结核分枝杆菌Rv1886c的原核表达及其免疫生物学特性

摘要:【目的】Rv1886c基因编码的Ag85B是结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis,M．tb)感染早期的分泌蛋白,本研究对其所诱导的免疫应答特性进行了探索。【方法】对Ag85B进行原核表达和鉴定,并通过夹心ELISA、间接ELISA及ELISPOT方法测定其诱导的细胞免疫和体液免疫应答水平。【结果】SDS-PAGE及Western blot鉴定结果表明,以包涵体形式表达的Ag85B蛋白,经变性、复性后能与结核病人的抗血清及免疫重组李斯特菌LM-Ag85B的小鼠抗血清发生特异性反应,表明His-Ag85B融合蛋白具有较好的免疫活性。将纯化的Ag85B 蛋白皮下免疫C57BL/6小鼠,夹心ELISA的测定结果表明,Ag85B蛋白免疫组诱导小鼠产生的特异性IFN-γ水平显著高于IL-4的水平(P＜0.001),呈现Th1型细胞免疫应答趋势;以结核菌素PPD作为包被抗原,通过间接ELISA测定的血清抗体效价达到1∶6400,表明Ag85B也能诱导有效的体液免疫应答。此外,以尾静脉途径初次免疫小鼠42天时,ELISPOT测定结果显示,结核分枝杆菌H37Rv诱导小鼠产生Ag85B240－259特异性的IFN-γ水平极显著高于卡介苗(BCG)免疫组(P＜0.001)。【结论】Ag85B蛋白能激发小鼠产生较强的Th1型细胞免疫应答和较好的体液免疫应答;BCG单次免疫后诱导小鼠产生的Ag85B特异的细胞免疫应答水平较低。本研究为揭示结核分枝杆菌的致病机理、新型疫苗的研制和早期诊断试剂的开发奠定了基础。     

结核分枝杆菌Rv2628蛋白的免疫生物学特性

Rv2628蛋白是结核分枝杆菌Mycobacterium tuberculosis(M.tb)DosR调控的潜伏感染相关抗原。本研究对Rv2628蛋白进行了原核表达和纯化,并以巨噬细胞系和小鼠为研究模型,对其免疫生物学特性进行了分析。SDS-PAGE及Western blotting鉴定结果表明,Rv2628-His融合蛋白以包涵体形式表达,能与兔抗H37Rv多抗血清发生特异性反应,具有较好的免疫反应性。与巨噬细胞系RAW264.7的互作实验结果表明,在1–12 h内Rv2628蛋白能诱导前炎性因子IL-6的上调表达。将纯化的Rv2628融合蛋白皮下免疫BALB/c小鼠,夹心ELISA的测定结果表明,Rv2628蛋白免疫组诱导产生的特异性IFN-γ水平显著高于IL-4的水平(P0.000 1),呈现Th1型细胞免疫应答趋势;以Rv262811-30多肽作为包被抗原,通过间接ELISA测定的血清抗体效价能达到11 600,表明Rv2628也能诱导体液免疫应答。总之,Rv2628能促进巨噬细胞炎症反应的发生,激发小鼠产生强烈的Th1型细胞免疫应答和较好的体液免疫应答,具有作为亚单位疫苗的潜力,为M.tb与宿主之间的相互作用奠定了一定的理论基础。     

结核分枝杆菌Rv2626c诱导的细胞免疫应答特性

全球有近1/4的人感染结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis,M.tb)并长期处于潜伏感染状态。Rv2626c是结核分枝杆菌受DosR调控的重要潜伏感染相关蛋白。本研究对Rv2626c蛋白进行了原核表达和纯化,并以RAW264.7细胞和小鼠为感染模型,对其免疫生物学特性进行了分析。SDS-PAGE及Western blotting鉴定结果表明,Rv2626c-His融合蛋白主要以可溶形式表达,能与兔抗H37Rv多抗血清发生特异性免疫反应。此外,本研究发现Rv2626c蛋白能结合到巨噬细胞RAW 264.7表面并上调细胞NO的生成;显著诱导促炎细胞因子IFN-γ、TNF-α、IL-6和MCP-1的产生;并能诱导小鼠产生更强的Th1免疫应答。上述研究有利于揭示结核分枝杆菌的致病机制,为新型结核病疫苗的研制奠定了理论基础。     

