农药助剂对苏云金杆菌毒力的影响及新液剂研制

研究了２０种化学物质对苏云金杆菌的毒力影响,分析了由乳化剂、湿润剂、防腐剂配制的几种不同农药助剂组合与该菌芽孢晶体混合物在不同贮存期的毒力变化及芽孢存活率。从供试的助剂组合中获得了一种最佳组合,其各项指标均优于中华人民共和国农业行业标准中所规定的各项要求,可发展成一种新的苏云金芽孢杆菌液剂。     

苏云金杆菌Z113菌株伴孢晶体特性及其杀虫活性

本文研究了苏云金芽孢杆菌Z113菌株在发酵过程中形成的伴孢晶体的形态及毒素蛋白的杀虫活性 ,并考察了该菌株的发育状况、OD值、pH值及不同发育时期毒素蛋白和杀虫活性的变化 ,确定了Z113菌株杀虫毒力与晶体蛋白之间的关系。     

苏云金芽孢杆菌HD-1伴孢晶体水解规律的研究

采用HCl将蛋白质彻底水解的方法对苏云金芽孢杆菌HD-1伴孢晶体的水解规律和酸水解条件下芳香族氨基酸的被破坏程度进行了研究,不经衍生HPLC法直接测定水解样中酪氨酸的含量。得出酸水解的最佳时间为24h、水解剂的用量为1．0mlHCl／mg伴孢晶体、水解最佳温度为110℃。该研究为Bt制剂毒力效价的测定奠定了基础。     

谷氨酸对苏云金杆菌的芽孢和伴孢晶体的影响

研究了不同浓度的谷氨酸对苏云金芽孢杆菌形态、菌体浓度及芽孢和件孢晶体的影响.研究表明,一定浓度的谷氨酸有利于菌体的生长并能够提高菌体的增殖速度,对芽孢和伴孢晶体的形态没有明显的影响,但对芽孢的裂解有明显地抑制作用.     

杀鞘翅目苏云金芽孢杆菌新菌株及其杀虫剂的研究

从中国土壤中分离出2株杀鞘翅目昆虫的苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis) YM03及SHQ11-10。YM03的血清型为H8a8b,SHQ1110的H血清型未知。二菌株皆产近菱形的薄扁伴孢晶体,分别含68～70kD和65kD的晶体蛋白质。毒力生物测定证明对柳蓝叶甲(Plagiodera versicolora)及马铃薯甲虫(Leptinotarsa decemlineata)有高毒效。发酵性能良好。YM03粉剂田间防治马铃薯甲虫有高效。稀释400倍喷雾,防治效果达94.6%。     

活性氧对苏云金芽孢杆菌伴孢晶体的损伤作用

用SDSPAGE电泳分析和生物测定方法研究了过氧化氢(H2O2)和羟自由基(·OH)对苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)伴孢晶体的损伤作用。结果表明,这两种活性氧对伴孢晶体均有一定程度的损伤作用,这种损伤作用与活性氧的浓度成正相关,并且·OH对伴孢晶体的损伤作用明显强于H2O2。     

苏云金芽孢杆菌工程菌伴孢晶体的形态发生

苏云金芽孢杆菌在有帮助蛋白存在的情况下杀虫晶体蛋白获得了超量表达。通过透射电镜观察了Cry1Ac超量表达工程菌伴孢晶体的形态发生以及不同芽孢发育时期的晶体形态变化。结果表明,该工程菌的伴孢晶体在细胞不对称分裂的隔膜形成前就已出现,而且晶体发生的部位与芽孢无关。但晶体在形成初期往往靠近母细胞膜。观察结果还表明,大量表达的晶体蛋白不能马上参与到晶体合成,晶体形成的最佳时期是芽孢皮层形成期。母细胞大量液泡的产生与消失可能与晶体形成有关。此外,在超量表达工程菌中,Cry1Ac蛋白能在一个细胞内形成多个伴孢晶体,这在天然菌株中是罕见的。     

