豆科植物籽实中的昆虫消化道α－淀粉酶抑制剂的研究（Ⅰ）

对６种豆科植物籽实进行了蜚蠊消化道α－淀粉酶抑制剂活性的测试。但只从褐色菜豆（Ｐｈａｓｅｏｌｕｓｖｕｌｇａｒｉｕｓｌ）中检测出特异性抑制剂。该抑制剂在酸性条件下能有效地抑制蜚蠊α－淀粉酶的活性,最适抑制ｐＨ５．４５,３７℃时预温３０分钟后能显示最大抑制活性,不预温时的抑制活性仅为最大抑制活性的２５％;０℃时几乎不显示抑制活性,但在一定范围内,抑制活性随温度的升高而呈近似的线性增加;抑制剂浓度较低时,α－淀粉酶的抑制程度与抑制剂浓度的变化成正比。但超过约５０％后,抑制程度只随抑制剂浓度的增加而缓慢上升并趋近于最大值。     

中药提取物中α-葡萄糖苷酶抑制剂的筛选

目的：从中药中筛选α-葡萄糖苷酶抑制剂。方法：采用α-葡萄糖苷酶、淀粉酶以及蔗糖酶活性测定方法,对126种经水煮醇沉提取的常用中药进行α-葡萄糖苷酶抑制活性筛选。结果：在0．28mg／ml反应体系下,24种中药提取物显著抑制α-葡萄糖苷酶活性;在0．1mg／ml反应体系下,5种中药提取物抑制α-淀粉酶活性。大黄、山茱萸、赤芍、五倍子对α-葡萄糖苷酶、α-淀粉酶以及转化酶活性均有抑制作用,与阳性药物拜唐苹比较,这4种中药抑制α-淀粉酶的活性较低,但抑制α-葡萄糖计酶和转化酶的活性明显强于拜唐苹。结论：某些中药提取物能显著抑制α-葡萄糖苷酶活性,如果对其进一步分离、纯化并提取活性部位,可望获得抑制活性更强的中药α-葡萄糖苷酶抑制剂。     

三尖杉酯碱抑制脱氧核糖核酸生物合成机制的研究 Ⅱ.三尖杉酯碱对DNA聚合酶α的影响

本文报告了三尖杉酯碱对艾氏腹水癌和小鼠L_(1210)白血病细胞DNA聚合酶α的抑制作用。癌细胞破碎后,经超速离心,DEAE-纤维素和磷酸纤维素P_(11)柱层析部分纯化了DNA聚合酶α。该酶在1μM三尖杉酯碱存在时的抑制率为40%左右。在一定的三尖杉酯碱浓度范围内,酶的抑制率随药物浓度的增加而升高。经药物预保温的DNA,模板活性没有变化;而经药物预保温的酶,其活性受到了显著的抑制。当酶量或模板量固定不变时,则过量的模板或过量的酶均能降低药物的抑制率。上述结果初步表明三尖杉酯碱可能是酶的竞争性抑制剂。     

三尖杉酯碱抑制脱氧核糖核酸生物合成机制的研究——Ⅱ.三尖杉酯碱对DNA聚合酶α的影响

本文报告了三尖杉酯碱对艾氏腹水癌和小鼠L_(1210)白血病细胞DNA 聚合酶α的抑制作用。癌细胞破碎后,经超速离心,DEAE-纤维素和磷酸纤维素P_(11)柱层析部分纯化了DNA 聚合酶α。该酶在1μM 三尖杉酯碱存在时的抑制率为40%左右。在一定的三尖杉酯碱浓度范围内,酶的抑制率随药物浓度的增加而升高。经药物预保温的DNA,模板活性没有变化;而经药物预保温的酶,其活性受到了显著的抑制。当酶量或模板量固定不变时,则过量的模板或过量的酶均能降低药物的抑制率。上述结果初步表明三尖杉酯碱可能是酶的竞争性抑制剂。     