结核分枝杆菌Rv1884c基因的克隆及其原核表达

目的:构建结核分枝杆菌Rv1884c基因的原核表达质粒,获得结核分枝杆菌Rv1884c基因的表达蛋白。方法:制备结核分枝杆菌基因组DNA,采用聚合酶链反应技术扩增目的基因片段;通过pGEX-4T-1构建质粒载体pGEX-4T-1-Rv1884c,经序列测定证实正确后转化大肠杆菌DH5α,再经IPTG诱导表达GST-1884融合蛋白;用聚丙烯酰胺凝胶电泳分析重组蛋白的相对分子质量及表达形式。结果:扩增出了结核分枝杆菌Rv1884c基因,构建了具有正确基因序列的质粒载体pGEX-4T-1-Rv1884c,转化大肠杆菌DH5α后经诱导产生了高水平的表达产物。结论:构建了pGEX-4T-1-Rv1884c质粒载体,并诱导表达了GST-1884融合蛋白,为进一步研究Rv1884c蛋白的活性及其功能,探讨结核分枝杆菌快速促生长作用奠定了基础。     

结核分枝杆菌Rv3425蛋白的原核表达纯化及其血清学诊断价值

目的：用原核系统表达结核分枝杆菌Rv3425蛋白并纯化,评价该重组蛋白在结核病血清学诊断方面的价值。方法：以结核分枝杆菌H37Rv株基因组为模板,PCR扩增得到Rv3425基因序列,克隆至表达载体pET-28a中,转入大肠杆菌BL21（DE3）进行诱导、表达后纯化,用Western印迹和ELISA法进行抗原性初步评价。结果：在原核系统内经IPTG诱导表达后,Rv3425蛋白主要以包涵体形式存在,经复性和镍柱层析纯化后,纯度达95%以上;Western印迹和ELISA结果证明重组Rv3425具有较强的抗原活性;用纯化的Rv3425蛋白做抗原,临床诊断结核病人血清,阳性率达50%。结论：高纯度的Rv3425蛋白在结核病诊断方面具有很高的应用价值,可作为结核病诊断的备选抗原。     

结核分枝杆菌Rv3369基因的表达和纯化

在大肠杆菌中高效表达结核分枝杆菌Rv3369蛋白,获得纯化的重组蛋白rRv3369。通过聚合酶链反应(Polymerase chain reaction,PCR)扩增Rv3369基因;以质粒pET28a为表达载体,构建重组质粒,转化大肠杆菌BL21(DE3);以异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达目的蛋白,通过SDS-PAGE鉴定rRv3369在大肠杆菌中的表达,确定rRv3369在大肠杆菌中的表达形式;采用Ni-NTA His.Bind Resin来纯化重组蛋白。重组质粒pET28a-Rv3369中目的基因测序结果与报道序列相同。分子量约19.5kDa,表达量约占菌体总蛋白的18%,纯化后的重组蛋白样品经SDS-PAGE和激光密度扫描分析表明其纯度为90%以上,每100mL培养菌可获得1.56mg左右的重组蛋白。用亲和层析法纯化的重组蛋白纯度较好。     

结核分枝杆菌Rv3881c突变子的克隆及其在大肠杆菌中的高效表达

目的：融合表达结核分枝杆菌Rv3881c突变子抗原,以便与其他已知的免疫显性抗原联合使用,有效增加结核分枝杆菌感染血清学检验的敏感性和特异性。方法：将克隆的来源干结核分枝杆菌H37Rv株的Rv3881c突变体基因插入原核表达载体pET24b,并在大肠杆菌BL21中获得高效表达;由于重组的Rv3881c突变子抗原片段同C端的6xHis标签融合表达,使用Ni-柱进行快速纯化。结果：Western印迹表明,重组的Rv3881c突变子抗原同选取的6例结核病阳性临床血清标本均能发生明显的反应。结论：重组Rv3881c突变体具有较好的特异性,提示该抗原可能成为检测结核的有效抗原之一。     

