幽门螺杆菌Ⅳ型分泌系统cagT基因的克隆表达及其重组蛋白对SGC-7901细胞增殖和分泌细胞因子功能的影响

[目的]初步研究幽门螺杆菌(Helicobacter pylori,H.pylori)NCTC 11637 cagT(HP0532)基因对SGC-7901细胞增殖和白细胞介素-8(IL-8)分泌的影响.[方法]应用PCR技术从H.pylori基因组DNA中扩增cagT编码基因片段,将其定向插入pQE30载体中,双酶切鉴定筛选阳性克隆.测序分析确认后,IPTG诱导表达,表达蛋白以Ni2 -NTA柱进行纯化,并经Western blot鉴定,纯化的蛋白作用于SGC-7901细胞,提取细胞总RNA,RT-PCR扩增IL-8,并用MTT法检测蛋白对细胞增殖的影响.[结果]成功克隆了cagT基因,全长843bp(GenBank 登录号为 EF114758),编码280个氨基酸,与GenBank公布的其他H.pylori菌株基因序列的核苷酸同源性为97%～99%.工程菌诱导后SDS-PAGE显示新生表达蛋白带,相对分子质量约为32kDa,经Ni2 -NTA柱纯化后可获得纯度为98%重组蛋白.经透析复性后的蛋白(终浓度10μg/mL)作用于SGC-7901细胞后,可诱导细胞因子IL-8在mRNA水平上的表达.不同浓度CagT蛋白与SGC-7901细胞作用,细胞增殖的程度随着蛋白浓度的增加逐渐降低,细胞的增殖受到抑制.[结论]CagT蛋白可刺激SGC-7901细胞IL-8的表达,并抑制细胞增殖,为进一步研究其生物学功能奠定了基础.     

幽门螺杆菌Ⅳ型分泌系统HP0527-C基因的克隆表达及其生物学功能的初步研究

为克隆表达幽门螺杆菌（Helicobacter pylori,H.pylori）NCTC 11637 hp0527-c 基因,探讨其生物学功能。设计引物扩增,T-A克隆,测序正确后构建表达载体pET-28a- hp0527-c,转化大肠杆菌BL21,经IPTG诱导表达后以Ni2＋-NTA柱获得纯度为98％重组蛋白。经Western blot鉴定正确后,免疫新西兰大白兔获得了较高滴度的多克隆抗体;将重组蛋白作用于BGC-823细胞,RT-PCR检测细胞IL-8mRNA表达增高;同时用MTT法来检测重组蛋白对细胞增殖的影响,结果呈现一定量的时间和剂量依赖性。已成功克隆了HP0527-C的重组蛋白,初步探讨了其与细胞之间的相互作用,为进一步阐明H.pylori致病机制奠定了基础。     

幽门螺杆菌Cag致病岛hp0523基因的缺失及其对CagA蛋白转运能力的影响

摘要: 【目的】构建幽门螺杆菌Cag致病岛编码的hp0523基因缺失株,为研究hp0523基因的功能奠定基础。【方法】本研究利用同源重组原理,设计并扩增了hp0523基因上下游同源臂片段,构建hp0523基因缺失自杀质粒pBlueKM40-?hp0523,电击转化进入幽门螺杆菌后,通过抗生素筛选后并经PCR验证无误后,获得hp0523基因缺失株H. pylori 11637?hp0523;采用幽门螺杆菌与胃癌上皮细胞BGC-823共培养后,分析该基因缺失前后对细胞毒性蛋白CagA转运能力的影响;并分析比较     

异源表达的幽门螺杆菌cag4蛋白有溶菌糖基转移酶活性

摘要【目的】构建融合基因原核表达载体pET-28a- cag4,并表达重组融合蛋白cag4,分析重组融合蛋白的酶活性,为新型抗生素（或是抗菌药物）的研发提供作用靶位。【方法】本研究利用PCR技术从幽门螺杆菌NCTC11637中克隆了cag4基因;经T-A克隆,酶切鉴定,构建了原核表达载体pET-28a- cag4;经测序鉴定正确后,转化进入大肠埃希菌 BL21(DE3)进行异源表达。利用IPTG体外诱导后,经SDS-PAGE和Western Bolt鉴定目的蛋白表达后,采用Ni2＋-NTA柱在变性条件下纯化目的蛋白,并对重组蛋白进行透析复性处理。将SDS煮沸法获得的溶壁微球菌肽聚糖掺入SDS-PAGE作为底物,进行酶谱分析。【结果】在大肠埃希菌 BL21(DE3)中获得高效表达的重组蛋白; 经SDS-PAGE和Western Bolt鉴定表达后,采用Ni2＋-NTA柱在变性条件下纯化,并进行透析复性处理。将SDS煮沸法获得的溶壁微球菌肽聚糖掺入SDS-PAGE作为底物,进行酶谱分析,表明目的蛋白具有明显的肽聚糖水解活性; 通过监测浊度下降速率,比较其在不同pH条件下活性的变化,即?A/（min?mg protein）,结果表明,幽门螺杆菌cag4蛋白具有溶菌糖基转移酶活性。【结论】幽门螺杆菌cag4蛋白具有溶菌糖基转移酶活性。     