解淀粉芽孢杆菌中温α-淀粉酶基因的克隆、表达与酶学性质分析

以中温α-淀粉酶生产菌株Bacillus amyloliquefaciens M23基因组DNA为模板。PCR扩增得到了2．0kb α-淀粉酶基因全长序列。该基因由上游启动子220bp,结构基因1544bp和终止序列320bp构成。将无信号肽的α-淀粉酶结构基因amyQ,克隆入表达载体pET28a,转化E．coli BL21（DE3）,经诱导,测定α-淀粉酶活性。结果表明：α-淀粉酶基因amyQ获得了活性表达,酶活力为2．297U／mL,SDS-PAGE电泳结果显示出分子量约为58kDa特异性蛋白质条带。酶学性质分析表明,重组α-淀粉酶的最适反应温度为60℃,最适反应pH为6．5,在60℃保温15min保持85％以上活性,超过15min,酶迅速失活,在pH5．5～10．0环境下稳定。水解产物分析表明：淀粉水解终产物主要为麦芽寡糖和糊精和少量葡萄糖。     

重组超耐热酸性α-淀粉酶的分离纯化及其性质研究

基因工程菌所产生的重组超耐热酸性α-淀粉酶,通过超滤浓缩、脱盐和聚丙烯酰胺垂直板凝胶电泳进行纯化,得到电泳纯的超耐热酸性α-淀粉酶,纯化倍数为11.7,活力回收率为29.8%。用SDSPAGE测得该酶的分子量为55kD,酶的等电点pI(室温)为5.0,以可溶性淀粉为底物的Km值为1.12gL,用硫酸酚法测得其含糖量为15.4%。该酶的最适反应温度为95℃,最适反应pH值为4.5。在pH4.0～7.0室温放置48h酶活没有变化,110℃保温1h残留60%活力。Cr3 、Fe2 、Cu2 抑制酶的活性,Ca2 对酶活无影响。EDTA和DTT对酶的活性无影响。     

人PSP94的分泌表达及其表达产物抗前列腺癌作用

将编码人 94个氨基酸的前列腺分泌蛋白 ( PSP94) c DNA与酵母整合载体 p PICZαA重组 ,构建的重组质粒线性化后转染酵母细胞 GS1 1 5,获得了 PSP94在酵母细胞中遗传性稳定表达酵母工程细胞 .诱导后的培养物中 ,rh PSP94表达量约为 0 .9mg/L,分子量约 1 6.5k D.培养上清经离子交换层析纯化后 ,目的蛋白的纯度为 92 % .体外在人前列腺癌细胞上活性分析表明 ,rh PSP94以1 0 0μg/L ,对该细胞的抑制率 2 0 .4% ;单纯新型 TNF,以 1 0 3 U/ml,抑制率 2 9.8% ;rh PSP94和新型 TNF以上述同样剂量联合应用 ,抑制率为 86.3% .提示 PSP94在体外对抗前列腺癌细胞有杀伤作用 ,但不明显 ;PSP94与新型 TNF联合应用 ,可使抑制率明显提高 ,可能 PSP94与新型 TNF有协同抗前列腺癌的作用 .     

酸性α-淀粉酶的分离纯化与酶学性质研究

纯化了枯草芽胞杆菌xm-1菌株酸性α-淀粉酶,并对其酶学性质进行了研究。通过硫酸铵沉淀和Sephadex G-75凝胶层析将酸性α-淀粉酶粗酶液纯化了32.5倍,活力回收率为10.0%。酶性质测定结果表明,该酸性α-淀粉酶分子量约为60kD,最适反应温度为45℃、最适作用pH5.0,该酶在pH3.4-6.0下稳定,高温耐受性差。Cu2+、Zn2+、EDTA对酶有不同程度的抑制作用,Ca2+和Mn2+对酶具有较强的激活作用。     

