甘薯非特异性脂质转移蛋白基因克隆与表达分析(英文稿)

非特异脂质转移蛋白（nsLTP）是植物界普遍存在的一类涉及多种胁迫反应的可溶性蛋白。为了阐明甘薯中非特异性脂质转移蛋白基因IbLTP1和IbLTP2在盐胁迫反应中的功能,本研究运用PCR技术,对IbLTP1和IbLTP2基因进行了克隆,并通过生物信息学方法分析了序列结构、蛋白质保守结构域和系统进化关系;利用qRT-PCR方法检测了这两个基因在不同组织中的表达模式以及盐胁迫条件下的表达差异;将IbLTP1和IbLTP2基因克隆到大肠杆菌的原核表达载体pET32a中,对重组菌BL21（pET32a-LTP）的耐盐性进行分析。序列分析表明：IbLTP1和IbLTP2编码区均不含内含子并都具有等位基因。IbLTP1和IbLTP2基因的蛋白质序列分别包括114和94个氨基酸残基并且不含色氨酸残基,蛋白序列N端含有信号肽序列。保守结构域和系统进化分析结果表明：IbLTP1和IbLTP2均含有nsLTP蛋白的保守结构域,IbLTP1属于Type Ⅰ而IbLTP2属于Type Ⅱ。实时荧光定量PCR分析表明：IbLTP1在幼叶中表达量最高,根中表达量最低;而IbLTP2在茎中表达量最高,成熟叶中表达量最低。在NaCl胁迫条件下,IbLTP1和IbLTP2表达量在根中基本无变化而在茎和叶中上调。大肠杆菌BL21（DE3）中异源表达IbLTP1和IbLTP2基因能够提高转基因菌株对NaCl的耐受性。因此,本研究推测IbLTP1和IbLTP2基因可能在甘薯盐胁迫反应中发挥了作用。     

小桐子JcACBP基因克隆和序列分析

以小桐子(Jatropha curcas)cDNA为模板,克隆了酰基辅酶A结合蛋白(Acyl-CoA-binding Protein)基因(JcACBP)的CDS序列,对其序列进行了生物信息学分析,并采用实时荧光定量PCR方法,研究了JcACBP基因在小桐子不同器官和果实生长发育阶段的表达模式。结果显示:JcACBP基因完全阅读框(coding sequence,CDS)全长279bp,编码92个氨基酸。预测其编码蛋白质的分子量为10.30kD,具有ACBP家族典型的结构域。JcACBP基因推测氨基酸与油桐(Vernicia fordii,AFZ62125)的亲缘关系最近(96%)。JcACBP基因在小桐子根、茎、叶、花、发育中的胚及果实等组织中都有表达,其中在花后40d的种子中表达最高,其次是果皮,而在根中表达较少;在果实发育过程中的表达与果实油脂积累的变化趋势基本一致。     

丹参非特异性脂质转移蛋白基因（SmLTP1）的克隆及其表达分析

对丹参EST序列进行Blast分析,获得一个新的非特异性脂质转移蛋白基因,命名为SmLTP1（GenBank注册号为EF187461）。该基因cDNA全长593bp,包含一个长为357bp的开放读码框,编码118个氨基酸。生物信息学结构分析表明,该蛋白具有植物nsLTP的典型结构,即4对二硫键,4个a-螺旋,1个可结合和容纳脂肪酸分子的类似口袋状的疏水结构。实时荧光定量PCR分析结果表明,SmLTP1基因在丹参不同组织器官中差异表达,其表达受病原菌和茉莉酸甲酯的诱导,显示SmLTP1基因在植物防御反应中发挥作用。     

西伯利亚蓼非特异性脂质转移蛋白基因PsnsLTP的功能分析

通过在农杆菌介导下,利用西伯利亚蓼非特异性脂质转移蛋白基因(植物表达载体：pROKII-PsnsLTP)对烟草进行遗传转化,经卡那霉素抗性分化筛选及PCR鉴定,获得6个转基因烟草株系。接种烟草炭疽病病菌和猝倒病病菌后观察转基因植株和野生型的表型差异,在NaCl、CdCl₂、7.5% PEG6000的胁迫下进行表型观察和生理指标的测定。结果显示：与野生型烟草相比,T1代转基因植株已具有较强的耐烟草炭疽病和猝倒病的能力;其超氧化物歧化酶（SOD）和过氧化物酶（POD）活性显著增强,丙二醛（MAD）含量显著降低,且幼苗具有较好的生长性状。由此证明,西伯利亚蓼非特异性脂质转移蛋白PsnsLTP增加了转基因烟草抵御生物胁迫和非生物胁迫的能力,这些工作为深入研究PsnsLTP基因的抗逆机制提供了参考。     

