禽网状内皮组织增生症病毒p30-gp90串联表达蛋白及其免疫原性

摘要:【目的】研究禽网状内皮组织增生症病毒(Reticuloendotheliosis Virus,REV)群特异性抗原P30与囊膜糖蛋白gp90体外共表达蛋白的免疫原性,为研发新型REV 抗体诊断试剂盒提供基础。【方法】根据REV脾脏坏死病毒(spleen necrosis virus,SNV)株的前病毒基因组cDNA序列,设计合成2对引物,以pPB101质粒为模板,分别扩增REV p30基因和gp90基因片段。将PCR产物依次克隆入表达载体pET-28a(+)中,通过酶切鉴定和测序分析,筛选阳性重组克隆pET-p30-gp90。重组菌经异丙基硫代D-半乳糖苷( IPTG)诱导后,通过SDS-PAGE电泳分析表达情况,Western blot检测表达蛋白与特异性血清之间的反应性。制备表达蛋白的抗血清,以该抗血清与REV感染的鸡胚成纤维细胞( CEF)进行间接免疫荧光实验(IFA),验证表达蛋白的免疫原性。【结果】经SDS-PAGE电泳后能观察到预期大小的表达条带,Western blot结果显示,重组蛋白能与REV抗血清反应。将表达产物纯化后免疫Balb/c小鼠,制备p30-gp90抗血清,该抗血清与REV感染CEF在IFA中呈现特异性荧光反应。【结论】体外串联表达REV p30-gp90蛋白,表达蛋白具有良好的免疫原性。     

禽网状内皮组织增生病病毒gp90全长蛋白的原核表达、纯化及其免疫原性分析

摘要：【目的】原核表达免疫原性良好的禽网状内皮组织增生病病毒（( Reticuloendotheliosis virus, REV )gp90蛋白,并制备抗gp90蛋白高效价多克隆血清。【方法】利用PCR技术,以pMD18T-env为模板,扩增得到REV的gp90蛋白编码基因,将其克隆入表达载体pET-28a(+)中,将构建的原核表达质粒pET28-gp90,转化大肠杆菌（Escherichia coli ) BL21 (DE3) 感受态细胞,经异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)诱导后进行gp90蛋     

家蚕蚕蛹过敏原CPH30的表达、纯化、免疫学鉴定及B细胞抗原表位预测

【目的】克隆、表达纯化出家蚕Bombyx mori蚕蛹过敏原蛋白CPH30(cuticular protein hypothetical 30 precursor),并对其进行免疫学鉴定及B细胞抗原表位预测。【方法】通过蛋白组学方法分析CPH30蛋白的潜在过敏原性,人工化学合成该蛋白基因,将基因连接到p ET-28a载体上,重组质粒转化至大肠杆菌Escherichia coli BL21,IPTG诱导基因表达。通过镍亲和层析获取高纯度蛋白,用Western blot方法对蛋白进行免疫学鉴定。通过DNAStar软件分析其潜在的B细胞表位。【结果】成功构建出CPH30基因的表达载体;表达纯化出CPH30蛋白,SDS-PAGE电泳结果显示分子量为25 k Da左右;Western blot结果显示,CPH30蛋白与家蚕过敏患者血清具有Ig E结合性,证明CPH30具有免疫原性;利用DNAStar软件成功分析出氨基酸序列第57-69和150-158位为潜在的B细胞表位。【结论】成功克隆表达出CPH30蛋白,并成功鉴定出其免疫原性,为家蚕蚕蛹过敏反应性疾病的特异性诊断和疫苗治疗奠定理论基础。     