菜花烙铁头蛇毒中一种具有激肽释放酶与纤维蛋白原溶酶活性的Jerdonase

通过DEAESephadexA 5 0阴离子交换、超细SephadexG 10 0分子筛和反相高效液相C4 色谱层析 ,从菜花烙铁头蛇毒冻干粉中纯化出一种具有激肽释放酶活性和α纤维蛋白原溶酶活性的丝氨酸蛋白酶 ,命名为Jerdonase。在 12 .5 %胶浓度的SDS还原电泳条件下 ,该酶分子量大约为 5 5kD ,在非还原电泳条件下 ,分子量大约为 5 3kD。此酶是一种糖蛋白 ,含有约 35 .8%的中性糖。它的N末端氨基酸序列为IIGGDEENINEHPFLVALYDA ,其序列和蛇毒中其他丝氨酸蛋白酶具有非常高的序列相似性。Jerdonase能够催化BAEE、S 2 2 38和S 2 30 2的水解 ,其水解活性可被PMSF抑制 ,但是EDTA对此没有影响。Jerdonase能优先水解人纤维蛋白原的Aα链 ,同时伴随有微弱的Bβ链水解活性。另外 ,此酶能够水解牛低分子量的激肽原 ,释放舒缓激肽。总之 ,所有的结果表明Jerdonase是一个具有多功能活性的蛇毒丝氨酸蛋白酶     

鹰嘴豆种子发芽和成熟过程中α-淀粉酶抑制剂的活性研究

以5种不同来源的α-淀粉酶为检测试剂,对鹰嘴豆种胚芽和子叶α-淀粉酶抑制剂在发芽和成熟过程中的抑制活性进行测定。结果表明:α-淀粉酶抑制剂主要存在于胚芽中; 发芽过程中,发芽1 d后,胚芽提取液对AOA的抑制活性降为9.9%,而对HSA、PPA和PA的抑制活性都检测不到。子叶提取液对AOA和HSA的抑制活性分别降为21.5%和28.3%,而对BSA和PPA则检测不到活性。发芽4 d后,无论是子叶还是胚芽提取液对5种来源的α-淀粉酶都检测不到抑制活性; 种子成熟过程中,子叶和胚芽提取液对α-淀粉酶的抑制活性均随种子成熟度的提高而提高,30 d时达到最大,且胚芽提取液对HSA、PA的抑制活性较高,分别为48.9%和47.5%。     

萌发绿豆种子中的一种大豆胰蛋白酶抑制剂钝化酶

通过 30 %～ 6 0 % (NH4 ) 2 SO4 分级沉淀、DEAE_SepharoseCL_6B离子交换层析、SephacrylS_2 0 0凝胶过滤层析和WatersAP_1离子交换层析 ,从萌发的绿豆 (Vignarabiata (L .)Wilczek)种子中分离纯化出一种可降解大豆胰蛋白酶抑制剂 (STI)的蛋白酶。SDS_PAGE测定该酶的分子量为 2 9.8kD。该酶催化降解STI的Km 值为 76 9.2BAEE/mL ,Vmax为 115 .3BAEE·mL-1·min-1。该酶在 5 0℃、pH 8.0、相对酶活力 5 0 0 0BAEE/mL和 4h的反应时间时可将脱脂大豆粉中的STI活性钝化 90 .91%。该酶在温度低于 5 0℃及pH 6 .5～ 8.5时能保持其活性。     

