酵母已成为一种优越的异源蛋白表达系统。而提高目的蛋白的表达水平,高密度发酵已成为关键技术环节之一。我们从毕赤酵母工程菌的选择、培养基的优化设计,以及发酵工程过程控制等方面简要阐述毕赤酵母的高密度发酵,并提出了工程菌在高密度发酵过程中存在的问题。     

重组毕赤酵母发酵生产S-腺苷甲硫氨酸培养条件优化

甲醇营养型毕赤酵母生产S-腺苷甲硫氨酸(SAM)是通过其表达的SAM合成酶催化L-甲硫氨酸(L-Met)和ATP反应而合成的。本文采用全合成培养基,在摇瓶上进行了培养条件的优化,确定了接种量、pH、PTM1、PO43-等初步条件。并根据SAM生物合成的特征,重点对其碳、氮源的影响作了进一步的分析优化。结果表明:当CaSO40.465g/L,K2SO49.10g/L,MgSO4.7H2O 7.45g/L,PO43-0.5mol/L情况下,生长阶段,甘油4%、硫酸铵4.00g/L为最佳;诱导表达阶段,L-Met1.0g/L,甘油与甲醇比例为0.5、硫酸铵8.00g/L为最佳。优化后,SAM产量诱导4d后达1.48g/L,诱导5d后可达1.70g/L(131mg/g干细胞),L-Met的转化率可达40.65%,既利于工艺放大又便于产品的分离纯化。     

毕赤酵母高密度发酵研究进展

巴斯德毕赤酵母表达系统是近年发展起来的一种优秀的真核表达系统.本从培养基、温度、pH值、溶氧、甲醇的流加等角度对国内外毕赤酵母高密度发酵的研究进展做了较详细的综述,并提出了目前毕赤酵母高密度发酵过程中存在的问题.     

豆血红蛋白在毕赤酵母中的表达条件优化

【背景】豆血红蛋白可赋予素肉制品类似牛肉的红褐色质地,已被美国食品药物监督管理局批准作为人造素肉的着色剂,近年来受到广泛关注。【目的】优化毕赤酵母产豆血红蛋白的培养条件,提高毕赤酵母产豆血红蛋白的产量。【方法】首先通过单因素试验研究蛋白胨种类、大豆蛋白胨浓度、铁盐种类及血红素浓度在诱导阶段对毕赤酵母产豆血红蛋白的影响;然后通过Plackett-Burman试验设计筛选出对豆血红蛋白产量影响最大的3个因素,再通过最陡爬坡法确定3个因素的变化范围,对3个因素进行响应面分析;最后根据响应面结果进行摇瓶发酵和发酵罐高密度发酵。【结果】单因素试验发现：用4%大豆蛋白胨作为主要氮源、甲醇诱导浓度为1.5%、血红素浓度为5μmol/L时发酵效果较好,经过响应面优化后得到蛋白胨浓度为51.48 g/L、pH 5.66、培养基装液量35.84mL/250mL是最优发酵条件。在此优化条件下,LegH摇瓶发酵产量为0.191 mg/mL,与预测值(0.183 mg/mL)比较接近。采用5 L发酵罐进行高密度发酵,LegH产量最高达到0.384 mg/mL。【结论】优化了毕赤酵母表达豆血红蛋白的发酵条件,获得...     

毕赤酵母工程菌高密度发酵研究与进展

毕赤酵母表达系统是近年来发展最为迅速的一种新型外源蛋白真核表达系统,被广泛应用于多种不同领域且成功表达了许多基因工程产品。高密度发酵技术已被广泛运用到毕赤酵母工程菌发酵工程当中。主要从毕赤酵母的表达常用菌株、载体及表型等方面介绍了其表达系统,从外源基因自身的特性、培养基的组成、温度、pH、溶氧量及补料流加策略方面阐述了对毕赤酵母高密度发酵的过程及蛋白质表达结果的影响,并对毕赤酵母工程菌高密度发酵进行了展望,为其今后的研究及应用提供借鉴。     