结核分枝杆菌海藻糖磷酸磷酸酶诱导小鼠体液和细胞免疫应答

目的 研究结核分枝杆菌(M．tuberculosis)海藻糖磷酸磷酸酶(TPP)诱导小鼠体液和细胞免疫。方法 差速离心分离结核分枝杆菌H37Rv和卡介苗(BCG)的各细胞组分,通过Western杂交检测抗原TPP在结核分枝杆菌H37Rv和BCG中的亚细胞定位情况。分别用5×10~6CFU的BCG和50μg的TPP蛋白免疫C57BL/6小鼠,检测小鼠血清中抗TPP的IgG1和IgG2a抗体效价。取免疫小鼠的脾细胞,体外抗原刺激,用酶联免疫斑点试验(ELISPOT)检测γ干扰素(IFN-γ)分泌细胞。结果 TPP亚细胞定位于结核分枝杆菌H37Rv和BCG的胞壁和细胞膜组分。TPP蛋白免疫后小鼠产生的TPP特异性IgG1和IgG2a抗体效价明显高于BCG免疫小鼠,并且IgG2a的抗体效价高于IgG1。体外抗原刺激TPP蛋白和BCG免疫小鼠的脾细胞,都能诱导较高的IFN-γ分泌。结论 结核分枝杆菌细胞壁蛋白TPP能诱导小鼠Ⅰ型辅助性T细胞介导的免疫反应,可作为抗结核疫苗的候选抗原。     

结核分枝杆菌的免疫学研究进展

由结核分枝杆菌引起的结核病多年来依然是世界范围内严重的公共卫生问题。结核杆菌的致病特点是可在体内巨噬细胞中长期存活,形成潜伏感染。本文就结核杆菌感染过程中机体的免疫应答过程,尤其是潜伏感染形成机制等方面进行了综述,以期为结核病新型疫苗的研发提供参考。     

结核分枝杆菌Rv1009的生物信息学分析及克隆、表达

以往在对藤黄微球菌的研究中发现了促进复活因子(RPF),该因子可以有效促进休眠期的多种革兰氏阳性细菌复活和生长。生物信息学分析表明在多种革兰氏阳性细菌的基因组中均存在编码RPF样蛋白的基因。从GeneBank中获得了结核分枝杆菌、麻风分枝杆菌、谷氨酸棒杆菌和微链霉菌等革兰氏阳性细菌的多种RPF样蛋白相关信息,通过同源性分析发现这些蛋白均含有一个由75个氨基酸残基构成的高度保守序列,即RPF作用域。进一步对结核分枝杆菌H37Rv株的Rv1009进行了分析,并用PCR法克隆了其编码基因全长,定向克隆至pGEX 4T-2,在大肠杆菌BL21 (DE3)中获得了Rv1009-GST融合蛋白的高效表达,为深入探讨其生物学功能奠定了基础。     

结核分枝杆菌Rv3194c蛋白的亚细胞定位

【目的】Rv3194c基因编码的是结核分枝杆菌的PDZ信号蛋白,本研究探讨该蛋白的亚细胞定位,为其细胞结合蛋白的筛选奠定基础。【方法】从H37Rv基因组中扩增出编码只含有PDZ结构域的tRv3194c (Rv3194c 1–234 aa)的基因片段,在3′端加T2A和EGFP序列,一并插入真核表达载体构建出pcDNA3.1-tRv3194c-T2A-EGFP。将构建好的质粒瞬时转染L929细胞,并共感染重组痘苗病毒vTF7-3,用间接免疫荧光、流式细胞分选以及Western blotting检测融合蛋白的表达以及亚细胞定位。【结果】成功构建出真核表达载体pcDNA3.1-tRv3194c-T2A-EGFP,瞬时转染L929细胞后融合蛋白tRv3194c定位于线粒体膜上,且重组痘苗病毒vTF7-3的感染有助于靶蛋白表达水平的提高。【结论】Rv3194蛋白的PDZ结构域与线粒体外膜相关蛋白结合,为了解该蛋白在细胞内的致病机制提供重要线索。     

