昆虫RNAi技术与方法

RNAi技术已在昆虫基因功能研究中取得了广泛的应用。本文主要从dsRNA的设计、导入方法及RNAi结果分析方面作了概述,并对实验过程中存在的一些关键问题如RNAi特异性沉默,dsRNA导入方法的选择及不同昆虫RNAi多样性方面进行了讨论。     

RNA干扰与基因敲除

RNAi是指通过双链RNA介导特异性降解靶mRNA,导致转录后水平基因沉默的现象。其作用途径有RdRP依赖的RNAi的途径与非RdRP依赖的RNAi途径2种。利用RNAi的基因敲除技术在dsRNA序列选择、质粒或病毒为载体的dsRNA体内合成、发夹样siRNA的转录、dsRNA的导入方法等方面取得了很大进展,在研究人类或其他生物基因组中未知基因及蛋白质的功能等领域具有诱人的应用前景。     

RNAi技术在昆虫功能基因研究中的应用进展

RNA干扰（RNA interference,RNAi）是指外源或内源的双链RNA（dsRNA）特异性地引起基因表达沉默的现象,它作为一种有效的工具用来产生转录后沉默,从而抑制特定基因的表达,成为基因功能研究的一种新方法,除了在模式昆虫如果蝇Drosophila中广泛应用之外,也在非模式昆虫中得到成功应用。近年来,RNAi技术在导入方法和基因功能分析方面都取得了飞速发展,且与转基因技术相结合成功应用于害虫防治领域。本文综述了RNAi技术在导入方法、昆虫功能基因组功能分析及害虫防治等领域新近的研究成果,并展望了该技术的应用前景。     

病毒诱导的基因沉默及其在植物基因功能研究中的应用

RNA介导的基因沉默是近年来在生物体中发现的一种基于核酸水平高度保守的特异性降解机制.病毒诱导的基因沉默（virus induced gene silencing, VIGS）是指携带植物功能基因cDNA的病毒在侵染植物体后,可诱导植物发生基因沉默而出现表型突变,进而可以研究该目的基因功能.至今,已经建立了以RNA病毒、DNA病毒、卫星病毒和DNA卫星分子为载体的VIGS体系,这些病毒载体能在多种寄主植物（包括拟南芥、番茄和大麦）上有效抑制功能基因的表达.VIGS已开始应用于N基因和Pto基因介导的抗性信号途径中关键基因的功能研究、抗病毒相关的寄主因子研究以及植物代谢和发育调控研究.在当前植物基因组或EST序列大量测定的情况下,VIGS为植物基因功能鉴定提供了有效的技术平台.     

RNAi技术及在植物抗病毒研究中的应用

RNA干扰(RNA interference,RNAi)技术是一项基因沉默新技术,在抗病毒研究中,人为地将与病毒或宿主基因(宿主基因编码的蛋白质对病毒很重要而对宿主本身作用很小或不起作用)同源的双链RNA(double strand RNA,dsRNA)导入生物体内,引起与其同源的基因发生沉默,从而抑制病毒复制,达到抗病毒的目的。因此RNAi技术在抗病毒研究中倍受关注,并取得了显著成绩。主要对RNAi技术的相关知识以及在植物抗病毒中的应用进展作一综述。     

基因功能研究工具VIGS在植物中的应用

病毒诱导基因沉默(virus induced gene silencing,VIGS)是一种根据植物反抗病毒入侵机制而开发的RNA沉默技术。它利用病毒载体携带目的基因片段在寄主体内产生双链RNA从而诱导目的基因沉默。该技术的应用依赖于植物体内发生的精密且有效的分子调控网络与合适的侵染条件。相较于其他的植物诱变技术,VIGS有着其独特的优势,目前不仅在模式植物中有所应用,而且在诸多其他的单子叶及双子叶植物中也有报道。此外,随着新的载体系统、侵染条件与检测手段等不断出现,VIGS技术越来越多的特点被大家发现,并成为基因功能研究的得力工具。     

植物基因功能鉴定新工具--病毒诱导基因沉默技术的研究进展

病毒诱导基因沉默（Virus—induced gene silencing,VIGS）技术是指带一段靶基因序列的VIGS重组病毒侵染植物、引起植物同源基因沉默与表型变异,进而通过表型变异进行基因功能分析的方法,是近年发展起来的从反向遗传学方向快速鉴定植物基因功能的技术,是转录后基因沉默机制的一种表现。①VIGS的分子机制,涉厦基因沉默的起始、维持和信号放大、传播共3个阶段;②VIGS技术、栽体与方法学的发展;③VIGS作为基因功能研究的优越性,如不必进行转基因、操作方法简便、获得结果快速等;④应用VIGS对植物抗病途径、代谢与发育调控中参与基因功能进行研究的概况。同时。展望了VIGS技术作为植物功能基因组学功能分析的高通量技术平台的美好前景。     