西伯利亚蓼非特异性脂质转移蛋白编码序列的克隆及其盐胁迫下的表达

根据西伯利亚蓼地下茎抑制消减文库(SSH)中获得的非特异性脂质转移蛋白(non-specific lipid transfer protein, nsLTP)EST序列,应用RACE技术克隆了具有Poly A的全长cDNA序列.该序列全长604 bp,其5′非翻译区65 bp,3′非翻译区227 bp,开放阅读框编码103个氨基酸残基;序列分析表明,该基因具有N端信号肽,具有nsLTP家族共有的典型保守区域,属nsLTP家族基因,命名为PsnsLTPs;荧光定量PCR分析表明,PsnsLTPs在西伯利亚蓼叶、茎、地下茎中均有表达.在3%NaHCO3诱导表达下,该基因在地下茎中表达明显受盐胁迫的诱导,推测该基因在抵御盐胁迫时具有重要作用.     

水稻非特异性脂质转移蛋白的原核表达、纯化及抑菌功能

将编码水稻非特异性脂质转移蛋白 (nonspecificlipidtransferprotein ,nsLTP)基因 (LTP110 )的克隆到硫氧还蛋白融合表达载体PET32a( )中 ,在BL2 1(DE3)trxB-宿主菌中实现了融合蛋白的高表达。通过Ni2 chelatingSepharosefastflow柱纯化融合蛋白后 ,通过肠激酶酶切再过该亲和柱得到了重组LTP110。CD谱扫描表明重组蛋白质与体内提取的nsLTP二级结构相似 ;荧光脂质结合实验表明该蛋白质具有结合脂肪酸分子的活性。对该蛋白质的抑菌功能进行研究后表明 ,LTP110具有抑制稻瘟病菌孢子萌发的功能 ,在较低浓度即能发挥活性     

小桐子低温诱导查耳酮合酶基因的克隆及其表达分析

为了解查耳酮合酶在小桐子(Jatropha curcas)抗冷性形成中的作用, 基于小桐子低温锻炼转录组和数字基因表达谱数据, 克隆了低温新诱导表达的小桐子查耳酮合酶基因(JcCHS), 并分析了该基因的表达特性和功能。结果表明, JcCHS 基因的cDNA全长为1386 bp, 包含完整开放阅读框(ORF) 1170 bp, 编码389个氨基酸, JcCHS的理论分子量为42.2 kDa、等电点为6.53, 与蓖麻CHS 蛋白序列的相似性高达93.6%, 具有III 型聚酮合酶家族保守的查耳酮合酶/ 对苯乙烯合酶结构域。半定量RTPCR分析表明, JcCHS 在小桐子各组织中都有表达, 其中根的表达量较高。JcCHS 基因的表达能在一定程度上提高重组酵母菌的低温抵抗能力, 这说明JcCHS 基因可能参与了小桐子的抗低温响应。     

薰衣草非特异性脂质转移蛋白基因nsLTP2-1和nsLTP2-2的克隆与功能分析

非特异性脂质转移蛋白（nsLTP,non-specific lipid transfer proteins）在植物脂质转运和分泌中发挥重要作用。本研究从薰衣草（Lavandula angustifolia）中克隆到2个II型nsLTP基因,命名为nsLTP2-1和nsLTP2-2,并对其进行功能分析。生信分析表明,nsLTP2-1和ns LTP2-2分别编码119个和117个氨基酸,具有脂转移蛋白（LTP,lipid transfer proteins）保守结构域和8个高度保守的半胱氨酸残基;系统进化分析显示它们处于两个分支,与同科的紫苏（Perilla frutescens）相似性最高。基因表达分析显示2个基因均在花蕾中高表达,在叶片、茎和花瓣中几乎不表达,在花萼中的表达存在差异,nsLTP2-1和nsLTP2-2分别在成熟花萼和幼嫩花萼中表达量更高;2个基因在花蕾和叶片中的表达均受到强光诱导,且在花蕾中的表达均受脱落酸诱导,而叶片中nsLTP2-1和nsLTP2-2的表达分别受茉莉酸甲酯和乙烯诱导。亚细胞定位显示2个nsLTPs均定位在细胞膜和细胞壁上,可能与次生代谢物的转运有关。...     