幽门螺杆菌感染激活NF-κB信号通路促进胃癌SGC-7901细胞炎症因子释放

为了探讨幽门螺杆菌对胃癌SGC-7901细胞炎症因子释放的影响,本研究将幽门螺杆菌感染SGC-7901细胞后,采用细胞计数盒(CCK-8)检测SGC-7901细胞活力,酶联免疫吸附实验(ELISA)检测炎症因子TNF-α、IL-1β以及IL-8的水平,Real-time PCR检测细胞TNF-α、IL-1β以及IL-8 m RNA的表达,蛋白免疫印迹法(Western blotting)检测NF-κB信号通路相关蛋白NF-κB p65蛋白表达以及IκBα磷酸化水平。研究结果表明,幽门螺杆菌感染后,SGC-7901细胞活力显著增加;幽门螺杆菌感染明显上调SGC-7901细胞TNF-α、IL-1β以及IL-8 mRNA的表达;本研究还进一步发现幽门螺杆菌感染显著增加SGC-7901细胞TNF-α、IL-1β以及IL-8的水平;此外,幽门螺杆菌处理的SGC-7901细胞,其NF-κB p65的蛋白表达以及IκBα磷酸化水平均显著上调。本研究的结论初步表明,幽门螺杆菌感染促进胃癌SGC-7901细胞炎症因子的释放,其机制可能涉及激活NF-κB信号通路。     

幽门螺杆菌HP0762蛋白的原核表达纯化及多克隆抗体制备

目的:表达和纯化幽门螺杆菌HP0762蛋白,并制备该蛋白的多克隆抗体。方法:从幽门螺杆菌SS1中经PCR扩增得到了hp0762基因,将其克隆至含有6×His编码序列的原核表达载体pET-28a(+)中,再将重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3),在IPTG诱导下进行蛋白表达;用HiTrap Chelating HP亲和柱纯化重组蛋白,Western印迹进一步鉴定;以纯化后的蛋白为抗原免疫新西兰大耳白兔,制备该蛋白的多克隆抗体;用ELISA和Western印迹检测抗血清。结果:目的蛋白在大肠杆菌BL21(DE3)中获得了可溶性表达,纯化后纯度可达90%以上;制备了针对HP0762重组蛋白的抗血清,抗体ELISA效价为1:256000,Western印迹分析表明该抗体能特异性识别内源性HP0762。结论:完成了HP0762蛋白的原核高效表达与纯化,并制备了其高效价的多克隆抗体,为进一步对其进行疫苗研制与基因功能研究奠定了基础。     

幽门螺杆菌CagA蛋白及其致病机制的研究进展

幽门螺杆菌感染是导致从胃炎到胃癌等一系列胃相关疾病的主要病因,但具体的致病机制仍不是很清楚。细胞毒素相关蛋白A(cytotoxin-associated gene A,Cag A)是幽门螺杆菌编码的一种重要毒力因子,且作为细菌来源的唯一癌蛋白被大量研究。Cag A蛋白是由幽门螺杆菌Ⅳ型分泌系统介导并注入宿主胃上皮细胞内,一旦进入细胞,Cag A能够与多个分子发生相互作用,扰乱细胞正常的信号通路,引起细胞病变和转化,而动物实验也证明了Cag A蛋白的致癌特点。本文重点对Cag A蛋白的序列特征,转位方式及致病机制等方面的最新进展进行了综述,希望能进一步阐释Cag A介导的幽门螺杆菌的致病机制,为以后的研究提供一定的方向和指导。     

