内皮素-1对培养新生大鼠心肌细胞原癌基因c-fos表达的诱导

本实验用无血清的培养新生大鼠心肌细胞,探讨内皮素１（ＥＴ１）对原癌基因ｃｆｏｓ表达的作用。结果显示：ＥＴ１可显著诱导ｃｆｏｓ的表达,其表达的高峰在３０ｍｉｎ,２ｈ恢复到正常水平,并呈剂量依赖性反应和被ＥＴＡ的特异性受体拮抗剂ＢＱ１２３所阻断;蛋白激酶Ｃ（ＰＫＣ）激动剂ＰＭＡ可诱导ｃｆｏｓ表达,而ＰＫＣ抑制剂Ｓｔａｕｒｏｓｐｏｒｉｎｅ则可阻断ＥＴ１诱导的ｃｆｏｓ表达;钙通道阻断剂硝苯吡啶预处理心肌细胞对ＥＴ１诱导的心肌细胞的ｃｆｏｓ表达无明显的作用。这些结果提示,ＥＴ１诱导ｃｆｏｓ表达是通过ＥＴＡ受体介导的,ＰＫＣ在此过程中起重要作用。     

c-fos基因在内皮素-1促肺泡Ⅱ型细胞表面活性物质合成中的作用

应用反义技术探讨ｃ－ｆｏｓ基因ＥＴ－１调控肺泡Ⅱ型细胞（ＡＴⅡ）表面活性物质（ＰＳ）合成的胞内信号转导中的作用,结果显示：（１）内皮素－１（ＥＴ－１）可提高ＡＴⅡ细胞的＾３Ｈ－胆碱掺入。（２）蛋白激酶Ｃ（ＰＫＣ）激活剂ＰＭＡ可使ＡＴⅡ细胞的＾３Ｈ－胆碱掺入量增加,ＰＫＣ抑制剂Ｈ７可抑制ＥＴ－１的促ＰＳ合成效应。（３）ＥＴ－１和ＰＭＡ可显著提高Ｆｏｓ蛋白表达量,Ｈ７和ｃ－ｆｏｓ反义寡核苷酸（ＯＤＮ）     

自发性高血压大鼠原癌基因表达和限制性内切酶片段长度多态性分析

观察自发性高血压大鼠（ＳＨＲ）血管平滑肌细胞（ＶＳＭＣｓ）的生长曲线、ｃ－ｆｏｓ原癌基因表达和ｃ－ｆｏｓ基因酶切图谱的情况,与对照组京都维斯特大鼠（ＷＫＹ）进行对比．结果显示,在小牛血清作用下ＳＨＲ的ＶＳＭＣｓ生长速率和ｃ－ｆｏｓ原癌基因表达明显大于ＷＫＹ;ｃ－ｆｏｓ原癌基因限制性内切酶片段长度多态性（ＲＦＬＰ）分析表明,经ＢａｍＨⅠ或ＥｃｏＲⅠ酶切后的ＳＨＲ和ＷＫＹ的酶切图谱一致,同时也未发现ＳＨＲ的ｆｏｓ基因扩增现象．提示,ＶＳＭＣｓ的异常增殖和ｃ－ｆｏｓ原癌基因的表达异常与高血压的形成有关,而ｃ－ｆｏｓ原癌基因的过度表达可能是由于某些与基因转录调控有关的因素异常所致．     

自发性高血压大鼠原癌基因表达和限制性内切酶片段长度多态性分析

观察自发性高血压大鼠（ＳＨＲ）血管平滑肌细胞（ＶＳＭＣｓ）的生长曲线、ｃ－ｆｏｓ原癌基因表达和ｃ－ｆｏｓ基因酶切图谱的情况,与对照组京都维斯特大鼠（ＷＫＹ）进行对比。结果显示,在小牛血清作用下ＳＨＲ的ＶＳＭＣｓ生长速率和ｃ－ｆｏｓ原癌基因表达明显大于ＷＫＹ;ｃ－ｆｏｓ原癌基因限制性内切酶片段长度多态性（ＲＦＬＰ）分析表明,经ＢａｍＨ Ｉ或ＥｃｏＲ Ｉ酶切后的ＳＨＲ－ＷＫＹ的酶切图谱一致,同时也未发     