外源基因在毕赤酵母中表达的优化

巴斯德毕赤酵母是近年来成功的外源基因表达系统,已表达出众多外源蛋白。它既能像原核生物一样快速生长高密度发酵,又能进行真核翻译后修饰,并且蛋白分泌量大,因此应用越来越广泛。如果对它的表达载体,转化诱导条件和目的基因内部结构,发酵条件等方面进行优化,能够进一步发挥它的优势,更好地表达需要的外源蛋白。本文就毕赤酵母表达系统表达优化进行总结综述。     

巴斯德毕赤酵母甲醇诱导表达磷脂酶A2的转录组学分析

【目的】基于转录组学技术研究表达磷脂酶A_2的毕赤酵母重组菌在甲醇诱导表达外源蛋白时的基因表达差异,从而解析外源蛋白高效诱导表达机制,为进一步工程菌株的改造提供理论支撑。【方法】以一株产磷脂酶(PLA_2)的毕赤酵母为出发菌株,采用RNA-Seq二代测序方法,研究在甘油培养和甲醇诱导两种条件下,重组毕赤酵母转录组基因表达差异情况。【结果】重组毕赤酵母中共鉴定到5225个转录本。甘油培养与甲醇诱导相比,共有857个基因发生显著变化。依据代谢途径分类,差异基因集中在核糖体成分、甲醇代谢、磷酸戊糖途径、糖酵解途径、柠檬酸循环、乙醛酸循环以及蛋白质加工过程。【结论】通过分析甲醇诱导前后的差异表达基因,结果表明碳源改变对胞内代谢会产生全局影响。本研究结果为进一步研究毕赤酵母表达外源蛋白的机制提供了基础。     

毕赤酵母外源蛋白分泌途径的研究进展

毕赤酵母作为一种重要的表达外源蛋白的宿主,提高其外源蛋白的分泌量非常有必要。近年来很多学者报道了与毕赤酵母外源蛋白分泌相关的基因、蛋白质,同时毕赤酵母基因组的公布加快了这方面的研究进展。文章根据外源蛋白分泌的途径,分步骤地总结了涉及的基因和蛋白,有利于分析控制蛋白分泌效率的具体步骤,为构建更加高效的毕赤酵母表达系统提供参考。     

巴斯德毕赤酵母不同生长阶段内参基因的筛选与验证

【背景】巴斯德毕赤酵母(Komagataella phaffii)是一种甲基营养型酵母,近年来作为生产重组蛋白和构建生物合成途径的细胞工厂受到广泛关注。实时荧光定量PCR (real-time quantitative PCR,RT-qPCR)是巴斯德毕赤酵母表达系统研究中一种快速、高效的基因表达水平检测技术,但需要进行归一化处理才能保证所得结果的可靠性。【目的】筛选并验证巴斯德毕赤酵母在不同生长阶段最稳定的内参基因用于精准归一化RT-qPCR的结果。【方法】通过转录组数据分析初步筛选出16个候选内参基因(rps8b、rpl35a、rpl10、eif5a、rpl19a、por1、rpl23b、0887、tif1、ole1、rpl14b、gs、sun、sdh2、trx1和ccp1)。通过RT-qPCR技术得到候选内参基因的C_t值,利用qBASE软件中的geNorm程序综合NormFinder算法评估内参基因的表达稳定性。【结果】通过geNorm分析得出精准归一化所需的最佳内参基因个数为2,最稳定的基因是rpl19a和tif1,NormFinder分析得到稳定性最高的内参基因为tif1。此外,利用甲酸脱氢酶编码基因fdh和乙醇脱氢酶甲醛脱氢酶双功能酶的编码基因afdh对候选内参基因进行验证。【结论】巴斯德毕赤酵母不同生长阶段的RT-qPCR进行精准归一化需要tif1和rpl19a这2个内参基因,为相关功能基因的表达定量提供了可靠的分析依据,补充了RT-qPCR分析中的内参基因,为巴斯德毕赤酵母不同生长阶段的基因表达调控及其应用研究提供了新的参考。     

高效合成葡萄糖二酸酿酒酵母工程菌的构建

葡萄糖二酸是天然存在的一种重要二元酸,其在医疗保健和化工工业等领域具有很高的实际应用价值,因此被称为"最具价值的生物炼制产品之一".以酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)为底盘微生物,文中考察了过量表达肌醇转运蛋白Itr1、融合表达肌醇加氧酶和葡萄糖醛酸脱氢酶以及弱化表达葡萄糖6-磷酸脱氢酶基因...     