干燥温度对苏云金芽孢杆菌伴孢晶体的结构及杀虫活性的影响

用电镜、电泳、生物鉴定等方法,研究了干燥温度对苏云金芽孢杆菌库斯塔克变种苏云金芽孢杆菌库斯塔克变种（ＢａｃｉｌｌｕｓｔｈｕｒｉｎＦｉｅｎｓｉｓｖａｒ．Ｋｕｒｓｔａｋｉ）ＨＤ－１的伴孢晶体的结构及杀虫活性的影响。结果表明,０℃冷冻干燥的效果最好,对伴抱晶体的电泳图谱、形态、结构及杀虫活性均无影响;７５Ｃ以下干燥对伴孢晶体的形态和结构略有影响,但对电泳图谱和杀虫活性尚无影响,生产上可以采用。但在７５℃下超过５小时的长时间干燥,对晶体蛋白的空间结构和杀虫活性也有影响,因此,要适当控制干燥时间。８０     

紫外线使苏云金芽孢杆菌伴孢晶体失活机理的研究

用电镜、电泳、生物鉴定等方法,研究了紫外线对苏云金芽孢杆菌库斯塔克变种的伴孢晶体的影响。结果表明,紫外线能破坏伴孢晶体的表面结构和形态,降低伴孢晶体在碱性液和蚕胃液中的溶解度,5小时以上的长时间照射,能导致伴孢晶体完全不溶,因而不能降解为具有杀虫活性的毒素蛋白而失活。     

昆虫中肠液性质对苏云金芽孢杆菌伴孢晶体毒力的影响

综述了昆虫中肠液性质对苏云金芽孢杆菌Bacillus thuringiensis伴孢晶体毒力的影响。中肠液的酸碱度和蛋白酶是影响伴孢晶体溶解与原毒素活化的两大因素。中肠液的酸碱度不仅影响到伴孢晶体的溶解速度,还影响到各种蛋白酶的活性表现;而蛋白酶则直接参与了原毒素的活化,其组成与活性影响着原毒素的活化速度和杀虫专一性。因中肠液蛋白水解能力过高而导致原毒素的过度降解是某些昆虫对苏云金芽孢杆菌低度敏感的主要原因,而中肠液对原毒素活化能力的降低则与昆虫抗性的形成有关。此外,中肠液的沉淀作用及其它生理生化特性也影响着原毒素毒力的正常发挥。     

苏云金芽胞杆菌CTC菌株的S-层蛋白可以形成伴胞晶体

苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis)CTC菌株产生卵圆形伴胞晶体,晶体蛋白分子量为100kD;透射电子显微镜观察结果表明该菌株有S—层结构,而且在母细胞内可以形成伴胞晶体和S—层的初体结构;其蛋白基因导入苏云金芽胞杆菌无晶体突变株BMB171后,扫描电子显微镜观察结果表明转化子能形成晶体,而其形状与CTC菌株的相同;转化子晶体蛋白的分子量大小也与CTC菌株的相同,为100kD。以上实验结果结合以前晶体蛋白N—末端测序和基因核苦酸序列,表明苏云金芽胞杆菌CTC菌株的S—层蛋白可以形成伴胞晶体。     

抗生素类作为防腐剂对苏云金杆菌芽孢及伴胞晶体的影响

报道了14种抗生素作为防腐剂对苏云金杆菌CH菌株芽孢萌发的抑制作用和对伴胞晶体的影响。结果表明,红霉素,盐酸环丙沙星对CH菌株芽孢萌发有较强的抑制作用,在0.5μg/mL低剂量下可抑制芽孢的萌发;氧氟沙星和麦迪霉素抑制作用稍差,在5μg/mL的剂量下抑制作用随时间延长而减弱,96h后基本丧失抑制作用。其它几种抗生素对苏云金杆菌芽孢萌发的抑制终浓度均在30μg/mL以上;SDS-PAGE分析和生物测定表明,红霉素,盐酸环丙沙,氧氟沙星和麦迪霉素对伴胞晶体均无明显损伤作用。其中氧氟沙星45oC条件下放置4d,发酵液毒力保持率为96.2%。     