大孔树脂纯化嘉宝果叶片多酚及其生物活性和组成分析

为探讨嘉宝果(Myrciaria cauliflora)叶片多酚的分离纯化方法,对4种树脂(NKA-2、NKA-9、HPD-826和HPD-400A)进行了筛选,并分析了其多酚的抗氧化、体外降糖活性和组成成分。结果表明,NKA-9树脂适于嘉宝果叶片多酚纯化,最佳工艺条件为:上样液质量浓度2.00 mg/mL、洗脱液乙醇体积分数70%、上样流速1.0 mL/min、上样量204 mL、洗脱流速0.9 mL/min、洗脱量70 mL。嘉宝果叶多酚纯度可达69.86%。嘉宝果叶片纯化后的多酚抗氧化及α-葡萄糖苷酶抑制活性高于纯化前,但α-淀粉酶抑制活性低于纯化前。HPLC结果表明,嘉宝果叶片中含有杨梅苷、芦丁、金丝桃苷和鞣花酸,其中鞣花酸含量最高[(16.15±0.49) mg/g]。因此,NKA-9树脂适合分离纯化嘉宝果叶片多酚,纯化后的多酚抗氧化及α-葡萄糖苷酶抑制活性增强。     

不同分子量菊芋多糖的生物活性研究

研究不同醇沉组份的菊芋多糖分子量和其抑制α-葡萄糖苷酶活性与抗氧化活性差异。菊芋水提物分级醇沉获得粗多糖,过Sephadex G-50凝胶柱进行纯化,得到重均分子量为1959、2180、2746、2011 Da的多糖组分:JAP-1、JAP-2、JAP-3和JAP-4。测定这些组分体外抑制α-葡萄糖苷酶活性和对DPPH与羟基自由基清除能力。结果表明,JAP-4具有较明显的抑制α-葡萄糖苷酶活性,在5 mg/mL时抑制率为20.32%。JAP-1、JAP-2、JAP-3和JAP-4均有显著的抗氧化活性,其中JAP-2对DPPH自由基和羟基自由基的清除活性优于其他组分。JAP-2在2 mg/mL时对DPPH自由基和羟基自由基清除率分别达到84.50%和89.74%,接近于Vc的抗氧化活性。不同分子量菊芋多糖的活性存在差异,可能是由于分子量的不同所导致。     

蚯蚓中抗肿瘤蛋白组分的提取分离及其抗肿瘤活性

以赤子爱胜蚓为原料 ,通过蛋白质的丙酮沉淀和凝胶过滤 ,分离得到一组抗肿瘤活性蛋白成分 (简称蚯蚓抽提物 ) ;这组成分富含Fe、Zn、Cu以及Se等微量元素 ,蛋白含量为 6 0 4 3± 2 36 %(n =5 ) .体外实验中 ,通过MTT法和SRB法测定了蚯蚓抽提物对多种人癌细胞株 (HCT 116、SY5Y、K5 6 2、MGc80 3和HeLa)以及正常细胞株 (HEK2 93和COS 7)的抑制杀伤率 .结果表明 ,蚯蚓抽提物对癌细胞的杀伤有一定的选择性 ,受试人癌细胞达到 5 0 %生长抑制率所需作用浓度约 6 0～110mg L ;但是 ,10 0℃煮沸 5min后 ,该抑制活性完全消失 .通过纤维蛋白平板法 ,测得蚯蚓抽提物同时具有纤溶酶和纤溶酶原激活酶的活性 .体外测得丝氨酸蛋白酶抑制剂aprotinin和PMSF能显著抑制蚯蚓抽提物的细胞杀伤活性 .体内实验中 ,蚯蚓抽提物能有效延长荷瘤 (S180 )小鼠的生存时间 ,并使其身体机能得到明显改善 .腹膜内注射剂量为 2 8mg kg和 36mg kg时 ,生命延长率分别为135 3%和 12 3 5 % ,和标准药物 (环磷酰胺 )治疗后结果 (76 5 % )相比 ,有显著性差异     