幽门螺杆菌cagA克隆表达

克隆表达4株幽门螺杆菌的cagA基因,以方便地获得大鼠CagA蛋白和重组表达质粒,为临床诊断CagA阳性幽门螺杆菌感染,以及进一步研究不同类型CagA功能及其与疾病关系提供材料。PCR扩增幽门螺杆菌的cagA基因,克隆至PinPoint^TMXa-1T载体,酶切鉴定连接方向,IPTG诱导正向连接克隆表达CagA融合蛋白并进行SDS－PAGE和Western blots鉴定。结果显示PCR扩增得到3.5-3.8kb的CagA基因,PCR及酶切鉴定得到正向连接的重组克隆,SDS－PAGE及Western blots证实正向连接的重组克隆表达CagA融合蛋白。构建了4种cagA的重组表达质粒,通过转化同一宿主菌可研究不同CagA的功能和致病性差异;通过亲和层析纯化融合蛋白可获大量CagA蛋白,用于血清学诊断CagA阳性幽门螺杆菌感染,及不同抗原性CagA与疾病之间的关系。     

幽门螺杆菌致病岛CagL重组抗原的可溶性表达及其多克隆抗体的制备和分析*

目的:利用原核表达和蛋白质纯化技术获得高纯度的幽门螺杆菌致病岛CagL重组抗原(rCagL),利用其制备anti-CagL多克隆抗体,并分析抗体的特异性。方法:通过生物信息学软件分析rCagL的抗原结构;利用PCR长片段DNA合成技术合成不含有信号肽序列的幽门螺杆菌致病岛CagL基因,将其插入表达质粒pCzn1中,构建重组质粒pCzn1-rCagL。然后,将pCzn1-rCagL转入大肠杆菌Arctic Express中,经IPTG诱导表达后,通过Ni-IDA镍离子亲和层析纯化重组抗原rCagL,利用Western blot鉴定rCagL与His标签抗体和Anti-H. pylori抗体的免疫反应性;最后,通过rCagL辅以弗氏佐剂免疫BALB/c小鼠,制备anti-CagL多克隆抗血清,通过ELISA方法分析抗血清的特异性。结果:生物信息学软件表明重组抗原rCagL具有较好的抗原性质;重组质粒pCzn1-rCagL经双酶切和基因测序等技术鉴定,证实rCagL核苷酸序列与理论序列完全一致;基因工程菌株pCzn1-rCagL/Arctic Express在低温11℃条件经IPTG诱导表达。 SDS-PAGE实验结果证实:rCagL可实现相对高效地可溶性蛋白表达,可溶性蛋白约占包涵体的62.07%。经Ni-IDA亲和层析柱纯化,可获得高纯度rCagL,纯度约为96.6%。Western blot结果证实:重组抗原rCagL可特异性与His标签抗体和Anti-H. pylori抗体结合。ELISA结果证实:经rCagL免疫小鼠制备的多克隆抗体anti-CagL可特异性识别rCagL和H. pylori裂解物,具有较高的抗体特异性。结论:重组抗原rCagL在低温条件下可实现可溶性表达,经纯化可获得高纯度抗原蛋白;rCagL具有较好的抗原性,制备的多克隆抗体具有较好的免疫特异性,为发展H. pylori相关诊断试剂奠定了实验基础。     

高效表达幽门螺杆菌UreB重组蛋白工程菌的构建

克隆表达幽门螺杆菌(Hp)的尿素酶B亚单位(UreB)重组蛋白,可为Hp疫苗开发和快速诊断试剂盒的研究奠定基础。用PCR方法由幽门螺杆菌染色体DNA扩增UreB基因片段,将其融合插入原核表达载体pQE30中,并在M15大肠杆菌表达。经酶切、测序分析,包括部分融合载体基因在内的重组UreB基因片段由1773bp组成。为编码591个氨基酸残基的多肽。SDS-PAGE分析显示重组表达的目的蛋白相对分子量约为66kD,表达量点菌体总蛋白的23．5％,并经免疫印迹分析证实被幽门螺杆菌感染的阳性血清可与纯化UreB重组蛋白发生特异性的结合反应。UreB重组蛋白具有良好的抗原性,将有可能成为一种有效蛋白质疫苗以及快速诊断试剂盒用于Hp感染的防治和检测。     