黑龙江省苏云金杆菌的分离及对夜蛾科昆虫高毒力菌株的筛选

【目的】为了发掘新的苏云金杆菌(Bacillus thuringiensis)的资源,在黑龙江省不同地区采集不同类型的土壤样品分离出对夜蛾科具有高毒力的菌株。【方法】采用醋酸钠选择性筛选法筛选Bt菌株,利用10对通用引物对分离株进行基因型分析,SDS-PAGE进行杀虫晶体蛋白分析,同时测定苏云金杆菌分离株对棉铃虫Helicoverpa armigera(Hübner)、甘蓝夜蛾Mamestra brassicae(Linnaeus)、斜纹夜蛾Spodoptera litura(Fabricius)的杀虫活性。【结果】从黑龙江省不同地区采集的352份不同类型的土壤样品中,共分离出46株苏云金芽孢杆菌野生菌株,出菌率为13.06%。油镜下可观察到伴孢晶体的形态有菱形、球形、镶嵌形及不规则形。结果表明产菱形晶体的菌株多含有cry1类基因,而同时产生菱形、球形及不规则形晶体的菌株则含有多种基因型。SDS-PAGE蛋白分析发现这些菌株主要表达130、90、60 ku蛋白。对其中的部分菌株进行毒力测定,结果表明有4株菌株对3种夜蛾科昆虫具有高毒力。【结论】黑龙江省苏云金芽孢杆菌分布广泛,类型多样,已获得对夜蛾科昆虫有高毒力的菌株,这对夜蛾科害虫的绿色防控及延缓其抗性具有重要意义。     

中国苏云金芽孢杆菌的分布与cry基因的多样性

采集全中国27个省、自治区及4个直辖市昆虫孳生地粉尘、土壤等样品1080份,在其中的406份中分离到苏云金芽孢杆菌965株.镜检可观察到大菱形、小菱形、方形、长方形、圆形、椭圆形、镶嵌形和不规则形等8种主要形态的伴孢晶体;采用cryⅠ、cryⅡ、cryⅢ、cryⅣ和cryⅤ基因的通用引物对221株Bt分离株进行的PCR检测结果表明各类基因的含量依次为cryⅠ＞cryⅡ＞cryⅤ＞cryⅢ基因,分别占被检菌株的75.6%、67.9%、58.4%和14.5%,没有检测到cryⅣ基因,共得到10种基因组合类型.对其中含有cryⅠ基因的菌株分别以cryIAc、cryIC和cryIE基因的特异性引物进行PCR检测,得到20株同时含有cryIAc、cryIC、cryⅡ和cryⅤ优良基因组合的Bt分离株,其中菌株Bt-15A3对棉铃虫、甜菜夜蛾及小菜蛾均表现出高毒力,具有生产开发潜力.     

苏云金芽胞杆菌CTC菌株的S-层蛋白可以形成伴胞晶体

苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis)CTC菌株产生卵圆形伴胞晶体,晶体蛋白分子量为100kD;透射电子显微镜观察结果表明该菌株有S层结构,而且在母细胞内可以形成伴胞晶体和S层的初体结构;其蛋白基因导入苏云金芽胞杆菌无晶体突变株BMB171后,扫描电子显微镜观察结果表明转化子能形成晶体,而其形状与CTC菌株的相同;转化子晶体蛋白的分子量大小也与CTC菌株的相同,为100kD。以上实验结果结合以前晶体蛋白N末端测序和基因核苷酸序列,表明苏云金芽胞杆菌CTC菌株的S层蛋白可以形成伴胞晶体。     