血管紧张素Ⅱ诱导左心室原癌基因c—fos和c—myc的表达

本实验用Ｌａｎｇｅｎｄｏｒｆｆ心脏灌流装置,探讨血管紧张素Ⅱ对左心室原癌基因ｃ－ｆｏｓ和ｃ－ｍｙｃ表达的作用。观察到血管紧张素Ⅱ能诱导左心室ｃ－ｆｏｓ和ｃ－ｍｙｃ的表达,ｃ－ｆｏｓ表达早于ｃ－ｍｙｃ表达,并呈量－效关系。这种作用可被血管紧张素Ⅱ受体抗剂ｓａｒａｌａｓｉｎ所阻断。这些结果提示血管紧张素Ⅱ诱导的ｃ－ｆｏｓ和ｃ－ｍｙｃ的表达是受体介导的。ＴＴＳ完全阻断血管紧张素Ⅱ诱导的ｃ－ｆｏｓ表达。     

反义c—fos和c—jun抑制IL—1诱导阿片肽分泌

白细胞介素（ＩＬ－１）及阿片肽作为神经调质参与了神经细胞兴奋性毒性作用,以大鼠大脑皮层神经细胞为研究对象,探讨了ＩＬ－１、阿片肽和ｃ－ｆｏｓ、ｃ－ｊｕｎ表达产物之间的关系,结果表明,ＩＬ－１β能诱导大脑皮层神经细胞ｃ－ｆｏｓ、ｃ－ｊｕｎ ｍＲＮＡ瞬时短暂表达,１５ｍｉｎ增高,３０ｍｉｎ达高峰,ｃ－ｆｏｓ ｍＲＮＡ ２ｈ回至基线水平,ｃ－ｊｕｎ ｍ ＲＮＡ ８ｈ回至基线水平;联合应用ｃ－ｆｏｓ,ｃ－     

癫痫模型大鼠海马原癌基因c-fos mRNA和蛋白质表达时程的研究

为了探讨癫痫发病机理与原癌基因的关系,将马桑内酯注入侧脑室,于大鼠癫痫发作后不同时间点取材海马,用Ｎｏｒｔｈｅｒｎ印迹杂交和Ｗｅｓｔｅｒｎ印迹分析技术对海马ｃ－ｆｏｓｍＲＮＡ和Ｆｏｓ蛋白表达的动力学进行了定量研究,激光扫描仪定量分析表明：（１）ｃ－ｆｏｓｍＲＮＡ在０．５ｈ表达最高,依次渐减,至４ｈ几无表达;（２）Ｆｏｓ蛋白在１ｈ开始表达,２ｈ最多,以后渐少。以上结果表明：ｃ－ｆｏｓｍＲＮＡ和Ｆｏｓ蛋白的表达随癫痫的发生发展出现规律性变化,ｃ－ｆｏｓｍＲＮＡ是快速,一过性表达,Ｆｏｓ蛋白的表达滞后且延长。提示：ｃ－ｆｏｓ在癫痫发病的基因机制中发挥作用,本文对此进行了讨论。本实验为深入研究癫痫发病的分子机制奠定了基础。     

碱性成纤维细胞生长因子对大鼠肾小球系膜细胞原癌基因c-fos和c-myc表达的影响

在建立大鼠肾小球系膜细胞（ＭＣ）体外培养方法的基础上,通过３Ｈ－ＴｄＲ参入实验,ＲＮＡ印迹分析和斑点杂交观察ｂＦＧＦ对ＭＣＤＮＡ合成及原癌基因ｃ－ｆｏｓ和ｃ－ｍｙｃ表达的影响．结果表明,ｂＦＧＦ作用于ＭＣ１８ｈ,ＭＣ的３Ｈ－ＴｄＲ参入率明显增加（Ｐ＜０．０５）,２４ｈ达到高峰（Ｐ＜０．０１）;ｂＦＧＦ显著诱导原癌基因ｃ－ｆｏｓ和ｃ－ｍｙｃ表达,其表达活性分别于３０ｍｉｎ和１ｈ达到高峰．提示ｂＦＧＦ是ＭＣ的强效丝裂原,其对ＭＣＤＮＡ合成的促进作用与诱导原癌基因ｃ－ｆｏｓ和ｃ－ｍｙｃ表达有关．     