猪圆环病毒2型Cap蛋白多克隆抗体的制备及鉴定

旨在制备猪圆环病毒2型(PCV2)Cap蛋白的多克隆抗体。以PCV2毒株(CAU0673)DNA为模板进行PCR,扩增目的片段大小约为702 bp,构建pET30a-PCV2-Cap重组质粒,转入大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导表达;对目的蛋白进行NiNTA树脂亲和层析纯化、复性,并进行SDS-PAGE和Western blot鉴定;将纯化后的重组Cap蛋白与弗氏佐剂混匀乳化,经背部皮下多点注射4次,免疫新西兰大耳白兔,制备成兔抗Cap蛋白多克隆抗体,采用Western blot和间接免疫荧光试验(IFA)验证兔抗血清特异性,并用间接ELISA测定抗血清抗体效价。PCR、双酶切和测序鉴定结果表明,重组质粒pET30a-PCV2-Cap构建正确;重组Cap蛋白以包涵体的形式表达,大小约为34 kD,复性后重组Cap蛋白可与PCV2阳性猪血清发生特异性反应;制备的多克隆抗体与PCV2重组Cap蛋白和全病毒抗原均可发生反应,ELISA抗体效价 1∶12 800,显著高于商品化疫苗组。     

猪δ冠状病毒(PDCoV)N蛋白的原核表达及多克隆抗体制备

旨在表达和纯化猪δ冠状病毒(PDCoV)N蛋白并制备该蛋白的多克隆抗体。以RT-PCR扩增PDCoV N基因并与表达载体pET-28a构建重组质粒,转化Transetta(DE3)菌株诱导表达,SDS-PAGE鉴定融合蛋白表达,以纯化的N蛋白免疫家兔制备多克隆抗体,Western blot验证兔抗血清特异性,间接ELISA测定抗血清效价。利用间接免疫荧光试验(IFA)、免疫荧光试验(IF)、流式细胞术(FCM)鉴定其诊断应用价值。重组N蛋白为可溶性表达,大小约为44 kD,制备的兔抗N蛋白抗体效价可达1∶204 800。IFA与FCM试验证实该抗体能与PDCoV特异性结合,与PEDV及TGEV无交叉反应,IF试验表明该抗体可用于检测小肠组织中的PDCoV。     

空肠弯曲菌FlaA单克隆抗体的制备与鉴定

【目的】原核表达空肠弯曲菌鞭毛蛋白FlaA,并制备其单克隆抗体。【方法】克隆目的基因并将其构建到pET30a(+)和pGEX-6p-1表达载体,分别以变复性纯化后的rHis-FlaA、rGST-FlaA蛋白为免疫原和检测原进行杂交瘤细胞的筛选。采用间接ELISA法测定细胞上清和单抗腹水效价,Dot-ELISA、Western blot分析单抗特异性。【结果】成功构建pET30a(+)-flaA和pGEX-6p-1-flaA重组原核表达质粒,并融合表达rHis-FlaA和rGST-FlaA蛋白,Western blot试验显示天然蛋白多抗血清能与体外表达的蛋白呈现特异性反应,表明表达蛋白具有免疫原性。筛选获得3株稳定分泌抗FlaA的单克隆杂交瘤细胞株,分别命名为2D12、5E12、6A9,其Ig亚类分别为IgG2a、IgG1、IgG1,腹水效价分别为1∶102400,1∶102400和1∶51200;Western blot试验显示,3株单抗均能与表达rHis-FlaA重组蛋白的细菌发生特异性反应;Dot-ELISA试验表明,3株单抗均能与不同来源的空肠弯曲菌分离株发生特异性反应。【结论】本研究制备的单克隆抗体有较高特异性,具有良好的应用价值。为进一步研究空肠弯曲菌鞭毛蛋白的生物学特性、致病机理,以及建立快速检测技术奠定基础。     

水稻条纹病毒RNA聚合酶在昆虫细胞中的表达

[目的]利用杆状病毒表达系统在昆虫细胞中表达水稻条纹病毒(Rice stripe virus,RSV)RNA聚合酶(RdRp)基因。[方法]RT-PCR扩增RdRp基因功能区片段,克隆于转移载体p Fast Bac HTb上,转化到大肠杆菌DH10Bac中,得到重组杆状病毒表达载体Bacmid-rp。提取Bacmid-rp DNA,转染Sf9细胞获得重组病毒v Ac-rp。将重组病毒v Ac-rp感染Sf9细胞使目的蛋白在细胞内表达,并利用亲和层析纯化,SDS-PAGE检测RdRp的表达情况。将纯化的RdRp蛋白免疫家兔制备多克隆抗体,Western blot分析RdRp的免疫原性。[结果]RSV RdRp基因功能区能够在Sf9细胞中表达,蛋白分子量约为45k Da,与预测大小一致,且可与RdRp抗血清发生特异性反应。[结论]在真核细胞中成功表达了RSV RdRp,并得到了纯化的RdRp和其多克隆抗体。     