小桐子植物特异性酪蛋白激酶PS-CK1-5基因的克隆及原核表达分析

酪蛋白激酶(casein kinase, CK)作为一类普遍存在的Ser/Thr蛋白激酶，通过调节靶标蛋白的活性与稳定性，在植物整个生理过程及信号转导途径中发挥重要作用。基于同源序列比对，该研究对小桐子(Jatropha curcas)酪蛋白激酶基因家族进行鉴定与表达分析。结果表明，小桐子基因组中共鉴定到7个酪蛋白激酶1基因(CK1)、5个植物特异性酪蛋白激酶1基因(PS-CK1)、3个酪蛋白激酶2α亚基基因(CK2-α)、2个酪蛋白激酶2β亚基基因(CK2-β)，4个亚家族成员在氨基酸长度、等电点及外显子数目等都有其家族特异性。蛋白的氨基酸序列比对表明，小桐子酪蛋白激酶1都包含N端保守激酶结构域，同时其内部都鉴定到典型的激酶活性环基序、ATP结合核心基序、核定位信号肽。qRT-PCR表达分析表明，小桐子JcPS-CK1-5基因在叶片与根中都属于低温诱导基因，可能参与小桐子抗冷性过程。构建其原核表达载体pET-32a-JcPS-CK1-5，并在BL21(DE3)中诱导表达，得到81.6 kD的条带，与理论融合蛋白的分子量一致。这可为小桐子CK基因的功能鉴定及逆境信号转导机制研究提供参考。     

玉米非特异性脂转移蛋白的cDNA克隆和表达及表达产物的钙调素结合活性分析

用RT-PCR法克隆了成熟的玉米非特异性脂转移蛋白的cDNA,将它连接到表达质粒上并转化至大肠杆菌中表达。以钙调素凝胶覆盖法和钙调素亲和层析下拉实验对表达产物进行分析,证明它具有结合钙调素的活性,并且这种结合不依赖于Ca^2＋,与前期研究中钙调素结合蛋白-10和拟南芥非特异性脂转移蛋白1的结合特性相同。采用基因删除和缺失突变的方法研究玉米非特异性脂转移蛋白与钙调素结合的结构域,结果表明钙调素结合于47-60位氨基酸,预测的蛋白质二级结构为碱性双亲α-螺旋结构。     

麻疯树核糖体失活蛋白基因的克隆和表达

麻疯树(Jatropha curcas L.)核糖体失活蛋白(curcin)是存在于麻疯树种子中的一种毒性较强的蛋白,它与蓖麻毒蛋白和相思子毒蛋白的性质相似,属Ⅰ型核糖体失活蛋白.从麻疯树种子中分离得到一种分子量为28.2 kD的蛋白质,其对无细胞系统中蛋白质合成的抑制活性较强,IC50为(0.19±0.01)nmol/L,具有RNA N-糖苷酶活性.依据curcin的N端部分氨基酸设计简并引物,通过RT-PCR和5'-RACE技术从未成熟种子总RNA中克隆到curcin全长cDNA序列.该cDNA全长由1 173个碱基组成,包含一个编码293个氨基酸的前体蛋白,前42个氨基酸为信号肽.推测的多肽序列与测定的蛋白质N端序列相同,与多种己发表的Ⅰ型核糖体失活蛋白和Ⅱ型核糖体失活蛋白的A链有一定的同源性.将curcin的编码区与表达载体pQE-30相连后,转入大肠杆菌(Escherichia coil)M15菌株中得到了有效的表达.将表达的融合蛋白纯化后发现,它具有抑制无细胞系统蛋白质合成的能力.     

麻疯树核糖体失活蛋白基因的克隆和表达

麻疯树(Jatropha curcas L.)核糖体失活蛋白(curcin)是存在于麻疯树种子中的一种毒性较强的蛋白,它与蓖麻毒蛋白和相思子毒蛋白的性质相似,属Ⅰ型核糖体失活蛋白。从麻疯树种子中分离得到一种分子量为28.2kD的蛋白质,其对无细胞系统中蛋白质合成的抑制活性较强,IC_(50)为(0.19±0.01)nmol/L,具有RNA N-糖苷酶活性。依据curcin的N端部分氨基酸设计简并引物,通过RT-PCR和5′-RACE技术从未成熟种子总RNA中克隆到curcin全长cDNA序列。该cDNA全长由1 173个碱基组成,包含一个编码293个氨基酸的前体蛋白,前42个氨基酸为信号肽。推测的多肽序列与测定的蛋白质N端序列相同,与多种已发表的Ⅰ型核糖体失活蛋白和Ⅱ型核糖体失活蛋白的A链有一定的同源性。将curcin的编码区与表达载体pQE-30相连后,转入大肠杆菌(Escherichia coil)M15菌株中得到了有效的表达。将表达的融合蛋白纯化后发现,它具有抑制无细胞系统蛋白质合成的能力。     

