解淀粉芽孢杆菌NK10.BAhjaWT抑真菌作用的研究

芽孢杆菌属以多产抗菌素闻名。通过筛选几十株不同来源的芽孢杆菌, 获得1株具有强抑真菌活性的芽孢杆菌。经过16S rDNA检测与Biolog分析, 确定此株菌为解淀粉芽孢杆菌。本实验对摇瓶发酵的条件进行了优化, 经过对发酵上清液硫酸铵盐析、透析、真空冷冻干燥获得粗提蛋白。并对粗蛋白的热稳定性、pH稳定性、抗蛋白酶水解能力、离子稳定性以及抑真菌谱进行了研究, 最后使用扫描电镜对抑真菌机制进行了探索。     

一株抗真菌解淀粉芽孢杆菌的分离鉴定及其发酵条件的初步研究

从堆肥中分离到一株对植物病原菌尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)具有强烈抗菌活性并具有较广抗菌谱的细菌Q-12菌株。通过形态观察、生理生化实验1、6S rDNA同源性序列分析以及部分特异性基因序列分析,鉴定该菌为解淀粉芽孢杆菌。该菌的最适培养基组成为:葡萄糖5g/L,NH4Cl 1g/L,牛肉膏0.8g/L,氯化镁5g/L。最适培养温度为33℃,最适培养pH为6.0,最适培养时间为40h。     

利用人工Mu转座技术研究解淀粉芽孢杆菌的功能基因

目的:利用人工Mu转座技术研究解淀粉芽孢杆菌的功能基因。方法:使用加入0.5%甘氨酸的M9-YE培养基,细菌生长到D600nm值为0.5时制备感受态细胞,加入Mu转座复合物(含42ngMuDNA),以1.8kV电压电击获得转化子。对转化子进行功能突变表型筛选、基因克隆、DNA序列分析,以确定插入突变的功能基因。结果:获得最佳电转化效率1.9×103CFU/μgDNA。同时获得2个芽孢杆菌抑真菌作用的调节基因rpmGA和yxlC。结论:人工Mu转座技术是研究芽孢杆菌功能基因的快速有效的好方法。     

解淀粉芽孢杆菌YP6中碱性磷酸酯酶AP3的酶学性质及其溶磷作用

【背景】微生物溶磷机制多种多样,利用其解磷能力可有效促进植物生长。【目的】探究溶磷菌解淀粉芽孢杆菌YP6的溶磷机制,提高磷资源的利用率。【方法】在大肠杆菌BL21(DE3)中克隆并表达YP6中磷酸酯酶AP3基因,研究AP3的酶学性质并验证AP3的溶磷作用。【结果】AP3为碱性磷酸酯酶,最适反应pH为10.3,最适反应温度为40°C,AP3对pNPP亲和性较高,V_m为4 033.4μmol/(min·mg),K_m为12.2 mmol/L。用纯酶AP3处理24 h后,磷矿粉中的有效磷显著增加。接种菌株YP6发酵7 d后,也使土样中有效磷明显增长。【结论】揭示了碱性磷酸酯酶AP3的溶磷能力,丰富了溶磷微生物库及对微生物溶磷机制的认识。     

解淀粉芽孢杆菌抗菌活性物质的分离纯化及抑菌活性研究

植物真菌病害给农业生产带来了巨大损失,因此对生物农药的开发迫在眉睫。从堆肥中分离得到一株解淀粉芽孢杆菌,它具有强烈的抗真菌活性。其发酵液经硫酸胺沉淀得到粗提液,粗提液经Hiprep 26/10 Desalting,HiLoad 26/10 Q Sepharose和HPLC多步柱层析,分离纯化得到一种抗真菌活性物质。ESI-MS质谱法测得其分子量为1498 Da。经活性检测发现,该纯物质对尖孢镰刀菌、草莓蛇病菌等植物病原真菌具有很强的抑制作用,对毛霉、黑曲霉等食品腐败菌也有抑制作用。经过显微镜观测,该物质可造成草莓蛇病菌菌丝生长异常,表现在菌丝弯曲,顶端膨大,分生孢子数量减少。     

解淀粉芽孢杆菌对三角褐指藻的化感作用研究

实验研究不同剂量(100、500和1000μL)的解淀粉芽孢杆菌菌液、解淀粉芽孢杆菌代谢产物和解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)及代谢产物混合液3种组合对三角褐指藻(Phaeodactylum tricornutum)生长的影响.结果表明,解淀粉芽孢杆菌、其代谢产物和两种的混合液对三...     