II型鲤疱疹病毒ORF4的多克隆抗体制备及其组织分布

【目的】制备II型鲤疱疹病毒(Cy HV-2)ORF4多克隆抗体,利用免疫学方法研究ORF4编码蛋白在病毒感染过程中的组织表达特征。【方法】利用在线软件SMART和BLASTx分析Cy HV-2 ORF4序列,采用PCR技术从Cy HV-2基因组中扩增得到ORF4基因,克隆至表达载体PGEX-4T-3中,将获得的重组表达质粒转化到大肠杆菌BL21(DE3)中,用IPTG诱导表达,表达产物经过SDS-PAGE和Western blot鉴定,再利用亲和层析法纯化出重组蛋白。用纯化的重组ORF4蛋白免疫新西兰兔,收集兔血,分离兔血清获得抗ORF4蛋白的多克隆抗体,再利用Western blot检测抗体与ORF4蛋白之间的特异性。提取攻毒后的异育银鲫肌肉、脑、鳃、脾脏、肝胰脏、心脏、肾脏等组织DNA,用荧光定量PCR技术监测其病毒在各组织的复制水平。使用RIPA裂解液提取上述各组织总蛋白,再利用Western blot技术检测ORF4在感染Cy HV-2的异育银鲫各组织中的表达情况。【结果】原核表达的重组ORF4蛋白分子量为65 k D,与预期大小一致;获得的ORF4抗血清能特异性识别重组ORF4蛋白。病毒感染的异育银鲫体内ORF4主要表达在肾脏、脾脏和鳃上;荧光定量PCR证明Cy HV-2主要在肾脏、脾脏和鳃上富集。【结论】Cy HV-2的非结构蛋白ORF4可能参与病毒的复制,是病毒复制感染周期的特征性指示蛋白之一,这为深入研究ORF4在Cy HV-2感染过程中的作用机制提供参考。     

人GPC3基因的原核表达及多克隆抗体的制备

旨在构建人磷酯酰肌醇蛋白聚糖3(Glypican3,GPC3)原核蛋白,制备小鼠GPC3抗血清。扩增人GPC3基因c DNA的完整的开放阅读框,克隆至p ET28a原核表达载体,在大肠杆菌BL21表达菌株中诱导表达磷酯酰肌醇蛋白聚糖融合蛋白,利用亲和层析的方法纯化his-融合蛋白,通过SDS-PAGE电泳检测蛋白的纯度,并测定蛋白含量;免疫Balb/c小鼠,制备抗血清。结果显示,成功制备了小鼠抗GPC3多克隆抗体,抗体滴度为1∶51 200,经Western blot检查特异性良好。原核表达的重组人GPC3蛋白具有较好的免疫原性。     

表达EB病毒主要膜蛋白gp340/220不同蛋白区段的非复制型重组痘苗病毒的构建

Epstein-Barr病毒(EBV)主要膜蛋白gp340/220,是研究EBV亚单位疫苗的主要抗原.为了更详细地研究gp340/220的免疫原性,用PCR法获得不同区段的EBV BLLF1基因,并将其克隆入表达载体pNeock11β7.5中,通过重组质粒与非复制痘苗病毒在鸡胚成纤维细胞中同源重组,获得3株表达EBV gp340/220不同区段的重组痘苗病毒.PCR和Southern blot结果证实,各个重组病毒基因组中有相应外源基因的整合.Western blot结果表明,3种重组病毒感染人源细胞后都能够稳定表达蛋白,表达蛋白均为糖蛋白.免疫荧光结果表明,3种蛋白分布在细胞的不同部位.重组痘苗病毒的成功构建为更好地研究gp340/220的免疫原性提供了实验基础.     