重组hKGF2原核表达载体的构建及其蛋白质的纯化

角质细胞生长因子2（ keratinocyte growth factor 2, KGF2）是新近发现且发展迅速的成纤维细胞生长因子家族中新的一员,又称FGF10,是上皮细胞特异性的促有丝分裂剂,应用前景广泛。为构建其高效原核表达菌株,首先用RT-PCR法从培养的人胚胎肺成纤维细胞中获得去除信号肽的hKGF2 cDNA,将其插入pMD18-T载体;经测序后,克隆入pET-30a( + )表达载体,将成功构建的pET-30a( + )- hKGF2重组表达载体转入大肠杆菌BL21（DE3）,经IPTG诱导表达后, SDS-PAGE及Western blot鉴定重组蛋白为高效可溶性表达。重组蛋白经Ni+-NTA（镍亲和层析）一步法纯化后纯度达95%以上,为进一步的应用研究及大规模生产奠定了基础。     

香菇Latcripin-8蛋白的表达、纯化及抗肿瘤活性

目的通过生物信息学方法分析Latcripin-8的基因序列、功能域片段,构建重组质粒,表达含Pkinase结构域基因的目的蛋白并研究重组蛋白的抗肿瘤活性。方法从香菇C91-3菌丝体中提取总RNA,经反转录成cDNA文库。高通量测序获得转录组mRNA,经对比获得目的序列后以RACE技术扩增。经Pfam数据库比对可知其具有Pkinase结构域。设计引物,PCR扩增并与原核表达载体pET32a(+)进行连接,转至E.coli Rosetta-gami(DE3)中进行蛋白诱导表达,经纯化、复性后获得目的蛋白并鉴定。CCK8法检测其对人肺腺癌A549细胞、人胃癌SGC-7901细胞、人肝癌HepG2细胞及人乳腺癌MCF-7细胞的增殖抑制率。结果蛋白诱导成功且该蛋白对不同种类的肿瘤细胞抑制效果不同,其中对人胃癌SGC-7901细胞的增殖抑制程度最为明显,并表现出时间和浓度依赖性。结论经Latcripin-8基因诱导表达出的蛋白具有抗肿瘤功效,为进一步深入研究抗肿瘤方面的活性提供了初步条件,有助于肿瘤治疗作用的研究。     

兔多杀性巴氏杆菌C51-3株黏附蛋白的表达、纯化及其抗原性检测

应用PCR从兔多杀性巴氏杆菌C51-3株基因组DNA中扩增出编码36 kD黏附蛋白的cp36基因, 将其克隆到pMD18-T载体并对插入片段进行测序。以重组质粒pMD18-cp36为模板, 用PCR扩增得到编码信号肽除外的成熟黏附蛋白基因cpm36, 并克隆到原核表达质粒pQE30中, 得到重组质粒pQE30-cpm36, 转化大肠杆菌M15, 在IPTG诱导下表达融合蛋白CPM36, 经Ni2+-NTA亲和层析纯化。DNA测序结果表明cp36基因片段大小为1032 bp, 与已报道的16个血清型多杀性巴氏杆菌cp36基因的核苷酸序列比较, 同源性在76.9%~100%之间。SDS-PAGE结果显示, 表达分子量约为37 kD的带有6×His标签的CPM36蛋白, 与预期分子量相符。Western blotting结果表明, 抗重组蛋白抗体分别能与CPM36蛋白和多杀性巴氏杆菌36 kD蛋白发生特异性反应, 证明原核表达蛋白具有抗原性, 为进一步开展多杀性巴氏杆菌免疫保护性抗原的研究奠定了基础。     

原花青素诱导胃癌SGC-7901细胞凋亡及其机制的研究

为探讨原花青素对人胃癌SGC-7901细胞增殖及凋亡的影响及其可能的作用机制,以体外培养的SGC-7901细胞为研究对象,经一定浓度的原花青素作用后,用MTT法及流式细胞仪检测细胞增殖抑制及凋亡情况,Real-time PCR技术及免疫组化法检测Bcl-2、Bax mRNA和相关蛋白表达的含量。结果表明,不同浓度的原花青素不仅能有效抑制SGC-7901细胞增殖,还可诱导细胞凋亡,且抑制增殖及促进凋亡作用呈浓度和时间依耐性;Real-time PCR及免疫组化试验中显示,随着原花青素浓度的增加,Bcl-2mRNA及相应蛋白表达逐渐减少,Bax mRNA和相关蛋白表达逐渐增加。因此,原花青素对人胃癌SGC-7901细胞具有明显的抑制作用,其作用机制可能与上调Bcl-2蛋白和下调Bax蛋白水平有关。     