一株耐受酒精解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens CGMCC 6262)的研究

从酱香型酒醅中分离鉴定得到一株解淀粉芽孢杆菌(B.amyloliquefaciens CGMCC 6262)。该菌具有良好的耐受乙醇特性,能够耐受12%(v/v)的乙醇,且4%以下乙醇对其生长具有促进作用。研究该菌耐受乙醇机制,发现发酵过程中乙醇的浓度下降,且4%乙醇显著促进该菌产生有机酸,并诱导该菌产生酯酶,最高酶活达到8.01 U/mL,在酯酶作用下,该菌能够代谢产生丙酸乙酯、丁酸乙酯、庚酸乙酯和苯乙酸乙酯等酯类物质。     

解淀粉芽孢杆菌内源启动子的筛选及表达碱性果胶酶的应用研究

【目的】通过检测目的基因的转录水平和表达强度,筛选来源于解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)的内源启动子,确定适合碱性果胶酶基因表达的强启动子,并进一步对选用的强启动子进行分析。【方法】通过生物信息学手段对启动子片段进行预测与筛选,采用相对荧光强度、酶活力等表征手段进行分析,同时采用实时荧光定量聚合酶链式反应(real-time fluorescence quantitative polymerase chain reaction, RT-qPCR)技术检测不同启动子的转录水平。【结果】启动子PrapA、PmetE-1、Phin-1表达碱性果胶酶的活力分别是P43启动子的9.8倍、4.8倍、3.0倍,筛选出的这3个强启动子为其他异源基因在解淀粉芽孢杆菌中的表达奠定了基础。【结论】通过生物信息学手段预测及筛选启动子,筛选得到比较强的启动子PrapA、PmetE-1和Phin-1,有效提高了碱性果胶酶的表达量。     

内生型解淀粉芽孢杆菌YTB1407对甘薯根系的促生作用及其调控机理

本实验室从西洋参根中分离筛选获得兼具生防和促生效果的内生型解淀粉芽孢杆菌YTB1407.为调查其应用潜力,以甘薯为材料,以无菌水灌根处理(CK)为对照,采用不同浓度YTB1407菌悬液灌根盆栽甘薯植株,通过对甘薯生长前期3个主要生育时间点YTB1407在植株内的内生定殖检测和根系表型效应比较,筛选菌悬液灌根的最适处理浓度.对根系内源生长素吲哚乙酸(IAA)、细胞分裂素玉米素核苷(ZR)、反式玉米素核糖核苷(t-ZR)的含量和吲哚乙酸氧化酶类中的吲哚乙酸氧化酶(IAAO)、过氧化物酶(POD)和多酚氧化酶(PPO)的活性进行分析.结果表明: YTB1407促进了甘薯生长前期根系统的定殖、不定根幼根的伸长生长及侧根的发生,提高了根系活力;在甘薯生长后期形成了更大的吸收根系生物量和更低的地上部和总根系生物量比.其中OD₆₀₀值为0.50的菌悬液处理(T_0.50)促生效应显著,在甘薯茎叶封垄期的单株块根鲜质量和有效薯块数量最高.YTB1407通过提高ZR、t-ZR含量,降低IAAO活性、提高PPO活性和IAA含量以及(t-ZR+ZR)/IAA,促进块根分化建成初期甘薯不定根幼根向块根的分化;通过降低IAAO、PPO活性和提高IAA含量,降低(t-ZR+ZR)/IAA,促进块根分化建成后期甘薯分化根向块根的建成.     