抗生素类作为防腐剂对苏云金杆菌芽孢及伴胞晶体的影响*

报道了 1 4种抗生素作为防腐剂对苏云金杆菌CH菌株芽孢萌发的抑制作用和对伴胞晶体的影响。结果表明 ,红霉素、盐酸环丙沙星对CH菌株芽孢萌发有较强的抑制作用 ,在 0 5μg/mL低剂量下可抑制芽孢的萌发 ;氧氟沙星和麦迪霉素抑制作用稍差 ,在 5μg/mL的剂量下抑制作用随时间延长而减弱 ,96h后基本丧失抑制作用。其它几种抗生素对苏云金杆菌芽孢萌发的抑制终浓度均在 30 μg/mL以上 ;SDS -PAGE分析和生物测定表明 ,红霉素、盐酸环丙沙、氧氟沙星和麦迪霉素对伴胞晶体均无明显损伤作用 ,其中氧     

巨大芽孢杆菌WSH-002丙氨酸脱氢酶066晶体制备及X-射线衍射分析

丙氨酸脱氢酶可逆催化丙氨酸脱氨生成丙酮酸,在氨基酸和酮酸的合成及代谢中至关重要.本研究通过PCR从巨大芽孢杆菌WSH-002中克隆并构建了丙氨酸脱氢酶基因(aldBM066)的原核表达载体,经原核表达后,采用Ni-NTA亲和层析法和阴离子交换色谱法纯化获得蛋白AldBM066,在289 K下以座滴法进行晶体生长条件筛选和制备.通过对蛋白质结晶条件的筛选,最终在蛋白质浓度为15 mg/mL及含有0.1 mol/L 乙酸钠（pH 5.0）和2.4 mol/L甲酸钠的缓冲液中获得了理想的蛋白质晶体,晶体大小约为210 μm×180 μm×150 μm,X-射线衍射数据显示,该蛋白质晶体衍射分辨率为2.88 A,空间群为三方晶系,晶胞参数为a=b=118.71 A,c=150.51 A,α=β=90°,γ=120°,每个不对称单位中含有1个AldBM066单体,马修斯系数为2.62 A3/Da,溶剂含量约为53.02%.衍射数据的成功收集为解析巨大芽孢杆菌WSH-002中丙氨酸脱氢酶的三维结构奠定了前期基础,将有助于阐明以单体存在的丙氨酸脱氢酶的催化机制.     

pH对苏云金杆菌晶体致病性的影响

报道了以苏云金杆菌5个菌株的晶体,经粘虫和黄粉虫幼虫的肠液在pH为6．4、7,4、8．4和9．4的缓冲液中（28℃）消化6小时后,其上清液（消化部分）和沉淀（未消化部分）对三龄末粘虫和黄粉虫幼虫的毒力。结果表明,457株、HD－1珠和10－4－13株的上清波和沉淀对粘虫均有不同程度的毒效,T84-1,株和T2株的上清液和沉淀对粘虫均无毒效;而对黄粉虫幼虫,以pH9．4时的上清液和沉淀均无毒效,在pH6．4和7．4时晶体被消化得极少,pH8．4时能被消化但较pH9．4时少。证明了pH对晶体的消化起重要作用,也表明了晶体之间在结构上存在着差异。     

苏云金芽孢杆菌蜡螟变种伴孢晶体蛋白基因的克隆及表达

用改进的碱解法分析基因供体菌苏云金芽孢杆菌蜡螟变种81-6(Bacillus thuringiensis var.galleriae 81-6)株有两种小质粒和一种大质粒。 将碱解法抽提到的质粒用Pstl完全酶解,与同样用PstI完全酶解的载体质粒pcAMPUC连接,以此重组质粒转化苏云金杆菌无晶体蛋白突变株 Bacillus thuringiensis var,kurstaki HD-1 Cry—B株的原生质体。用ELlSA法筛选到一株阳性转化菌落,分析了其质粒组成和插入片段的大小。毒性试验显示阳性转化子对昆虫幼虫有毒杀作用。