低温冰箱保存细胞的经验介绍

用作为培养细胞的保存方法,国内外多用液氮保存,但有些实验室则采用低温冰箱保存。至于后者保存细胞的有效性(细胞存活效果),由于细胞种类的不同,则有不同的结果。现将本单位采用低温冰箱保存细胞的有关经验及效果报道于后。 细胞有二倍体人胚肺细胞(HEL),传代细胞系Hep-2、Hela、MA 104(恒河猴胚肾细胞传代株),按常规将细胞用胰酶消化,生长     

抗炭疽保护性抗原单克隆抗体的产生及鉴定

为了定量测定炭疽保护性抗原及阐明其免疫机制,我们开展了细胞杂交瘤技术的工作。于1982年初获得4株能产生抗炭疽保护性抗原的单克隆抗体的细胞株。传代8个多月后冰冻保存。最近从第20代冰冻保存的细胞复苏,又传30多代,仍能持续稳定地分泌特异性抗体。 用亲和层析纯化的炭疽保护性抗原免疫了     

不同株狂犬病疫苗小鼠效力试验结果

<正>引言 最早是用Pasteur病毒株生产灭活狂犬病疫苗。此毒株是1882年在法兰西从狗体上分离的,先经牛传代,再用兔子、小鼠或其它种类的动物传代,然后经多次细胞培养所得。最近用于兽用活疫苗生产的有三个病毒株:Flury株,低或高鸡胚传代(LEP或HEP);Street Alabama,Dufferin株(SAD),以及由此株衍生的ERA或Vnukovo32—37株;还有Kelev株。SAD株和Kelev株从狗体分离,Flury株是从被疯狗咬了的人中分离。所有毒株都已经实验动物或组织培养细胞中传代。     

五株弓形体抗原的免疫扩散初步分析

用双向免疫扩散试验法分析不同来源的弓形体抗原成份。实验结果,可将5株虫种分为三种类型。     

氧化葡萄糖酸杆菌SCB329的培养及保存

氧化葡萄糖酸杆菌SCB329和苏云金芽孢杆菌SCB933是混合发酵产生维生素C前体2－KLG两株主要菌种,本文对氧化葡萄糖酸杆菌SCB329的纯培养,传代及纯小菌的保存及其对产酸的影响作了研究。     

申克孢子丝菌菌丝相至酵母相转化的实验研究

目的观察申克孢子丝菌菌丝相向酵母相转化的形态学变化并初步研究连续传代后菌株转化为酵母相的百分率。方法将95株申克孢子丝菌临床株于脑心浸液琼脂培养基上连续传代至酵母相,利用显微镜及血细胞计数板计数菌丝和孢子比例并记录显微镜下形态。结果 95株申克孢子丝菌中,经1次传代即成功转化有23株,经2次传代有14株,经3次传代有10株,经4次传代有6株,4次传代后总计55.8%实验菌株转化为酵母相。结论部分申克孢子丝菌由菌丝相向酵母相转化需经过连续多次传代,连续传代增加了菌丝相至酵母相的转化率。     

约氏疟原虫配子体在蚊媒叮咬的鼠体内自然消长观察

疟原虫配子体数量随着血传代数的增加而减少,这一规律已在不同的虫株观察中得到了证实。为了保持小鼠外周血中成熟配子体的高密度,必须维持一定的血传代数。至一定的血传代数以后,必须使该虫株通过媒介昆     

肾综合征出血热双价纯化疫苗（Vero细胞）病毒株的筛选及其免疫原性研究

选用在Vero细胞上初步适应的LR1（Ⅰ型）、R22（Ⅱ型）株病毒,经乳鼠脑或腹腔接种,收剖感染鼠脑并在Vero细胞传代适应,此收获病毒与直接以Vero细胞传代的病毒比较表明：抗原效价、毒力滴度有明显提高。用LR1、LR22株病毒感染的Vero细胞培养物制备单价粗制疫苗和双价精制纯化疫苗免疫家兔,经空斑减少中和试验检测中和抗体,结果表明经乳鼠和Vero细胞交替传代适应后的LR1、R22株病毒具有良好的抗原性和免疫原性。     