解淀粉芽孢杆菌SWB16菌株脂肽类代谢产物对球孢白僵菌的拮抗作用

【目的】筛选对球孢白僵菌(Beauveria bassiana)具有较强拮抗作用的细菌菌株及检测菌株脂肽类代谢产物的拮抗活性。【方法】通过形态学观察、生理生化实验、16S rRNA和gyrA基因序列分析鉴定目标菌株;用滤纸片扩撒法(K-B法)测定抑菌圈的直径;采用甲醇萃取菌株发酵液以提取脂肽类代谢产物,并显微观察提取物对白僵菌分生孢子及菌丝的拮抗作用;高效液相色谱-质谱联用方法及靶基因克隆技术检测菌株脂肽类代谢产物的主要成分和基因。【结果】从植物盾叶薯蓣(Dioscorea zingiberensis C.H.Wright)组织内分离得到了一株对球孢白僵菌具有较强拮抗活性的菌株SWB16,该菌株属于解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens),其脂肽类提取物对球孢白僵菌分生孢子的发芽和菌丝生长均具有明显的抑制作用,质谱检测表明提取物的主要成分是芬枯草菌素和伊枯草菌素,从菌株基因组中克隆到编码芬枯草菌素和伊枯草菌素的fenB基因和ituA基因。【结论】解淀粉芽孢杆菌(B.amyloliquefaciens)SWB16菌株能产生脂肽类抗生素并对球孢白僵菌具有拮抗作用,拮抗活性显示该菌株对防治家蚕等经济昆虫的白僵病具有潜在的应用价值。     

解淀粉芽胞杆菌抗真菌活性研究进展

解淀粉芽胞杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)具有很强的抑制植物病原真菌的能力。其菌体细胞能产生多种酶类、脂肽类抗生素、生物表面活性素、聚酮类化合物和抑菌蛋白,同时具有诱导植物产生系统抗性(ISR)的能力,因此在工农业、种植业、养殖业、食品加工业、果蔬的采后保鲜和饲料业等行业具有重要价值。本文对解淀粉芽胞杆菌抗真菌作用、抗真菌能力提高策略、抗菌化合物合成调节、抑制真菌机制及其引发的ISR等问题进行了深入探讨和综述。     

普鲁兰酶基因在解淀粉芽孢杆菌BF7658菌株中的分泌表达

根据文献报道的核苷酸序列合成Bacillus deramificans普鲁兰酶成熟肽编码基因BdP。将BdP基因插入芽孢杆菌分泌表达载体pUC980信号肽编码区下游,获得重组质粒pUC980-BdP,重组质粒转化中温α-淀粉酶生产菌解淀粉芽孢杆菌BF7658菌株。摇瓶发酵实验表明,重组转化子发酵液有明显普鲁兰酶酶活,约48h酶活达到最高水平,为2．8ASPU／mL。酶学性质分析表明,重组酶最适作用温度约为60℃,最适反应pH为5．0,60℃保温3h仍保存50％的活性。重组酶性质适合淀粉糖化工艺的要求。     

Isolation of the Bacillus subtilis antimicrobial peptide subtilosin from the dairy product-derived Bacillus amyloliquefaciens

Aims: To purify and characterize an antimicrobial protein (bacteriocin) isolated from the dairy product‐derived Bacillus amyloliquefaciens. Methods and Results: An unknown bacterial species cultured from the Yogu Farm? probiotic dairy beverage was identified through 16S ribosomal RNA analysis as B. amyloliquefaciens, a phylogenetically close relative of Bacillus subtilis. The cell‐free supernatant (CFS) of overnight cultures was active against Listeria monocytogenes and also against clinical isolates of Gardnerella vaginalis and Streptococcus agalactiae. At the same time, several isolates of vaginal probiotic Lactobacilli were resistant to the CFS. The nature of the compound causing inhibitory activity was confirmed as proteinaceous by enzymatic digestion. The protein was isolated using ammonium sulfate precipitation, and further purified via column chromatography. PCR analysis was conducted to determine relatedness to other bacteriocins produced by Bacillus spp. Conclusion: The antimicrobial protein isolated from B. amyloliquefaciens was shown to be subtilosin, a bacteriocin previously reported as produced only by B. subtilis. Significance and Impact of the Study: This is the first report of intra‐species horizontal gene transfer for subtilosin and the first fully characterized bacteriocin isolated from B. amyloliquefaciens. Finally, this is the first report on subtilosin’s activity against bacterial vaginosis‐associated pathogens.     

