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将adr亚型HBV的完整X基因克隆到表达质粒pProEXHTb中,实现了X蛋白在大肠杆菌中的高效融合表达。表达产物全长179个氨基酸残基(其中X蛋白部分154个氨基酸残基),分子量约19.7kD,约占细菌总蛋白的34%。其氨基端融合部分含有6组氨酸肽段,经HisTrapTM亲和层析纯化,一步可达纯度93%。Western印迹分析表明,该表达产物可与HBV感染患者体内的抗X抗体特异性结合。 相似文献
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以HBV-NClDNA为材料研究了其中的X基因,首先确定了此X基因的顺序,即用ABI自动萤光测序议测序证明了此X基因的385位核苷酸后缺失19个核苷酸,从而引起移码突变,使此X基因共有519个核苷酸,编码172个氨基酸,比另一种adr型X蛋白多18个氨基酸。在其第五位氨基酸上有一ATG起始密码,也与另一X基因不同。经重组后获得在大肠杆菌中的热诱导表达,用Westernblot方法证明确为X蛋白,并有多态性。 相似文献
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目的:获得H3N2亚型禽流感病毒核蛋白(NP)全长基因,并在大肠杆菌中表达,以用于对NP功能的研究。方法:从感染了H3N2亚型禽流感病毒的MDCK细胞培养液中收获病毒,提取病毒RNA,用RT-PCR扩增出NP基因的编码区序列,将其定向克隆到pTIG-TRX原核表达载体并测序,在大肠杆菌BL21(DE3)plysS中表达,用SDS-PAGE和Western印迹检测表达产物。结果:所克隆的核苷酸片段包含了NP基因编码区完整阅读框架,编码498个氨基酸;构建的重组表达载体在大肠杆菌BL21(DE3)plysS中表达出相对分子质量约66000的重组蛋白。结论:克隆和表达了禽流感病毒核蛋白编码区基因,为获得大量NP以制备抗体,以及对其进行功能性研究奠定了基础。 相似文献
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adw与adr亚型乙型肝炎表面抗原基因在哺乳动物细胞中的表达 总被引:2,自引:1,他引:2
以pSV2-dhfr DNA为载体,在其单一酶切点Bg1Ⅱ处分别插入adw或adr亚型的HBVDNA Bg1 ⅡA片段(包括完整的pre-s及s基因),构成PSDHB_(r-1)和PSDHBw重组质粒。将其分别与pX1 DNA用磷酸钙沉淀法共转化LTK-细胞,在HAT培基选择压力下,挑选LTK~ 细胞,这些细胞均能有效表达HBsAg。再改用MTX选择培基,并逐渐增加其药量,从MTX抗性细胞中获得稳定表达HBsAg的Mwc-1和Mrm细胞系。 相似文献
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鲑鱼降钙素基因在大肠杆菌中的克隆与表达 总被引:9,自引:0,他引:9
以鲑鱼基因组DNA为模板,采用PCR获得sCT基因,并为DNA序列分析所证实。以pGEX-3X为表达载体,利用体外定点突变技术成功地构建了融合蛋白GST-sCT的重组表达质粒pGEX-3X-sCT,在大肠杆菌中得到高效表达,其表达量约为菌体总蛋白的30%;利用亲合层析法对融合蛋白GST-sCT进行纯化,再经Factor Xa酶切后获得了重组sCT,并对其进行活性检测。初步实验证明,重组sCT具有较 相似文献
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以鲑鱼基因组DNA为模板,采用PCR获得sCT基因,并为DNA序列分析所证实.以pGEX-3X为表达载体,利用体外定点突变技术成功地构建了融合蛋白GST-sCT的重组表达质粒pGEX-3X-sCT,在大肠杆菌中得到高效表达,其表达量约为菌体总蛋白的30%;利用亲合层析法对融合蛋白GST-sCT进行纯化,再经Fac-torΧa酶切后获得了重组sCT,并对其进行活性检测.初步实验证明,重组sCT具有较强的生物活性 相似文献
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乙内酰脲水解酶基因在大肠杆菌中的克隆表达 总被引:2,自引:0,他引:2