字佐美曲霉酸性蛋白酶的研究I．酸性蛋白酶537菌株的选育及其发酵条件

用紫外光、乙烯亚胺、60钻、甲基磺酸乙酯连续交替诱变处理宇佐美曲霉的白色变种B1,获得一株高产酸性蛋白酶的突变株537,在摇瓶培养条件下其产酶水平是出发菌株的35倍。试验结果表明,对宇佐美曲霉的多因素连续诱变处理,以及采用对萌动孢子处理的方法均有助于获得较理想的结果。此外,简化了的培养基,不仅使所得的突变株提高了产酶水平,而且培养基中不需要添加豆饼水解液,可直接采用豆饼粉和较高浓度的无机氮源。另外,氯化钙、磷酸盐对产酶有促进作用。诱变菌株经多次传代和长期保存后,产酶活力稳定不变。     

10株水痘带状疱疹病毒的分离鉴定与生物学特性

用Vero-E6细胞从12例水痘及带状疱疹病人水疱液中分离到10株病毒,分离阳性率为83.3%.10株病毒均具有使感染细胞圆缩、融合、脱落等典型的VZV局灶性细胞病变(CPE)特点,CPE随着传代次数增加而加快.用带状疱疹恢复期病人血清作间接免疫荧光染色镜检,可见典型的感染细胞核内荧光块.10株病毒感染细胞制成的抗原片,检测5例带状疱疹病人急性期及恢复期血清,荧光抗体滴度均有4倍以上增高.VZV对Vero细胞敏感;对沙鼠肾,胎兔肾,胎豚鼠肾、肺、脾原代单层细胞不敏感;对乳小白鼠不敏感.毒种在-20℃保存一周内死亡;但在30%脱脂牛奶、20%小牛血清及10%山梨醇Eagle's液中,液体或真空冷冻干燥-100℃可保存二年以上.     

狂犬病病毒CTN-1V株在人二倍体细胞Walvax-2株的适应传代

目的建立狂犬病病毒固定毒CTN-1V株在人二倍体细胞Walvax-2株上的传代适应株。方法用狂犬病病毒固定毒CTN-1V株经昆明小鼠鼠脑回传后的病毒接种Walvax-2细胞,连续传代,检测各代次病毒的滴度及免疫原性。结果 CTN-1V株能较好地适应Walvax-2细胞,通过连续带毒传代至第7代,病毒滴度可达6.78 lg LD50/mL,并在第10~15代内滴度维持在7.0 lg LD50/mL以上,15~30代滴度稳定在7.0 lg LD50/mL左右。以15代适应毒株CTN-1V-HDC P15制备的疫苗原液,各项指标均符合《中华人民共和国药典》三部(2010版)的要求,疫苗效力在6.0IU/剂以上。结论所获人胚肺二倍体细胞Walvax-2株传代适应狂犬病毒固定毒株CTN-1V-HDC可用于人用狂犬病疫苗的生产开发。     

砂土法、矿油封藏法保存链霉菌17年效果的评定

本文总结了用砂土法保存130个种、14个变种、409株链霉菌以及矿油封藏法保存其中103个种、11个变种、307株菌17年的效果;其中部分菌株的抗菌素产生能力和蛋白酶活力的测定结果;经矿油封藏后,死亡菌株的矿油层,用红外光谱法检查的结果。用砂土法保存的409株菌,17年后存活384株,存活率为93.9%;在144种（包括变种）中,有101种（70%）保持着原来的形态特征。用矿油封藏法保存的307株菌,17年后存活256株,存活率为83.4%;其中169株（66%）保持着原来的形态特征。产生链霉素的灰色链霉菌（Streptomyces griscus）As 4.181、比基尼链霉菌（S.bikiniensis）AS 4.569,产氯霉素的委内瑞拉链霉菌（S.venezu（?）la（?））AS 4.223等菌株,用矿油封藏法比砂土法保存得到较好的效果。产生新霉素的弗氏链霉菌（S.fradiae）AS 4.576,用砂土法保存效果较好。矿油封藏法保存链霉菌对保持蛋白酶活力,有着良好的效果。经红外光谱法检查19株失活的菌株的矿油层,其中17个样品于1710厘米-1或1600厘米-1处有吸收带。根据红外光谱,此吸收带属于脂肪族或芳香族中（?）c=c（?）基的伸展振动,与 Arai 用此法保存诺卡氏菌,分枝杆菌测出的结果近似。故推测链霉菌经此法保存后,菌株死亡的原因是由于浸出了细胞中类脂所致。砂土法和矿油封藏法对于长期大量保存链霉菌,是两种简便而且可取的方法。     