氮源和碳源对解淀粉芽孢杆菌Q-426抗菌脂肽合成的影响

微生物来源的环状脂肽在生物农药以及医学领域极具应用潜力。通过测量抑菌活性并利用反相高效液相色谱(RP-HPLC),液相质谱联用(HPLC-MS)和串联质谱(MS/MS)技术检测抗菌脂肽组分的变化研究了氮(N)源、碳(C)源和培养基中的初始pH值对解淀粉芽孢杆菌Q-426菌株中抗菌脂肽bacillomycin D和fengycins合成的影响,从而为进一步研究它们生物合成的基因调控以及更有目的性提高产量提供理论依据。结果表明:L-组氨酸、L-赖氨酸、甘油、山梨醇以及培养基中的[OH]-均能促进脂肽bacillomycin D的合成,但它们在该实验菌株抗菌脂肽bacillomycinD合成途径中的调控靶点有所不同。     

水产养殖用解淀粉芽孢杆菌微胶囊的安全性评价

目的:评价水产养殖用解淀粉芽孢杆菌微胶囊的安全性。方法:参照《GB/T21805-2008化学品藻类生长抑制试验》、《GB/T13266-91水质物质对蚤类(大型蚤)急性毒性测定方法》、《GB/T13267-91水质物质对淡水鱼(斑马鱼)急性毒性测定方法》、《渔药临床试验技术规范》等国家标准及相关法规,观察了解淀粉芽孢杆菌微胶囊对小球藻生长的抑制作用以及对大型蚤、斑马鱼和草鱼的急性毒性,分析了其对养殖水体主要理化因子的影响。结果:解淀粉芽孢杆菌微胶囊在终浓度为0.2～2 000mg/L时对小球藻生长具有促进作用,对小球藻的半数抑制浓度大于2 000mg/L,而且其对大型蚤、斑马鱼和草鱼的半数致死浓度也大于2 000mg/L(或mg/kg体重)。此外,在养殖水体中加入解淀粉芽孢杆菌微胶囊至终浓度为0.2～2 000mg/L后14天内,各浓度组的氨氮含量、硫化物和pH均缓慢下降,仅亚硝酸盐氮含量稍微升高后逐渐缓慢降低,但这些理化因子的变化与解淀粉芽孢杆菌微胶囊的加入量呈负相关关系。结论:解淀粉芽孢杆菌微胶囊实际无毒,对养殖水中氨氮、亚硝酸盐氮、硫化物和pH等理化因子的影响均控制在虾虎鱼仔鱼、黄颡鱼、白斑狗鱼、克氏原螯虾等水产养殖动物的安全浓度范围内,为其在水产养殖中的安全应用提供了重要的科学依据。     

Transformation of Bacillus amyloliquefaciens protoplasts with plasmid DNA

Abstract A method for efficient polyethylene glycol (PEG)-mediated transformation of Bacillus amyloliquefaciens protoplasts with plasmid DNA is described. The best conditions found for protoplast regeneration included using 0.45 M sucrose both during the cultivation of the cells and (as an osmotic stabilizer) during their treatment with lysozyme, whereas 0.25 M sodium-succinate was added to the regeneration plates. Under these conditions about 5–10% of input cells regenerated. The highest transformation frequency with plasmid DNA was obtained with a PEG 6000 concentration of 22.5% (w/v). Transforming B. amyloliquefaciens strains with the plasmid pUB110 isolated from B. amyloliquefaciens resulted in 2–4 · 10⁵ transformants/μg DNA, 100–1 000-times as high as with DNA from Bacillus subtilis , suggesting a restriction barrier between the two species. Transformation of B. amyloliquefaciens with plasmids pC194 or pE194 cop -6 gave poor yields and no restriction barrier could be demonstrated for these plasmids. However, by curing pC194 from one of the transformants, a mutant strain compatible to both the plasmids could be isolated, yielding 2–3·10⁴ transformants/μg DNA. Both laboratory and industrial B. amyloliquefaciens strains could be transformed with the procedure.