一氧化氮在防止心肌肥厚反应中的作用及其机制

本工作从整体和细胞水平探讨一氧化氮（ＮＯ）在防止心肌肥厚反应中的作用及其机制。压力超负荷心肌肥厚大鼠左心室肌ＮＯ含量减少。内源性ＮＯ可能通过非ｃＧＭＰ依赖机制减轻压力超负荷引起的心肌肥厚。在培养的新生大鼠心肌细胞中血管紧张素Ⅱ（ＡⅡ）、内皮素－１（ＥＴ－１）和去甲肾上腺素（ＮＥ）通过各自的受体和偶连的Ｇ蛋白,一方面引起心肌细胞肥大;另一方面抑制一氧化氮合酶（ＮＯＳ）活性和ＮＯ生成。心肌细胞和非心肌     

L-苯丙氨酸与血管平滑肌细胞增殖

本文用氚标胸腺嘧啶核苷掺入ＤＮＡ合成法测定自发性高血压大鼠（ＳＨＲ）与正常对照鼠的培养主动脉血管平滑肌细胞（ＶＳＭＣ）增殖,观察Ｌ－苯丙氨酸对细胞增殖、细胞生长及原癌基因ｃ－ｆｏｓ、ｃ－ｍｙｃ表达的影响。结果显示：（１）Ｌ－苯丙氨酸剂量依赖性地抑制血清、碱性成纤维细胞生长因子及凝血酶诱导的ＤＮＡ合成;（２）Ｌ－苯丙氨酸剂量依赖性地抑制细胞对血清的增殖反应;（３）Ｌ－苯丙氨酸抑制血清诱导的ｃ－ｆｏｓ     

一氧化氮抑制血管紧张素Ⅱ和内皮素-1诱导的心肌细胞原癌基因c-fos表达

在原代培养的新生大鼠心肌细胞上, 探讨一氧化氮 (NO)对血管紧张素Ⅱ (AⅡ)和内皮素-1 (ET-1)诱导的心肌细胞肥大和原癌基因c-fos表达的影响.用Bradford 法测定心肌细胞总蛋白含量 (作为心肌细胞肥大的指标); 用基因特异性引物和 SuperScript一步法进行逆转录聚合酶链式反应 (RT-PCR), 检测大鼠心肌细胞原癌基因c-fos的表达 (以GAPDH为内标).结果显示, AⅡ和ET-1分别作用5 d和3 d后, 心肌细胞总蛋白含量显著增加; 硝普钠 (NO供体)可抑制AⅡ或ET-1诱导的心肌细胞总蛋白增加.AⅡ,ET-1和PMA (蛋白激酶C激动剂)均可诱导心肌细胞原癌基因c-fos的表达; L-精氨酸可抑制AⅡ,ET-1和PMA诱导心肌细胞原癌基因c-fos的表达, L-NAME (NOS抑制剂)可抑制L-精氨酸的这一作用; 硝普钠对可抑制AⅡ,ET-1和PMA诱导心肌细胞原癌基因c-fos的表达.结果表明, NO可抑制AⅡ或ET-1诱导的心肌细胞肥大和原癌基因c-fos表达, 其作用机制可能与蛋白激酶C这一环节有关.     