人类巨细胞病毒UL133基因在临床低传代株中的多态性研究

人类巨细胞病毒在多次传代后,会表现出不同的毒力水平.与临床低传代株Toledo相比,实验室高传代株AD169缺失了19个开放阅读框(ORF).这19个基因被认为是与HCMV致病性最可能相关的一组基因,研究这些基因的多态性对揭示HCMV致病性的遗传基础具有指导意义.UL133基因是这19个ORF中的一个.以临床低传代株Toledo和Merlin为对照,分析了23个临床病毒株UL133基因的遗传多态性.序列分析表明,UL133基因具有一定的多态性,Toledo株、Merlin株与我们分离到的临床株一起可分为3个基因型:G1、G2和G3.G2、G3型毒株均能导致先天性感染.没有发现UL133基因型与患儿临床疾病的必然关联.     

北京地区猫疱疹病毒Ⅰ型的分离及鉴定

了解北京地区猫疱疹病毒Ⅰ型(FHV-1)毒株特点,为猫疱疹病毒Ⅰ型的进一步研究及对猫的感染预防控制奠定基础。经特异性PCR检测为FHV-1阳性临床猫眼鼻拭子,经过处理,接种CRFK细胞,通过细胞培养分离病毒。通过间接免疫荧光试验、电镜形态观察、病毒毒力测定及基因序列分析等对分离株进行鉴定。PCR检测FHV-1阳性的14只猫眼鼻拭子接种CRFK细胞,有6只猫样本能使CRFK细胞发生圆缩、拉网集聚等病变;6个样本接种的CRFK病变细胞滴片进行免疫荧光试验,均产生绿色荧光反应;经传代培养,有5株分离株能够稳定传代,其中有2株弱毒,3株强毒;电镜下5株分离株均可见直径100~160nm的球型病毒粒子;5株分离株与FHV-1标准株C-27及2个不同公司来源疫苗株gB、gD基因核苷酸比较同源性均为99%以上。实验室成功分离保存5株能稳定传代的FHV-1毒株,5株分离株与FHV-1标准株及2个疫苗株亲缘关系很近。     

10株水痘带状疱疹病毒的分离鉴定与生物学特性

用ＶｅｒｏＥ６细胞从１２例水痘及带状疱疹病人水疱液中分离到１０株病毒,分离阳性率为８３．３％。１０株病毒均具有使感染细胞圆缩、融合、脱落等典型的ＶＺＶ局灶性细胞病变（ＣＰＥ）特点,ＣＰＥ随着传代次数增加而加快。用带状疱疹恢复期病人血清作间接免疫荧光染色镜检,可见典型的感染细胞核内荧光块。１０株病毒感染细胞制成的抗原片,检测５例带状疱疹病人急性期及恢复期血清,荧光抗体滴度均有４倍以上增高。ＶＺＶ对Ｖｅｒｏ细胞敏感;对沙鼠肾,胎兔肾,胎豚鼠肾、肺、脾原代单层细胞不敏感;对乳小白鼠不敏感。毒种在－２０℃保存一周内死亡;但在３０％脱脂牛奶、２０％小牛血清及１０％山梨醇Ｅａｇｌｅ’ｓ液中,液体或真空冷冻干燥－１００℃可保存二年以上。     