结核分枝杆菌MPT83的免疫原性及其奶牛结核病血清学检测方法的建立

【目的】利用大肠杆菌系统表达并纯化结核分枝杆菌MPT83蛋白,通过小鼠模型评价其免疫原性,建立血清学间接ELISA方法用于牛结核病临床检测,评价其应用潜能。【方法】构建p ET30a(+)-mpt83重组质粒,转化BL21(DE3)诱导表达并纯化,经细胞表面分子的流式细胞术(Flow Cytometry,FCM)分析、ELISPOT试验等分析其在小鼠中的免疫原性,建立间接ELISA方法,检测临床奶牛血样,评价其用于牛结核病血清学检测的潜能。【结果】SDS-PAGE显示目的蛋白成功表达,Western blot证实其对兔抗H37Rv多抗血清具有良好免疫反应性;FCM结果显示其下调树突状细胞表面CD80分子的表达,上调小鼠脾脏CD4+和CD8+T细胞表面CD69的表达,ELISPOT结果表明其诱导的特异性IL-4分泌细胞数显著高于IFN-γ分泌细胞数,表现为Th2型免疫应答;建立了ELISA方法,检测临床奶牛血样200份,与牛结核外周血γ-干扰素体外释放试验结果的阳性符合率和阴性符合率分别为48.6%和90%。【结论】在大肠杆菌系统中高效可溶性表达MPT83蛋白,其在小鼠模型中主要呈现Th2型免疫应答,并以该蛋白为抗原建立了牛结核病血清学检测的间接ELISA方法。     

猪盖他病毒衣壳蛋白的原核表达、纯化和多克隆抗体的制备

原核表达猪盖他病毒(Getah virus)衣壳蛋白(Cap)并制备多克隆抗体。设计一对特异性引物,从含有Cap基因的pT-Cap质粒中扩增全长Cap基因,克隆至携带有His标签的原核表达载体pColdⅠ中,通过PCR、酶切鉴定和序列测定后,重组质粒pCold-Cap转化大肠杆菌Rosetta 2,IPTG诱导后SDS-PAGE和Western blot鉴定融合蛋白;蛋白经镍柱纯化后切胶免疫Balb/c小鼠,制备多克隆抗体。实验表明:经终浓度0.1mmol/L IPTG 15℃诱导24h后,Cap基因在Rosetta 2中获得高效表达,表达量占菌体蛋白的40.2%,SDS-PAGE显示融合蛋白相对分子质量为32.3kD。Western blot显示制备的鼠源抗血清可以与融合蛋白发生反应,有明显的特异性条带。猪盖他病毒衣壳蛋白原核表达成功,制备的多抗可以识别Cap蛋白。     

小反刍兽疫病毒Ｍ基因的截短表达及多抗血清的制备

目的 截短表达小反刍兽疫病毒M蛋白基因并将其用于多抗血清的制备。方法 之前有研究未能表达完整的M蛋白,而若在抗原性较弱的区域将其一分为二,以截短的形式进行表达,却能达到较理想的水平。因此根据GenBank上公布的PPRV M基因的序列,设计1对特异性引物,扩增出480 bp的目的基因,将其克隆至原核表达载体pET-32a(+)中,得到重组表达质粒pET-32a-PPRV-M1,后转化至Rosetta感受态细胞中,IPTG诱导表达后,通过SDS-PAGE和Western blot试验对重组蛋白进行鉴定,将纯化后的重组蛋白免疫6周龄BALB/c雌鼠,制备多克隆抗体血清。结果 经SDS-PAGE及Western blot鉴定,证明截短的M基因的蛋白主要以包涵体形式高效表达并具有良好的反应原性。结论 成功克隆表达了截短的小反刍兽疫病毒M基因的蛋白并制备了多抗血清,为建立血清学相关的检测方法及临床治疗奠定了基础。     