昆虫的RNA干扰

RNA干扰(RNAi)是一种强有力的分子生物学技术, 在昆虫研究中得到了较多的应用。目前, RNAi技术主要应用于昆虫功能基因和功能基因组研究, 已在多个目的19种昆虫上实现了RNAi。在昆虫上实现RNAi的方法主要有注射、浸泡、喂食、转基因和病毒介导等方法, 这些方法各有特点, 其中喂食法因其简单而最有应用前景。昆虫RNAi的系统性较为复杂, 只有部分昆虫具有RNAi的系统性。昆虫中RNAi信号传导的基因可能是sid-1, 但昆虫RNAi的系统性机理还不是很清楚。转基因植物产生的dsRNA实现了对作物的保护, 证实了RNAi技术可用于害虫控制, 为害虫控制开辟了新领域。昆虫的RNAi研究处在起步阶段, 研究昆虫RNAi的机理, 特别是RNAi在昆虫体内的系统性扩散机理, 改进实现RNAi的方法, 提高RNAi技术在昆虫研究中的应用, 有利于昆虫基因功能鉴定和害虫控制, 促进昆虫学科的发展。     

显微注射构建烟粉虱的RNAi技术体系

RNAi已经成为揭示基因功能的一个常用的有力工具。在昆虫RNAi技术体系中,通过显微注射方法向昆虫体内注入dsRNA,实现系统性干扰,是最为广泛采用的方法。但对于体型较小的昆虫,注射法操作存在较大的难度,特别是非常微小的昆虫烟粉虱Bemisia tabaci。为了进行烟粉虱大规模基因功能验证,需要开发一套成熟的RNAi技术体系。本研究以烟粉虱的CYP6CM1基因为目标基因,通过显微注射法注射不同浓度的dsRNA到烟粉虱4龄若虫,荧光定量PCR检测其沉默效果。结果表明:在对单头烟粉虱注射50 n L时,注射不同浓度的dsRNA,对CYP6CM1基因的沉默效果不同,最大沉默效率可达到80%以上。因此,本实验成功构建了烟粉虱的RNAi技术体系,也可用于其它粉虱类害虫的RNAi技术。     

昆虫RNAi技术及其应用

RNAi是近几年发展起来的抑制基因表达的新技术。部分昆虫存在RNAi信号的系统性传播现象,可以将dsRNA直接注射进昆虫的卵、血腔或局部组织,引发远距离靶基因的特异性沉默,建立起了Embryo RNAi,Larval RNAi,Adult RNAi,Parental RNAi,Feeding RNAi和基于转基因技术的可遗传RNAi等昆虫RNAi技术,使RNAi迅速成为了研究昆虫尤其是非模式昆虫基因功能的主要方法。文章拟就RNAi的系统性、昆虫RNAi技术及其应用进行综述。     

转录后水平沉默与基因表达

基因沉默是1个非常复杂和普遍的现象。转录后水平的基因沉默是指转基因在细胞核里能稳定转录,细胞质里却无相应的稳定态mRNA存在的现象。它往往被称为共抑制、静息作用或RNA干预等。本文介绍了转录后水平的基因沉默现象的发现、分子机理和应用等方面的进展。提出了克服转录后水平基因沉默的一些对策。     

Human globin gene expression after gene transfer

Human globin genes can be transferred into mouse and human erythroid cells in culture, and can be appropriately expressed at the mRNA level in these cells. A plasmid containing a human beta globin gene is expressed in mouse erythroleukemia cells (MELC), and another containing a human epsilon or gamma gene is expressed in human erythroleukemia (K562) cells. A neomycin resistance (neoR) gene on the plasmids has been used to select for those cells containing the transferred globin genes; this selection may favor the expression of the globin genes by providing chromosomal positions requiring neoR expression. Analyzing clones resistant to G418, a neomycin analogue, demonstrated globin mRNA expression and induction. Retroviral vectors have also been used to transfer and appropriately express human beta genes in MELC. In addition, a plasmid containing a dihydrofolate reductase (DHFR) gene as well as neoR and beta globin genes has been used to amplify and express beta globin mRNA in MELC. These experiments suggest that high level appropriate expression of human beta globin genes is feasible and provides potentially useful approaches to the long-range goal of gene therapy for sickle cell anemia and beta thalassemia.     

Horizontal gene transfers as metagenomic gene duplications

While it is well accepted that horizontal gene transfer plays an important role in the evolution and the diversification of prokaryotic genomes, many questions remain open regarding its functional mechanisms of action and its interplay with the extant genome. This study addresses the relationship between proteome innovation by horizontal gene transfer and genome content in Proteobacteria. We characterize the transferred genes, focusing on the protein domain compositions and their relationships with the existing protein domain superfamilies in the genome. In agreement with previous observations, we find that the protein domain architectures of horizontally transferred genes are significantly shorter than the genomic average. Furthermore, protein domains that are more common in the total pool of genomes appear to have a proportionally higher chance to be transferred. This suggests that transfer events behave as if they were drawn randomly from a cross-genomic community gene pool, much like gene duplicates are drawn from a genomic gene pool. Finally, horizontally transferred genes carry domains of exogenous families less frequently for larger genomes, although they might do it more than expected by chance.     

基因治疗中外源基因的导入

基因治疗是将遗传物质导入靶细胞以达到治疗疾病的目的,目前基因治疗研究中的主要障碍是如何格外源基因导入靶细胞。本介绍基因治疗的原理和外源基因导入靶细胞时的常用方法,包括显微注射法、电穿孔法、基因枪粒子轰击法等。对基因治疗的现状、存在的问题及未来发展前景作了简要探讨。     

SNAPper: gene order predicts gene function

SNAPper is a network service for predicting gene function based on the conservation of gene order. AVAILABILITY: The SNAPper server is available at http://pedant.gsf.de/snapper. SNAPper-based functional predictions will soon be offered as part of the PEDANT genome analysis server http://pedant.gsf.de.