一个麻疯树RING型锌指蛋白基因JcRFP1的克隆及表达

首次从麻疯树胚乳cDNA丈库中克隆得到一个RJNG型锌指蛋白基（GenBank登录号为JF920726）,命名为JcRFP1。该cDNA长度为728bp,包含编码JcRFP1蛋白的完整开放阅读框（516bp）。脚,基因在麻疯树各器官中均检测到表达且表达量依次为：叶〉茎〉花〉果实〉种子〉根。将克隆到的JcRFP1基因的cDNA序列连接到表达载体pET32a（＋）上,导入BL21（DE3）pLysS菌株,成功诱导表达相对分子质量为33．2kDa的可溶性融合蛋白。该融合蛋白免疫新西兰大白兔,得到效价为1：6500的抗血清。研究表明,JcRFP1蛋白具有体外泛素连接酶E3活性,在麻疯树体内可能参与油菜素甾醇信号转导途径。     

麻疯树脂酶全长基因克隆、表达及其蛋白质结构预测

脂酶(Lipase,EC3.1.1.3)是普遍应用于皮革、饲料及生物柴油工业的工业酶制剂,具有广泛的应用价值。目前对植物来源的脂酶研究较少。本研究用在生物柴油中具有应用前景的油料植物——麻疯树(Jatrophacurcas)作为研究对象,克隆了该物种的脂酶基因(JcLIP)。通过多序列比对并结合物种的亲缘关系设计了具有较高特异性的简并引物,通过使用RT-PCR和RACE技术,最终获得了麻疯树脂酶基因的全长序列并成功地在大肠杆菌中表达,酶活测定结果表明,麻疯树脂酶在大肠杆菌中表达在包涵体中,但是能产生具有活力的蛋白质,酶活约为0.8U.mL-1。结构预测和比较表明,JcLIP蛋白质具有脂酶的结构核心和催化活性中心,而在非核心区具有较毛霉脂酶更多的插入和随机卷曲,这可能是决定二者之间酶活差异的重要原因。     

麻疯树中ADP核糖基化因子基因的克隆和表达

从麻疯树cDNA文库中筛选到包含完整编码序列的ADP核糖基化因子的cDNA序列,命名为Jc-arf．其长度为887bp,开放阅读框546bp,推测的编码蛋白含181个氨基酸残基,具有典型的GTP结合蛋白家族的特点：P框（GLDAAGKT）、G’框（DVGGQ）和G框（NKQDL）。序列分析显示,Jc-arf矿接近于人类ClassI型arf基因,其蛋白序列与多种植物ARF有很高的同源性。半定量RT-PCR结果显示,Jc-arf的表达具有一定的组织特异性,在花中最丰富。PEG、低温、NaCl胁迫下,Jc-arf的表达受PEG和低温的诱导,而对NaCl胁迫不敏感。     

小桐子低温诱导型启动子JcDnaJ20p的克隆及烟草转化功能鉴定

低温转录组数据显示,DnaJ20是小桐子低温诱导基因.为鉴定该基因启动子的低温诱导活性,基于PCR技术从小桐子叶片基因组DNA中克隆到DnaJ20基因(JcDna20)启动子序列,命名为JcDnaJ20p,利用重组技术构建了JcDnaJ20p启动子驱动GUS标记基因的植物双元表达载体pCambia1381Z-JcDna...     