小反刍兽疫病毒M基因的截短表达及多抗血清的制备

目的截短表达小反刍兽疫病毒M蛋白基因并将其用于多抗血清的制备。方法之前有研究未能表达完整的M蛋白,而若在抗原性较弱的区域将其一分为二,以截短的形式进行表达,却能达到较理想的水平。因此根据GenBank上公布的PPRV M基因的序列,设计1对特异性引物,扩增出480bp的目的基因,将其克隆至原核表达载体pET-32a(+)中,得到重组表达质粒pET-32a-PPRV-M1,后转化至Rosetta感受态细胞中,IPTG诱导表达后,通过SDS-PAGE和Western blot试验对重组蛋白进行鉴定,将纯化后的重组蛋白免疫6周龄BALB/c雌鼠,制备多克隆抗体血清。结果经SDS-PAGE及Western blot鉴定,证明截短的M基因的蛋白主要以包涵体形式高效表达并具有良好的反应原性。结论成功克隆表达了截短的小反刍兽疫病毒M基因的蛋白并制备了多抗血清,为建立血清学相关的检测方法及临床治疗奠定了基础。     

Epstein-Barr病毒包膜糖蛋白gp85的原核表达

目的:利用大肠杆菌BL21诱导表达GST-gp85融合蛋白,进行动物免疫制备多克隆抗体。方法:通过PCR反应从EB病毒转染的绒猴淋巴细胞系B95-8细胞中获得了gp85BXLF2基因,将此基因克隆到大肠杆菌表达载体pGEX-5T,得到阳性克隆pGEX5T-85。转化大肠杆菌BL21,IPTG诱导表达重组蛋白,表达产物经SDS-PAGE分析、尿素变性、复性和亲和层析纯化,并用初步纯化的蛋白免疫BALB/c小鼠。结果:SDS-PAGE可见在相对分子质量约100000处有蛋白条带,Western印迹表明该蛋白可与免疫的BALB/c小鼠血清及鼻咽癌血清起特异性反应。结论:在大肠杆菌细胞中成功表达了GST-gp85融合蛋白,该蛋白具有较好的抗原性和免疫原性。     

Us11的表达及其多克隆抗体的制备

已有研究发现单纯疱疹病毒1(HSV-1)感染后,病毒的Us11蛋白在拮抗宿主先天性免疫反应中发挥重要作用。通过合成HSV-1的Us11基因,克隆表达制备针对Us11的多克隆抗体,为研究Us11的功能以及与宿主蛋白的相互作用提供的实验基础。通过人工合成Us11基因并以其为模板扩增,回收Us11基因片段,克隆至原核和真核表达载体;诱导表达Us11蛋白并纯化,制备Us11兔源多克隆抗体;转染质粒至293T细胞,对细胞表达的蛋白进行间接免疫荧光(IFA)和免疫印迹(WB)检测。成功构建p Cold-Us11和p FLAG-Us11质粒,实现可溶性Us11蛋白表达,纯化的Us11蛋白免疫动物获得针对Us11的多克隆抗体。IFA和Western blot结果显示,制备的抗血清能特异性检测到p FLAG-Us11转染293T细胞表达的Us11蛋白。     

HPV16 L1蛋白在大肠杆菌中的表达、纯化及免疫原性研究

用IPTG诱导目的工程菌pQE31-HPV16L1/M15(pREP4),对表达产物进行SDSPAGE和Western blot分析;用表达的L1蛋白免疫BAL B/C小鼠得到抗血清后,利用真核源性的VLP粗提物验证小鼠抗血清的特异性.利用IMAC金属亲和层析柱纯化L1蛋白.SDSPAGE结果显示表达产物在约57 ku处有蛋白条带;Western blot结果证实此条带可与HPV16 L1蛋白的单克隆抗体反应;纯化后的L1蛋白也同样保留免疫特异性;小鼠抗血清可与HPV16L1 VLP(病毒样颗粒)发生特异性反应,证实重组表达的L1蛋白具有免疫原性.本实验表明HPV16 L1蛋白在工程菌M15(pREP4)中高效表达,为研制HPV16预防性基因工程疫苗和感染的诊断试剂提供了物质基础和技术方法.     