C亚型SHIVCHN19P4强毒株在中国恒河猴体内的传代研究

目的研究C亚型SHIVCHN19P4强毒株在中国恒河猴体内传代中病毒学和免疫学等反应的变化特点,分离制备SHIVCHN19P4中国恒河猴传代适应株病毒。方法选择4只健康成年恒河猴,其中两只经后肢静脉感染SHIVCHN19P4病毒,60 d后,分别采集EDTA抗凝全血静脉途径传代至另两只猴,使用流式细胞术、PCR、结合抗体检测和序列分析等方法研究传代动物病毒学、免疫学和序列变异特点。选择性从传代动物感染急性期外周血中分离PBMC,CD8＋T细胞敲除后与正常PBMC共培养分离病毒。结果 4只传代动物均获得系统性感染,且传代后病毒毒力明显增强,序列分析发现SHIVCHN19P4病毒序列在传代过程中发生适应性改变;同时,成功分离制备SHIVCHN19P4传代适应性病毒株。结论 SHIVCHN19P4在中国恒河猴体内适应性传代研究为进一步建立C亚型SHIV强毒株/SAIDS模型奠定了良好的实验基础,为研究C亚型HIV-1流行株致病特点以及预防性黏膜疫苗和杀微生物的有效性评价提供了数据支持。     

奇异变形杆菌耐热性肠毒素的初步研究

为探讨奇异变形杆菌的发病机理,本文用乳鼠试验检测了从医院内腹泻患儿粪中分离的36株奇异变形杆菌肠毒素,结果4株呈阳性。对其中2株进行了耐热性试验,证明其具有耐热性,同时发现在人工培养条件下通过多次传代或肠毒素经反复冻融,耐热性肠毒素(ST)的活性可随之减弱或丧失。     

麻疹病毒F基因测序及其进化关系的初步分析

研究麻疹病毒疫苗株S191毒种及其传代的病毒溶血素F(Haemolysin,HL)基因稳定性;对该序列一些重要位点的氨基酸进行比较,推测其功能结构及生物学活性变化;同时对该基因与M蛋白基因之间的非编码序列进行比对分析。利用RT-PCR方法扩增S191减毒株MeV23、26、27代及一株流行株YunnanLC-10的F基因,测序后进行比对分析。S191传代病毒F基因序列之间核苷酸同源性为99.8%,氨基酸同源性为99.5%～99.6%;S191疫苗株与流行株之间核苷酸序列同源性达95.2%;疫苗株与流行株1003nt的非编码区序列同源性为85.0%。S191传代病毒F基因具有较高遗传稳定性,关键功能位点氨基酸未发生传代改变;1003nt非编码区序列变异速度较快。     

风疹病毒松叶株衣壳蛋白C基因稳定性研究

目的研究风疹病毒(Rubella virus,RV)疫苗松叶株(Matsuba)衣壳蛋白(Capsid Protein)的基因稳定性及遗传特征,探讨其功能结构及生物学活性在病毒传代过程中的变化特点。方法利用RT-PCR方法扩增风疹病毒Matsuba株14、16、17、18、23代次C基因序列,测序后进行序列比对分析,并将各代次病毒的C基因与风疹病毒疫苗株Matsuba(GenBank登陆号:AB588193)及其他风疹病毒株C基因序列进行同源性分析。结果风疹病毒Mat-suba株传代病毒C基因在传代过程中核苷酸及氨基酸均未发生变异;各代次病毒与AB588193核苷酸及氨基酸序列完全一致,各关键功能区未发生变异;Matsuba株与18株风疹病毒核苷酸相似性在90.2%～99.9%之间。结论风疹病毒Matsuba疫苗株C基因遗传特性非常稳定,与生物学作用相关的区域未发生传代改变。从分子水平证明Matsuba疫苗株毒种及其生产的疫苗具有安全性。     

介绍一种新的表皮细胞传代方法

我们设计了一种新的传代方法,在传代之前,先用 DispaseⅡ酶,将培养的表皮细胞片整个消化下来,再用0.25—0.3%胰酶冷消化将表皮细胞驱散,进行1:2传代获得成功,传代59次成功率为71.2%。若在培养后7—16天传代,成功率可达80%。本文讨论了此种传代方法比单纯用胰蛋白酶或用胰蛋白酶和EDTA 混合传代方法优越。