栗精碱对棉铃虫中肠组织可溶型海藻糖酶的抑制效应

【目的】研究一种植物源化合物栗精碱对棉铃虫Helicoverpa armigera(Hübner)5龄幼虫中肠组织可溶型海藻糖酶的活体和离体抑制效果,初步探索其抑制作用。【方法】经过离子交换层析和疏水层析从棉铃虫5龄幼虫中肠组织分离纯化得到可溶型海藻糖酶,通过凝胶过滤层析确定其分子量。分别用不同浓度的抑制剂进行离体和活体抑制研究,得出栗精碱对可溶型海藻糖酶的抑制率和抑制中浓度(IC50),并采用Lineweaver-Burk和Dixon作图法分析抑制类型。【结果】棉铃虫中肠可溶型海藻糖酶比活力为2.022 U/mg,回收率为67.57%,纯化倍数为23.84,分子量约为67 k Da。离体抑制研究表明,3.75,7.5,15和30μmol/L的栗精碱对可溶型海藻糖酶的抑制率分别为42.00%,50.30%,58.32%和67.33%;抑制中浓度(IC50)为7.32μmol/L。通过LineweaverBurk和Dixon作图法,确定栗精碱是棉铃虫中肠组织可溶型海藻糖酶的一种有效的竞争性抑制剂,Ki值为4.9μmol/L。活体抑制研究表明,分别注射浓度为30,15和7.5μmol/L栗精碱10和20 h后,棉铃虫中肠可溶型海藻糖酶活性被显著抑制(P0.05)。相应地,注射后随着时间的延长,血淋巴海藻糖含量连续增加。而注射栗精碱20 h后,血淋巴葡萄糖浓度显著下降,使棉铃虫的能量供给出现障碍。【结论】结果表明,栗精碱是棉铃虫中肠可溶型海藻糖酶的一种有效的抑制剂,可为下一步开发有效的棉铃虫杀虫剂提供理论支持。     

假单胞杆菌D-海因酶的纯化及酶学性质

D 海因酶是工业上生产D 型氨基酸的关键酶 ,用热变性 ,硫酸铵沉淀及SepharoseQfastflow ,Phenyl Sepharosefastflow ,Superose 1 2等柱层析步骤从Pseudomonas 2 2 62菌体中分离纯化了该酶 ,纯化倍数约为 60 ,活力回收约为 1 6%。该酶为同源二聚体 ,分子量约为 1 0 9kD ,亚基分子量约为 53 7kD ,反应最适pH为 8 0 ,最适温度为 70℃ ,在pH6.0～ 1 0 0和温度 60℃以下稳定 ,该酶对巯基试剂敏感 ,大多数二价金属离子如镁、锰离子等能促使酶活提高 ,但高浓度锌离子能抑制酶活 ,以二氢尿嘧啶为底物的米氏常数Km =2 .5× 1 0 - 2 mol L。该酶的N末端1 0个氨基酸残基依次为MDKLIKNGTI     

MG-132提高TNFR-Fc融合蛋白在CHO细胞中表达的研究

目的:在不影响细胞活力的前提下,通过抑制人肿瘤坏死因子受体-Fc(TNFR-Fc)融合蛋白的降解,提高其在中国仓鼠卵巢(CHO)细胞中的产量和质量。方法:通过在细胞培养过程中加入全蛋白质合成抑制剂Cycloheximide、溶酶体抑制剂Leupeptin、蛋白酶体抑制剂MG-132,验证TNFR-Fc融合蛋白在CHO细胞的降解途径;免疫印迹(Western blot)方法检测在细胞内TNFR-Fc融合蛋白的变化,酶联免疫吸附试验(ELISA)方法检测分泌表达的TNFR-Fc融合蛋白的含量。Protein A亲和层析纯化细胞培养液上清,高效液相色谱(HPLC)检测重组蛋白的纯度,并通过阻断肿瘤坏死因子α(TNFα)诱导的L929细胞毒作用来检测纯化的TNFR-Fc蛋白的活性。结果:TNFR-Fc在CHO细胞内,经泛素蛋白酶体途径降解,稳定表达TNFR-Fc的CHO细胞培养过程中添加50μmol/L MG-132,可以使TNFR-Fc融合蛋白的分泌表达量提高42.35%,纯化后,二聚体比例提高28.60%,并且纯化后目的蛋白的比活性也增加。结论:在不影响细胞活力、蛋白质生物学活性的前提下,添加蛋白酶体抑制剂MG-132提高TNFR-Fc融合蛋白在CHO细胞中的表达量,为进一步研究从抑制蛋白质降解途径来提高重组蛋白在CHO细胞中的表达量提供了现实依据。     