鸡γ干扰素的可溶性表达及纯化产物的抗病毒活性

【目的】克隆鸡γ-干扰素（chIFN-γ）基因,大肠杆菌表达及产物纯化与活性检测。【方法】通过RT-PCR方法用ConA刺激的20日龄SPF鸡的脾脏淋巴细胞中扩增出chIFN-γ成熟蛋白基因cDNA,克隆至原核表达载体pET-32a (+),构建重组表达质粒pET-32a (+)-chIFN-γ,在大肠杆菌BL21（DE3）中经IPTG诱导表达,利用镍柱亲和层析法纯化可溶性蛋白,并进行SDS-PAGE、Western blot鉴定。利用MDCK-VSV系统测定抗病毒活性。【结果】克隆得到456 bp 的chIFN-γ成熟蛋白编码基因,大肠杆菌中成功表达chIFN-γ蛋白,分子量约为31.0 kDa,能与抗His的单克隆抗体和兔源多抗血清发生特异性反应。表达蛋白一部分形成包涵体,另一部分以可溶形式存在,可溶性蛋白经镍柱在天然条件下的纯化得率为3.0 mg/mL。生物学活性试验表明,1:32 稀释纯化的重组chIFN-γ （rchIFN-γ）孵育MDCK细胞后能抵抗100TCID50的VSV攻击。【结论】通过镍柱天然纯化获得的rchIFN-γ具有较好的抗病毒活性,为研制新型抗病毒干扰素制剂奠定基础。     

草鱼Ⅲ型呼肠孤病毒NS66抗体制备及应用

[背景]草鱼Ⅲ型呼肠孤病毒(grass carp reovirus,GCRV genotypeⅢ) 104株可导致典型性草鱼出血病,对其编码片段的分析有望为临床免疫学检测提供依据。[目的]研究GCRV104株s6基因节段编码蛋白NS66的可能功能,制备良好的GCRV104株NS66蛋白多克隆抗体并分析其特异性。[方法]PCR方法扩增GCRV104株s6基因片段,并克隆至表达载体pGEX-4T-3,转化到大肠杆菌BL21后用IPTG诱导表达,其产物经SDS-PAGE鉴定分析后,通过纯化获得目的蛋白。然后用纯化的pGEX-4T-3-NS66重组蛋白免疫小鼠,获得Anti pGEX-4T-3-NS66多克隆抗体,Western blot测定抗体效价,Western blotting和间接免疫荧光试验(indirect immunofluorescence assay,IFA)鉴定抗体特异性。[结果]SDS-PAGE分析显示表达的重组蛋白约66 kD,大小与预期相符,主要存在于包涵体中;Western blotting测得制备的多克隆抗体效价大于1:50 000,Western blotting和IFA结果表明,制备的多克隆抗体能特异性识别GCRV104病毒。[结论]GCRV104病毒编码的非结构蛋白NS66可能参与了复制和组装过程,形成病毒包涵体,这为建立GCRV104免疫诊断方法及研究GCRV编码的NS66蛋白的功能奠定了前期基础。     

诺如病毒NV衣壳蛋白VP1表达纯化及多克隆抗体的制备

目的 获得纯化的诺如病毒（NV）衣壳蛋白VP1,免疫动物制备多克隆抗体。方法 提取粪便样品中诺如病毒RNA,逆转录得到cDNA文库,通过PCR扩增获取VP1基因序列,构建到大肠埃希菌原核表达系统中诱导表达重组VP1蛋白。使用镍柱亲和层析法对重组蛋白进行纯化,十二烷基磺酸钠‒聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）和考马斯亮蓝法（BSA）对重组蛋白的纯度与浓度进行分析,以重组的VP1蛋白为抗原,免疫雄性SPF级SD大鼠获得多抗血清,用ELISA测定抗体效价、Western blot检测抗体特异性。结果 成功地构建出重组表达载体VP1-pET28a,并将其在大肠埃希菌BL21（DE3）中稳定地表达诱导重组蛋白。ELISA测其多抗血清的平均效价为1∶200000,Western blot检测抗体在原核和真核特异性很高。结论 本实验成功地利用原核表达系统表达诺如病毒衣壳蛋白VP1,为进一步研究诺如病毒的诊断和疫苗开发提供了条件。