一氧化氮抑制AngⅡ介导的心肌肥大反应的信号机制

本文主要利用培养的新生大鼠心肌细胞,从细胞学及分子生物学角度研究一氧化氮（NO）信号系统在AngⅡ介导的心肌肥大反应中的作用及机制。实验以心肌细胞蛋白合成速率、心房钠尿肽（ANP）的表达作为心肌肥大反应的指标,以硝酸盐及亚硝酸盐含量反映心肌细胞NO水平,以免疫印迹法测定MKP－1蛋白表达,以RT－PCR测定eNOS mRNA水平。结果发现：（1）L－精氨酸（L－Arg)10,100μmol/L分别增加心肌细胞NO水平16％及31％,L－Arg(100μmol/L）还可增加心肌细胞eNOS mRNA表达,其作用可被NOS抑制剂L－NAME所抑制;（2）L－Arg(100μmol/L）可降低AngⅡ(0.1μmol/L）诱导的心肌细胞ANP mRNA表达水平和蛋白合成速率,而在L－Arg处理之前用针对MKP－1的反义寡核苷酸转染心肌细胞,蛋白合成速率明显增加,可取消L－Arg的抑制作用,甚至超过AngⅡ组;（3）L－Arg(100μmol/L）明显增加MKP－1蛋白表达,比对照组增加225％,NOS抑制剂L－NAME及蛋白激酶G（PKG）抑制剂KT－5823皆可抑制L－Arg诱导的MKP－1蛋白表达,分别抑制88％、83％,而AngⅡ能增加L－Arg诱导的MKP－1的表达,较对照组增加365％,增强了L－Arg的作用。以上结果表明,NO抑制AngⅡ介导心肌肥大反应的机制可能是通过激活PKG,促进MKP－1的表达,从而增加MAPK去磷酸化实现的。     

一氧化氮在血管紧张素Ⅱ诱导心肌细胞肥大中的作用

在培养新生大鼠心肌细胞上,探讨一氧化氮（ＮＯ）在血管紧张素Ⅱ诱导的心肌细胞以大中的作用。结果显示,血管紧张素Ⅱ可使心肌细胞蛋白质含量显著增加,心肌细胞一氧化氮合酶（ＮＯＳ）活性和培养液ＮＯ浓度明显降低。血管紧张素Ⅱ可明显降低心肌细胞ｅＮＯＳｍＲＮＡ水平。Ｓａｒａｌｓｉｎ和百日咳毒素（ＰＴＸ）可抑制血管紧张素Ⅱ诱导的蛋白质含量增加、心肌细胞ＮＯＳ活性减弱和培养液ＮＯ浓度降低。硝普钠提高心肌细胞培养     

一氧化氮在血管紧张素Ⅱ激活蛋白激酶C中的作用

实验在培养新生大鼠心肌细胞中检测NO前体L－精氨酸（L－Arg）和NO供体硝普钠（SNP）对血管紧张素Ⅱ（AngⅡ）激活蛋白激酶C（PKC）的作用,以探讨心肌细胞PKC水平的信号转导途径,实验结果如下：（1）无血清DMEM培养心肌细胞24h后加入AngⅡ,PKC活性呈剂量依赖性增高;（2）培养基中加入L－Arg,PKC活性呈剂量依赖性降低;（3）用L－Arg100μmol/L进行预处理,30min后分别加入AngⅡ0.1μmol/L或PMA10μmol/L,PKC活性均明显降低,与单纯AngⅡ组和单纯PMA组相比均有显著性差异;用NOS抑制剂L－NAME预处理后,再加入L－Arg,可明显阻断L－Arg对上述两个效应的影响;（4）培养液中加入NO供体SNP,PKC活性呈剂量依赖性地降低;（5）用SNP10μmol／L预处理心肌细胞,5min后分别加入AngⅡ或PMA,PKC活性分别与单纯AngⅡ和单纯PMA组相比均明显降低。以上结果表明,AngⅡ能剂量依赖性激活PKC,而NO可剂量依赖性抑制PKC活性;NOS参与L－Arg抑制AngⅡ或PMA激活PKC的作用。这些观察提示,NO抑制AngⅡ对心肌细胞的作用可能是通过抑制PKC活性实现的,PKC可能是NO和AngⅡ在心肌细胞内信号转导的交汇点（cross talk）。     

