三种致病疫霉交配型分子检测方法的比较

致病疫霉Phytophthora infestans属于异宗配合卵菌,当A1、A2两种交配型同时存在时,可以进行有性生殖,产生卵孢子。检测疫霉菌交配型的传统方法是采用对峙培养,这种方法耗时长并且需要标准的A1、A2交配型菌株作为参照。因此,人们希望开发出更加简便和快捷的可直接基于核苷酸序列差异的分子检测方法。目前,已报道了3个与致病疫霉交配型紧密连锁的分子标记可用于交配型的检测。本研究用64株致病疫霉菌比较了3种基于交配型分子标记的检测方法与传统方法检测的结果。结果显示,依据分子标记的3种分子检测方法与传统对峙培养方法测定的交配型结果一致率为61%-73%,而且3种分子检测方法都不能检测出自育菌株。因此,致病疫霉交配型的分子检测方法还有待进一步研究。     

一个马铃薯种质资源圃致病疫霉群体的分析

由致病疫霉Phytophthora infestans引起的晚疫病是马铃薯生产上最严重的病害之一,认识其群体结构特征,可为晚疫病防控策略的制定以及抗病品种的合理布局提供指导。对2009年采自宁夏一个种植有93个品种(品系)的马铃薯种质资源圃的致病疫霉进行了交配型、致病型和线粒体DNA单倍型分析,结果表明,116个致病疫霉菌株中存在A1、A2和自育型3种交配型,发生频率分别为24.1%、57.8%和18.1%,A2交配型为优势类型;对其中43个菌株的致病型进行测试,检测到两种致病类型:1.2.3.4.5.6.7.8.9.10.11和3.4.10,发生频率分别为95.3%和4.7%,可克服所有11个抗病基因的1.2.3.4.5.6.7.8.9.10.11类型占绝对优势;对62个菌株的线粒体DNA单倍型进行分析,检测到Ia和IIa两种类型,发生频率分别为74.2%和25.8%。综合表型和基因型数据分析发现,该马铃薯种质资源圃中致病疫霉群体致病型单一,但致病型毒力因子高度复合;线粒体DNA分析表明,该马铃薯种质资源圃引入了遗传背景较为复杂的致病疫霉"新"群体。     

云南番茄致病疫霉的交配型、甲霜灵敏感性及毒力类型

对2003~2004年云南省番茄致病疫霉的交配型、甲霜灵敏感型、毒性因子及毒力类型进行了系统的测定和分析。结果表明:云南番茄致病疫霉只存在A1交配型,未发现A2交配型或自育型。甲霜灵抗性和中抗菌株是主要菌系,抗性、中抗、敏感菌株分别占测定菌株的51.2%、31.7%、17.1%。云南番茄致病疫霉居群对已知的抗性基因R1、R2、R3、R4、R6、R7、R8、R9、R10、R11有毒性,其毒性频率在9.8%~95.1%之间。测定的61个菌株中检测到26种不同的毒力类型,每种类型平均含有5.2个毒性因子,其中毒力类型1.3.4.7.9出现频率最高,为优势的毒力类型,出现频率为44.3%,其次为1.3.4.6.7.9、1.3.7.9,出现频率均为4.9%,其它23种毒力类型出现频率仅在1.6%~3.3%之间。云南番茄致病疫霉居群显示了复杂的表型特征。     

致病疫霉超级生理小种遗传多样性分析

通过交配型和甲霜灵抗性以及线粒体DNA单倍型、SSR和AFLP基因型分析对40个超级生理小种菌株进行了遗传多样性分析。在被测菌株中发现了A1、A2和自育3种不同类型的交配型。其中,A1和自育型菌株数量多,分别为21株和14株,而A2交配型仅5株。甲霜灵抗性测定检测出高抗菌株26株,敏感菌株14株。线粒体DNA单倍型测定出Ia型和IIa型两种,比例接近1:1。基于5个基因座被测40个超级生理小种菌株共鉴定出了7种SSR基因型。利用6对荧光引物共检测到258条AFLP谱带,其中多态性谱带204条,多态性为79.1%。将供试的40个菌株划分为38个基因型,几乎每个菌株都为1个特有基因型。而且,我国南方和北方超级生理小种群体存在着明显的遗传差异。结果表明我国致病疫霉超级生理小种具有丰富的遗传多样性,可以推断致病疫霉中的任何小种都可在多个抗病基因的强大选择压力下,在短时间内通过与之对应的无毒基因快速突变而成为超级生理小种。当前对致病疫霉生理小种的鉴定及监测对生产上利用抗病品种防控晚疫病的指导意义不大。     