节杆菌BT801的乙内酰脲酶系能够水解5-苄基乙内酰脲生成L-苯丙氨酸,其中乙内酰脲水解酶负责乙内酰脲的水解开环。乙内酰脲水解酶的表达对于乙内酰脲酶的催化机制研究及氨基酸的生物不对称合成都具有重要意义。通过PCR技术扩增得到乙内酰脲水解酶基因(hyuH),置于表达载体pT221的,17启动子下游,将构建的重组质粒引入大肠杆菌BL21(DE3)。SDS-PAGE分析在相对分子量50kD处有一较强的表达带,经薄层扫描分析目的蛋白占全菌蛋白的40%,主要以可溶性形式存在,活性分析表明表达产物具有天然的酶活性。 相似文献
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禽流感病毒H5N1亚型NS1基因在大肠杆菌中的表达 总被引:3,自引:0,他引:3
目的表达H5N1亚型禽流感病毒(AIV)NS1蛋白,用于AIV感染与注射灭活疫苗鸡的鉴别诊断和NS1蛋白功能研究。方法采用RT_PCR方法对H5N1亚型AIVNS1基因进行扩增,将PCR产物克隆于pGEM_T_easy载体,将该基因插入pGEX_4T_1中构建NS1基因原核表达载体,转化BL21大肠杆菌后,在IPTG诱导下表达NS1蛋白,Westernblot鉴定表达NS1蛋白。结果成功克隆H5N1亚型AIV的NS1基因,其核苷酸序列长度为690bp,编码230个氨基酸残基。构建NS1基因原核表达载体在大肠杆菌内表达出约51×103的NS1融合蛋白。Westernblot鉴定表明表达NS1蛋白与H7N2AIV感染鸡血清有反应性。结论在大肠杆菌中成功表达了H5N1亚型AIVNS1基因蛋白,具有与感染H7N2亚型AIV阳性血清反应原性。 相似文献
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将含有大尺蠖核型多角体病毒(BsNPV)多角体蛋白基因(ocu)的BamHl一H片段克隆到表达载体pDR 540的BamiHl位点,得到能抗高浓度氨苄青霉素(200μg/ml)的两个阳性重组体,其胞外总蛋白比亲本质粒高1.1-1.4倍。在大肠杆菌细胞中,BsNPV ocu基因在原核杂合启动子tac驱动下能高水平的表达,表达量达到0.8和4.7mg/ml。免疫沉淀反应证明,表达蛋白为BsNPV的包涵体蛋白,凝胶过摅法测定的平均分子量为32.1×103道尔顿。 相似文献
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转谷氨酰胺酶基因在大肠杆菌中的克隆表达 总被引:3,自引:0,他引:3
从轮枝链霉菌Streptoverticilliummobaraense细胞中获得其基因组DNA ,用一对特异性的引物通过PCR的方法扩增出转谷氨酰胺酶 (transglutaminase,TGase)全长基因 ,回收片段并将其连接到表达载体pET30a中 ,转化大肠杆菌DH5α。双向测序表明获得的转谷氨酰胺酶全长基因序列正确。纯化重组质粒转化大肠杆菌BL2 1 (DE3) ,以 1mmol/LIPTG诱导 5h收集菌体进行SDS-PAGE电泳分析 ,与阴性对照相比 ,明显多出了一条蛋白条带 ,紫外扫描显示此带约占总蛋白量的1 7% ,Westernblotting证实此带能够特异性地与兔抗MTG(味之素公司 )的抗体发生反应。测得纯化后得到的TGase蛋白的酶活可以达到 15.1U/mg蛋白。 相似文献
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人角质细胞生长因子2基因的克隆及其在大肠杆菌中的表达 总被引:1,自引:0,他引:1
目的:构建人角质细胞生长因子2(hKGF2)基因的高效原核表达载体pET-30a( )-hKGF2,并在大肠杆菌BL21(DE3)中获得表达。方法:从培养的人胚胎肺成纤维细胞中提取总RNA,采用RT-PCR技术扩增出去除了信号肽部分的hKGF2基因,克隆到pMD18-T载体,经DNA序列分析后与pET-30a( )表达载体连接,在大肠杆菌BL21(DE3)诱导表达6×His-hKGF2,用SDS-PAGE及Western印迹鉴定表达蛋白。结果:构建了表达载体pET-30a( )-hKGF2,经IPTG诱导后,表达的重组蛋白理论相对分子质量约为23000,约占菌体总蛋白的20%。结论:6×His-hKGF2蛋白在大肠杆菌BL21(DE3)中为可溶性高效表达,为获得高纯度、高活性的产物,以及进一步的大规模生产和应用研究奠定了基础。 相似文献
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