一株布氏乳杆菌所产类细菌素的初步纯化与部分特性

从分离自内蒙古传统乳制品的67株乳酸菌中筛选得到一株产生类细菌素的布氏乳杆菌KLDS1.0364,对其所产类细菌素进行初步分离纯化,同时研究其所产类细菌素的生物学特性.KLDS1.0364无细胞发酵上清液经阳离子交换树脂纯化后,采用tricine-SDS-PAGE测定类细菌素分子量,并测定了类细菌素的部分特性.KLDS1.0364产生的类细菌素分子量约为21.6kD,对热和pH值稳定,可被多种蛋白酶失活,不能被过氧化氢酶和α-淀粉酶失活.KLDS1.0364产生的类细菌素的作用方式是杀菌,且抑菌谱广,可抑制多种革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌和真菌.     

富硒菊花提取物的抗氧化活性及其对α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶活力的影响

本研究比较了富硒菊花与普通菊花的抗氧化活性与α-淀粉酶、α-葡萄糖苷酶抑制作用。富硒菊花甲醇提取物清除ABTS·+、DPPH·、OH自由基的EC50分别为0.078 5、0.068 0、0.346 9 mg/mL,普通菊花分别为0.128 9、0.121 2、0.313 3 mg/mL。富硒菊花提取物的总还原力与ABTS·+、DPPH·自由基清除能力一定强于普通菊花。富硒菊花提取物抑制α-淀粉酶、α-葡萄糖苷酶的IC50分别为2.190 9、4.123 9 mg/mL,普通菊花分别为3.449 5、10.696 3 mg/mL。富硒菊花提取物的抗氧化活性以及α-淀粉酶、α-葡萄糖苷酶抑制率呈现出一定的剂量依赖性,量效关系拟合方程具有较高的拟合度。富硒菊花的抗氧化活性与α-淀粉酶、α-葡萄糖苷酶抑制作用普遍优于普通菊花,这可能与其中所含的多酚、黄酮类化合物有关。本研究为富硒菊花资源的科学开发和综合利用提供了参考。     

过氧化氢法改性羊肚菌多糖研究

为提高羊肚菌多糖体外降血糖能力,本试验在筛选羊肚菌多糖改性方法的基础上,以α-淀粉酶抑制率为参数,运用单因素试验结合响应面分析法建立了羊肚菌多糖改性产物对α-淀粉酶抑制率的多元二次回归方程模型,优化了羊肚菌多糖过氧化氢氧化降解工艺条件。试验表明料液比为1∶8.55、pH为7.09、温度为47.8℃、时间为3.02 h的条件下的改性效果最好,在该条件下重复测定三次所得羊肚菌多糖过氧化氢氧化改性产物的α-淀粉酶抑制率为16.30%±1.22%,与模型预测结果的相对误差为0.11%,是改性前的17.16倍。同时,蔗糖酶抑制率为78.13%±5.09%,麦芽糖酶抑制率为16.48%±3.27%,α-葡萄糖苷酶抑制率为21.40%±3.81%,分别比改性前提高了1.07倍、1.64倍、1.22倍。与常用的降糖药阿卡波糖相比,羊肚菌多糖改性产物的α-淀粉酶抑制率、麦芽糖酶抑制率、α-葡萄糖苷酶抑制率分别提高了1.44、1.63和1.88倍,蔗糖酶抑制率与阿卡波糖差异不显著(P0.05)。羊肚菌多糖经过氧化氢氧化改性的产物呈现明显的多糖红外吸收特征,对糖苷酶抑制效果显著提升,提高了其体外降血糖能力。