MKP—1在血管紧张素Ⅱ导致心肌肥大反应中的调控作用

本研究主要从丝裂原活化蛋白激酶磷酸酶－１（ＭＫＰ－１）角度,研究丝裂原活化蛋白激酶（ＭＡＰＫ）信号途径在血管紧张素Ⅱ介导的新生大鼠心肌细胞肥大反应中的作用及调控机制。实验以心肌细胞蛋白合成速率、蛋白含量及细胞表面积作为心肌肥大反应的指标,以凝胶内ＭＢＰ原位磷酸化测定ＭＡＰＫ活性,以免疫印迹法（Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｏｌｔｔｉｎｇ）分别测定ＭＫＰ－１及磷酸化ｐ４４ＭＡＰＫ、ｐ４２ＭＡＰＫ蛋白表达。结果发     

Endothelin-1 and angiotensin II contribute to BNP but not c-fos gene expression response to elevated load in isolated mice hearts

The early events in the cardiac hypertrophic process induced by hemodynamic load include activation of B-type natriuretic peptide (BNP) and c-fos gene expression. However, it is unknown whether stretch acts directly or through local paracrine factors to trigger changes in cardiac gene expression. Herein we studied the involvement of endothelin-1 (ET-1) and angiotensin II (Ang II) in load-induced activation of left ventricular BNP and c-fos gene expression using an in vitro stretch model in isolated perfused adult mice hearts. Two-hour stretch induced by increasing coronary flow rate from 2 to 5 ml/min increased the expression of BNP and c-fos genes by 1.9- and 1.5-fold, respectively (P<0.001 and P<0.05). A mixed ET(A/B) receptor antagonist bosentan attenuated the BNP gene expression response to load by 58% (P<0.005). A similar 53% inhibition was observed with the selective ET(A) receptor blocker BQ-123 (P<0.05). Type 1 Ang II receptor antagonist CV-11974 decreased the activation of BNP gene expression by 50% (P<0.05). In contrast, the activation of c-fos gene expression was not inhibited by antagonists of ET(A/B) and AT(1) receptors. Our results show that ET-1 and Ang II play a key role in the induction of BNP, but not c-fos gene expression in response to load in intact adult murine hearts.     

Regulation of Ras.GTP loading and Ras-Raf association in neonatal rat ventricular myocytes by G protein-coupled receptor agonists and phorbol ester. Activation of the extracellular signal-regulated kinase cascade by phorbol ester is mediated by Ras.

The small G protein Ras has been implicated in hypertrophy of cardiac myocytes. We therefore examined the activation (GTP loading) of Ras by the following hypertrophic agonists: phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA), endothelin-1 (ET-1), and phenylephrine (PE). All three increased Ras.GTP loading by 10-15-fold (maximal in 1-2 min), as did bradykinin. Other G protein-coupled receptor agonists (e.g. angiotensin II, carbachol, isoproterenol) were less effective. Activation of Ras by PMA, ET-1, or PE was reduced by inhibition of protein kinase C (PKC), and that induced by ET-1 or PE was partly sensitive to pertussis toxin. 8-(4-Chlorophenylthio)-cAMP (CPT-cAMP) did not inhibit Ras.GTP loading by PMA, ET-1, or PE. The association of Ras with c-Raf protein was increased by PMA, ET-1, or PE, and this was inhibited by CPT-cAMP. However, only PMA and ET-1 increased Ras-associated mitogen-activated protein kinase kinase 1-activating activity, and this was decreased by PKC inhibition, pertussis toxin, and CPT-cAMP. PMA caused the rapid appearance of phosphorylated (activated) extracellular signal-regulated kinase in the nucleus, which was inhibited by a microinjected neutralizing anti-Ras antibody. We conclude that PKC- and Gi-dependent mechanisms mediate the activation of Ras in myocytes and that Ras activation is required for stimulation of extracellular signal-regulated kinase by PMA.