结核分枝杆菌持续感染小鼠模型的建立及其免疫特征

为建立小鼠结核分枝杆菌持续感染模型并研究其免疫应答特征,选取雌性C57BL/6小鼠,经尾静脉感染结核分枝杆菌H37Rv株,并以异烟肼和利福平联合治疗。分别于感染后4、8、12周处死小鼠,用平板法计数肺和脾荷菌数,酶联免疫吸附试验(ELISA)检测血清中特异性抗体水平及亚类,流式细胞术检测CD4+脾淋巴细胞经结核分枝杆菌抗原——纯化蛋白衍生物(PPD)刺激后分泌细胞因子的细胞比例。结果显示,感染4周后小鼠肺和脾荷菌数lg CFU分别达3.67±0.25和3.54±0.24,至少持续8周;药物治疗可有效降低脏器荷菌数。感染12周后,感染组血清中抗结核分枝杆菌特异性抗体水平显著升高(P0.01),且以IgG1为主;治疗组总IgG抗体水平显著低于感染组(P0.01),且IgG2a相对较高(P0.05)。感染组CD4+脾淋巴细胞中γ干扰素(IFN-γ)和白细胞介素2(IL-2)分泌细胞比例显著增加(P0.01和P0.001),而IL-4分泌细胞比例显著降低(P0.01);治疗组IL-2和IL-4分泌细胞比例显著低于正常组(P0.05和P0.01)。本研究建立的小鼠结核分枝杆菌持续感染模型有望用于结核病治疗性疫苗和药物的研发及筛选。     

结核分枝杆菌持续感染期抗原Rv1733c 的表达、纯化和鉴定

目的:克隆结核分枝杆菌持续感染期抗原Rv1733c基因,构建其原核表达载体,并在大肠杆菌中进行表达和纯化。方法:采用聚合酶链反应(PCR)方法从结核分枝杆菌H37Rv基因组中扩增出Rv1733c基因片段,克隆入pMD18-T载体,序列测定正确后将其亚克隆入原核表达载体pPro-EXHTb,并在大肠杆菌DH5α中进行表达,表达蛋白经SDS-PAGE及Western-blot分析后,以Ni-NTA亲和层析纯化蛋白。结果:成功克隆了Rv1733c基因片段并构建了其原核表达载体pPro-EXHTb-1733c,转化E.ColiDH5α后能表达大小约30 KD的蛋白,Western-blot分析表明表达产物正确。通过亲和层析获得纯化蛋白。结论:成功构建结核分枝杆菌持续感染期抗原Rv1733c原核表达载体pPro-EXHTb-1733c,并获得纯化蛋白,为研究新型结核疫苗的靶抗原奠定了基础。     

结核分枝杆菌H37Rv新基因Rv2742克隆表达及纯化

Rv2742是本课题组前期基于蛋白质基因组学策略从结核分枝杆菌Mycobacteriumtuberculosis H37Rv中发现、鉴定的遗漏注释基因。文中旨在建立结核分枝杆菌H37Rv漏注释蛋白Rv2742的可溶性诱导表达、纯化体系,为进一步探索Rv2742基因参与的生物学功能奠定基础。前期实验发现构建的pGEX-4T-2-Rv2742、pET-28a-Rv2742、pET-32a-Rv2742及pMAL-c2X-Rv2742原核表达载体均无法实现目的蛋白的诱导表达。但经密码子优化后,仅有pMAL-c2X-Rv2742载体能够实现目的蛋白的可溶性诱导表达。此外,通过比较不同宿主菌、温度及IPTG浓度对目的蛋白表达量的影响,发现目的蛋白在Rosetta (DE3)中,16℃及0.5mmol/LIPTG诱导条件下表达量最高。直链淀粉树脂(Amyloseresin)亲和层析柱纯化获得较纯的产物,经LC-MS/MS验证确认是Rv2742融合蛋白肽段序列。成功获得结核分枝杆菌H37Rv新基因Rv2742的重组蛋白,可进一步开展其潜在相互作用及免疫原性研究工作。     

结核分枝杆菌融合抗原Rv3914-6His的原核表达、纯化与抗原性检测

血清学诊断是目前临床诊断中应用最为广泛的方法之一,用原核表达并鉴定了系列结核分枝杆菌抗原融合蛋白Rv1908c-6His、Rv0733-6His、Rv0899-6His、Rv1411c-6His和Rv3914-6His,并以此包被酶标板,以Rv2031c-6His为阳性对照,采用间接ELISA方法比较了34例活动性结核病患者与35例健康体检者血清中抗结核分枝杆菌抗原的IgG水平。结果显示,活动性结核病患者中针对Rv1411c-6His、Rv3914-6His和Rv2031c-6His的IgG水平明显高于健康体检者,其中Rv3914-6His的AUC值(0.786 7)略高于目前临床应用的类似于16 ku的抗原Rv2031c-6His(AUCRv2031c=0.754),提示Rv3914抗原可能是结核病血清诊断的新的候选标志物。     