白藜芦醇通过Pi3K/AKT 通路抑制胃癌SGC-7901 细胞增殖和迁移

目的:验证白藜芦醇是否可以抑制胃癌SGC-7901细胞增殖和迁移及其信号通路。方法:用不同浓度白藜芦醇干预SGC-7901细胞,再用LY-294002和IGF-1分别用来抑制和激活Pi3K/AKT通路。MTT法测细胞增殖,划痕试验和Transwell试验测细胞迁移,Western blot检测细胞迁移相关蛋白(MMP-2、MMP-9)、细胞迁移相关蛋白(P21、P27)、以及AKT、p-AKT的表达情况;结果:相比于对照组,白藜芦醇组胃癌细胞增殖和迁移减弱(P=0.001),p-AKT表达减少(P0.001);LY-294002可以抑制p-AKT的表达(P=0.004),和白藜芦醇一样可以抑制胃癌细胞的增殖和迁移;IGF-1可以显著增加p-AKT的表达(P0.001),可以逆转白藜芦醇对胃癌细胞增殖和迁移的抑制作用。结论:白藜芦醇通过抑制Pi3K/AKT信号通路抑制胃癌细胞增殖和迁移。     

Snai1 miRNA干扰质粒构建及胃癌细胞系稳定株筛选

目的：设计并构建针对Snai1的微小干扰核糖核酸（miRNA）,最终鉴定出有效干扰质粒并筛选稳定转染的胃癌细胞株SGC-7901。方法：设计并构建4对Snai1的pcDNATM6.2-GW/EmGFPmiR microRNA及1对无效对照microRNA干扰质粒。将干扰质粒用罗氏BD转染试剂转染胃癌细胞株SGC-7901,通过倒置荧光显微镜观察绿色荧光确定转染效率。分别用不同浓度l的杀稻瘟菌素作用于SGC-7901细胞,得到杀稻瘟菌素对SGC-7901细胞的筛选浓度。Westernblot检测4对干扰质粒、阴性对照质粒对snai1蛋白水平表达的影响。结果：测序表明,Snai1干扰序列及读码框完全正确,干扰质粒瞬时转染的SGC-7901细胞系在倒置荧光显微镜下观察绿色荧光达85%以上。杀稻瘟菌素对于SGC-7901细胞的筛选浓度为5μg/ml。Westernblot结果显示,干扰序列Mi-1对Snai1有较强的干扰效果。结论：成功构建了Snai1干扰真核表达载体,同时筛选出有效干扰质粒及稳定转染株,为进一步研究Snai1在胃癌中的作用奠定了基础。     

Scinderin基因沉默对人胃癌细胞SGC-7901增殖、转移的影响

Scinderin是一种依赖Ca2＋的肌动蛋白丝（F-actin）切割蛋白,在细胞分泌过程中发挥着重要作用。目前,针对scinderin在人类疾病尤其是肿瘤中的生物学功能研究报道的并不多。该实验通过构建scinderin—shRNA慢病毒载体并感染人胃癌细胞株SGC-7901,于荧光显微镜下观测感染效率,利用RT-qPCR和Western blot实验证实scinderin的沉默效果。运用实时细胞分析4K（RTCA）检测细胞的增殖能力,流式细胞术检测细胞周期变化,Transwell小室检测细胞的迁移能力。结果显示,将构建好的病毒载体成功转入了胃癌细胞SGC-7901。感染scinderin—shRNA病毒载体后,scinderin的mRNA和蛋白质表达水平均受到不同程度的抑制（P〈0．01）,细胞的增殖和迁移能力均显著降低（P〈0．05）,细胞周期阻滞在G2／M期。该研究表明,胃癌细胞SGC-7901中scinderin低表达能有效抑制细胞的增殖和转移能力,这也为scinderin在胃癌演化过程中的机制研究奠定了实验基础。     

白黎芦醇对胃癌SGC 一7 901 细胞V EGF 表达的影响

目的：探讨白藜芦醇（resveratrol,Res）在体外对胃癌SGC-7901细胞VEGF表达的影响。方法：体外培养胃癌SGC-7901细胞,MTT法检测白藜芦醇对SGC-7901细胞的增殖抑制作用,RT—PCR方法检测VEGFmRNA表达,免疫细胞化学检测VEGF蛋白的表达。结果：白藜芦醇呈时间剂量性抑制胃癌细胞SGC7901的增殖;胃癌SGC-7901细胞高水平表达VEGF,白藜芦醇能显著降低胃癌SGC-7901细胞VEGFmRNA和蛋白表达。结论：白藜芦醇可以下调胃癌SGC-7901细胞VEGF的表达,抑制胃癌细胞的增殖。