小桐子早期光诱导蛋白ELIP基因的克隆及其与靶向miRNA的互作与低温下共表达分析

【目的】作为一种喜温冷敏植物,低温严重影响小桐子的生长发育、地域分布与产量。前期工作发现12 ℃低温锻炼可显著提高小桐子的抗冷性,小桐子早期光诱导蛋白(ELIP)基因是低温高响应基因。为探究JcELIP在小桐子低温响应中的作用,全面了解JcELIP的结构、调控机制、进化关系及JcELIP与miRNAs的互作关系,也为后续小桐子抗冷分子育种提供一个重要的候选基因资源。【方法】通过RT-PCR克隆了小桐子JcELIP基因并对其进行了系统的生物信息学分析,采用RT-qPCR分析了JcELIP基因在根、茎、叶中及12 ℃低温锻炼过程中的表达变化,鉴定了与JcELIP互作的miRNAs,进行了12 ℃低温锻炼过程中的共表达分析。【结果】结果显示,该基因完整的开放阅读框(ORF)为585 bp,编码194个氨基酸,蛋白大小为2.04 kD,理论等电点为9.59,属于稳定的疏水碱性蛋白,具有3个疏水跨膜螺旋;三级结构主要由ɑ-螺旋和无规则卷曲组成,具有叶绿素a/b结合位点。顺式作用元件预测显示JcELIP具有脱落酸等激素响应元件。进化分析显示,小桐子JcELIP与木薯MeELIP同源性最高。RT-qPCR分析显示,正常生长条件下小桐子JcELIP在根、茎、叶中的表达量无显著差异;12℃冷锻炼条件下JcELIP在叶中表达快速上调,48 h时其表达量达到对照组的64.8倍,表明JcELIP参与了小桐子对冷胁迫的响应与适应。基于小桐子降解组数据,鉴定到miR390-x、miR6476-x和novel-m0090-3p等8个miRNAs对JcELIP的表达具有调控作用;共表达分析结果表明在12 ℃低温锻炼过程中JcELIP的表达受miR390-x和novel-m0090-3p显著的负调控。     

麻疯树MIPS基因启动子的分离及在烟草原生质体中瞬时表达活性分析

根据麻疯树MIPS基因序列,设计特异性的巢式引物,运用TAIL-PCR法两次步移得到MIPS基因5＇端侧翼序列,序列分析显示含有多个胁迫应答相关元件,如ABRE、HSE等。以该序列为基础,PCR扩增得到5个5＇端不同长度的缺失片段,分别插入pBI221载体置换CaMV35S启动子,构建的表达载体在PEG介导下转入烟草叶片原生质体进行瞬时表达,检测GUS报告基因的活性。经GUS活性荧光定量检测发现,分离到的MIPS基因侧翼序列5＇端不同缺失片段都能启动GUS报告基因表达,启动活性最高的是WQ1区（-565bp）,核心区位于-565～-449bp。在100μmol·L-1ABA诱导下启动活性增强,但不同区段的增长幅度不同。WQ1区增长幅度最大,比未处理时提高41.4%。     

Characterization of a New Stearoyl-acyl Carrier Protein Desaturase Gene from Jatropha curcas

A new full-length cDNA of stearoyl-acyl carrier protein desaturase was obtained by RT-PCR and RACE techniques from developing seeds of Jatropha curcas. Sequence alignment showed that its deduced amino acid sequence had high similarity with other stearoyl-acyl carrier protein desaturases. The gene was functionally expressed in E. coli and the desaturating activity of recombinant protein was easily detected when assayed in vitro with added spinach ferredoxin. Southern blot analysis indicated that the gene was a member of a small gene family. Northern blot analysis revealed it was highly expressed in developing fruits of J. curcas. Revisions requested 16 December 2005; Revisions received 6 February 2006     

麻疯树核糖体失活蛋白Curcin2的原核可溶性表达及其抗真菌活性研究

Curcin2是麻疯树幼苗在真菌侵染、干旱及高低温胁迫下诱导产生的一种核糖体失活蛋白.采用分子克隆的方法,从麻疯树基因组中扩增到Curcin2成熟肽编码基因,分别连接到质粒载体pGEX-6p-1、pMAL-c5E上,转化大肠杆菌最终获得重组菌PGC(pGEX-6p-1-curcin2)和PMC(pMAL-c5E-curcin2).在不同温度、IPTG浓度、时间诱导下,Curcin2在重组菌PGC中均以包涵体形式表达,在重组菌PMC中主要以可溶性融合蛋白形式表达,且蛋白质的表达量与诱导条件相关.重组菌PMC表达可溶性curcin2的优化条件为:温度28℃,IPTG 0.3mmol/L,时间8h,此条件下目的蛋白占总蛋白表达量的30.6％,1L培养物中可获得19.74mg电泳纯的重组蛋白.重组蛋白可被MBP TrapTM HP柱亲和纯化并与curcin抗体发生抗原抗体反应.体外抗真菌活性实验表明,纯化后的curcin2融合蛋白有抑制真菌生长作用,且对小麦赤霉、油菜菌核的抑制作用强于curcin.此蛋白的获得为其相关功能的研究奠定了基础.