结核分枝杆菌Rv1057基因对巨噬细胞感染早期细胞因子表达的影响分析

Rv1057是结核分枝杆菌中唯一的7-折叠片β-螺旋蛋白,其生物学功能尚不清楚。为探讨Rv1057基因在结核分枝杆菌感染初期对巨噬细胞免疫应答的影响,利用Rv1057基因缺失菌株D1057和野生型H37Rv菌株感染巨噬细胞,检测结核分枝杆菌在巨噬细胞内的增殖速度,分析巨噬细胞在感染初期的细胞因子表达量变化。研究结果表明:D1057菌株在巨噬细胞内的活菌数量和增殖速度都显著低于H37Rv,被D1057感染的巨噬细胞中IL-1β、IL-10、TNF-α和IFN-γ表达量显著降低,但IL-8大量表达且无显著差异。上述研究结果证实,缺失Rv1057会降低结核分枝杆菌刺激巨噬细胞产生某些细胞因子的能力,明确了Rv1057基因参与结核分枝杆菌与巨噬细胞之间的免疫应答,为进一步解析Rv1057基因的生物学功能、结核分枝杆菌的致病机制奠定了基础。     

结核分枝杆菌免疫相关蛋白脯氨酸-谷氨酸家族的研究进展

脯氨酸-谷酸家族蛋白是一个在结核分枝杆菌中新发现高度保守的富含甘氨酸、丙氨酸的酸性蛋白质家族。目前认为该家族与结核分枝杆菌抗原变异相关,有利于细菌逃避宿主免疫系统,并通过抑制宿主免疫细胞对其抗原的呈递过程影响机体的免疫应答,干扰宿主对结核感染的保护性。该家族蛋白作为结核感染的免疫学标志,在结核诊断和新药物靶向以及抗结核DNA疫苗的研制开发方面具有重要意义和广阔的应用前景。     

结核分枝杆菌Rv1009结构域基因的克隆、表达及亲和层析纯化

目的:克隆结核分枝杆菌Rv1009结构域基因,经序列测定正确后进行融合表达和纯化。方法:采用PCR从结核分枝杆菌H37Rv基因组中扩增出Rv1009结构域基因,用限制性内切酶消化后插入pUC-19克隆载体中,经测序正确后亚克隆到融合表达载体pPro-EXHT中,转化大肠杆菌DH5α,目的基因经IPTG诱导,由T7启动子调控表达了N端带6个连续组氨酸残基的Rv1009结构域多肽,在变性条件下对目的蛋白进行纯化。结果:获得了结核分枝杆菌Rv1009结构域基因,得到融合6个组氨酸残基的Rv1009结构域多肽,纯化获得的蛋白纯度大于87%。结论:构建了结核分枝杆菌Rv1009结构域基因的重组表达载体,并获得了高纯度的融合表达蛋白,为后续深入研究奠定了基础。     

结核分枝杆菌Ag85A DNA的克隆与原核表达

抗原85(Ag85)复合体是BCG合成分泌的可刺激机体产生细胞免疫和体液免疫应答。Ag85A是抗原85复合体组成成分之一,可显著刺激细胞免疫功能增强。研究构建了高效表达的pTrcHisB-Ag85A基因重组质粒,并将其转化至大肠埃希菌TOP10中进行重组蛋白的表达,筛选转化物,SDS-PAGE进行蛋白表达的分子量检测,并通过Western Blotting方法,应用抗Ag85A的单克隆抗体进一步确认重组Ag85A蛋白的表达,建立了Ag85A的原核表达体系,为进一步制备出有效的重组Ag85A疫苗奠定基础。     

结核分枝杆菌Rv1884基因真核表达质粒的构建及表达

目的:构建结核分枝杆菌Rv1884基因真核表达载体。方法:PCR扩增Rv1884基因,测序正确后克隆入真核表达载体pcDNA3.1(-);经酶切鉴定正确的重组质粒酶以阳离子聚合物转染P815细胞后,以RT-PCR方法检测mRNA的表达,以间接免疫荧光技术检测目的蛋白的表达。结果:构建了重组质粒pcDNA-Rv1884;RT-PCR结果证明Rv1884可在P815细胞中转录;用间接免疫荧光检测,表达有Rv1884蛋白的细胞着染。结论:构建了结核分枝杆菌Rv1884基因的真核表达载体pcDNA-Rv1884,Rv1884基因可以在P815细胞中表达。