代谢工程改造大肠杆菌合成己二酸

己二酸是一种具有重要应用价值的二元羧酸,是合成尼龙-66的关键前体。目前,生物法生产己二酸存在生产周期长、生产效率低的问题。本研究选择一株野生型高产琥珀酸菌株大肠杆菌(Escherichia coli) FMME N-2为底盘细胞,首先通过引入逆己二酸降解途径的关键酶,成功构建了可合成0.34 g/L己二酸的E. coli JL00菌株;接着,对合成路径限速酶进行表达优化,使E. coli JL01菌株在摇瓶发酵条件下产量达到0.87 g/L;随后,通过敲除sucD基因、过表达acs基因和突变lpd基因的组合策略平衡己二酸合成前体的供应,优化菌株E. coli JL12己二酸产量进一步提升至1.51 g/L;最后,在5 L发酵罐上对己二酸发酵工艺进行优化。工程菌株经72 h分批补料发酵,己二酸的产量达到22.3 g/L,转化率为0.25 g/g,生产强度为0.31 g/(L·h),具备了一定的应用潜力。本研究可为包括己二酸在内的多种二元羧酸细胞工厂的构建提供理论依据和技术基础。     

Engineering the plant cell factory for secondary metabolite production

Plant secondary metabolism is very important for traits such as flower color, flavor of food, and resistance against pests and diseases. Moreover, it is the source of many fine chemicals such as drugs, dyes, flavors, and fragrances. It is thus of interest to be able to engineer the secondary metabolite production of the plant cell factory, e.g. to produce more of a fine chemical, to produce less of a toxic compound, or even to make new compounds, Engineering of plant secondary metabolism is feasible nowadays, but it requires knowledge of the biosynthetic pathways involved. To increase secondary metabolite production different strategies can be followed, such as overcoming rate limiting steps, reducing flux through competitive pathways, reducing catabolism and overexpression of regulatory genes. For this purpose genes of plant origin can be overexpressed, but also microbial genes have been used successfully. Overexpression of plant genes in microorganisms is another approach, which might be of interest for bioconversion of readily available precursors into valuable fine chemicals. Several examples will be given to illustrate these various approaches. The constraints of metabolic engineering of the plant cell factory will also be discussed. Our limited knowledge of secondary metabolite pathways and the genes involved is one of the main bottlenecks. This revised version was published online in August 2006 with corrections to the Cover Date.     

产麦角硫因大肠杆菌工程菌株的构建与优化

麦角硫因(ergothioneine,ERG)是一种天然的抗氧化剂,广泛应用于化妆品、食品以及医药领域.相比于传统植物提取和化学合成方法,微生物发酵合成麦角硫因具有周期短、成本低等优点,因而受到广泛关注.为构建高产麦角硫因的大肠杆菌工程菌株,本研究以大肠杆菌(Escherichia coli) BL21 (DE3)为出...     

模块化工程改造大肠杆菌生产L-色氨酸

L-色氨酸作为一种必需氨基酸,广泛应用于食品、饲料和医药等领域。目前,微生物法生产L-色氨酸存在转化率低等问题。为此,本研究通过敲除L-色氨酸操纵子阻遏蛋白(L-tryptophan operon repressor protein, trpR)、替换l-色氨酸弱化子(trpL)、引入抗反馈调节的aroG^fbr等,获得可积累11.80 g/L L-色氨酸的底盘菌株大肠杆菌(Escherichia coli)TRP3。在此基础上,将L-色氨酸合成途径分为中心代谢途径模块、莽草酸(shikimic acid, SA)途径至分支酸(chorismic acid, CHA)模块、分支酸至L-色氨酸模块,并借助启动子工程,通过平衡中心代谢途径模块、莽草酸途径至分支酸模块、分支酸至L-色氨酸模块,获得工程菌E.coli TRP9。在5 L发酵罐中,工程菌E.coli TRP9的L-色氨酸产量提升至36.08 g/L,糖酸转化率提升至18.55%,达到理论转化率的81.7%。本研究利用模块工程策略,构建了高产L-色氨酸生产菌株,为l-色氨酸的规模化生产奠定了良好的基础。