中国部分地区马铃薯寄主上致病疫霉SSR基因型分析

利用两对SSR引物对两个基因座Pi4B和Pi4G进行了PCR扩增,测定了中国部分地区66个致病疫霉Phyophthora infestans(马铃薯晚疫病菌)菌株和2个参考菌株的SSR基因型,并对菌株的基因型进行了鉴定和命名.在被测定的66个致病疫霉菌株中,共产生了7种SSR基因型D-03,D-05,D-06,G-02,H-01,F-01和F-06,其中F-06为本研究新命名的基因型.F-01基因型菌株53个,占总菌株数目的80.3%,该基因型为中国致病疫霉的优势基因型.在对两个基因座Pi4B和Pi4G产生的等位基因统计分析发现基因座Pi4B产生的多样性比Pi4G高.对SSR数据揭示的河北、黑龙江和云南3个不同省份致病疫霉遗传多样性的比较发现,河北省和黑龙江省致病疫霉遗传多样性几乎相同,然而与云南省致病疫霉有较大的遗传差异.此外,发现致病疫霉SSR基因型与其对甲霜灵抗性无相关性.     

致病疫霉有性生殖诱导及F1代遗传多样性

致病疫霉Phytophthora infestans为马铃薯晚疫病的重要病原菌。通过从昆明市寻甸县采集110P和H-6两株致病疫霉,明确其染色体倍性、交配型、线粒体单倍型、毒性和甲霜灵敏感性,经对峙培养,利用改良的卵孢子萌发方法获得有性生殖F1代群体POP1（60株）,并对POP1进行表型和基因型测定。结果表明：冷冻处理24h为最佳条件,卵孢子萌发率达5.09%±0.15%;POP1的交配型、毒性和甲霜灵敏感性均发生了分离,其中交配型分离比为A1:A2:A1A2:自育型（SF）=16:5:17:22,毒性分离比为抗性（R）:敏感性（S）=11:49,甲霜灵敏感性分离比为抗性（R）:敏感性（S）=2:58;3个表型的分离均偏离孟德尔单基因显性遗传特点。基于8对SSR多态性引物对POP1基因型分析表明,遗传相似系数为0.98时,可将所有菌株分为14个基因型;遗传相似系数为0.95时,可将POP1分为6个分支,其中优势群体为S1,占分离群体的61.67%。关联分析进一步表明,8对SSR所代表的基因型和几个重要表型有显著相关性（R2=0.6667）。本研究建立了高效的致病疫霉卵孢子萌发体系,解析了有性生殖后代群体遗传结构特点,为深入探索致病疫霉的变异规律及病害流行趋势提供了理论基础。     

掘氏疫霉同宗配合、异宗配合特性的研究

本文对掘氏疫霉的同宗配合、异宗配合特性进行了研究,发现新分离的掘氏疫霉A~2交配型菌株,不经过配对培养可以产生卵孢子;菌种在15℃下保存,自身可孕性能力逐渐减退。菌株通过接种黄瓜后,异宗配合特性可以恢复,同宗配合特性不能恢复。经过营养生长,无性繁殖,菌株后代的交配型不引起改变。通过对疫霉属有关种不同交配型与掘氏疫霉各菌株不同交配型配对培养,以及菌种不同保存时间、不同培养基、疫霉属有关种的种间和种内配对,讨论了掘氏疫霉同宗配合、异宗配合特性的影响因素。     

中国疫霉属异宗配合种的交配型

在疫霉属真菌中,很多种是重要的经济植物的病原菌,寄主范围广泛,包括乔木、灌木和各种农作物;为害性大,常带来严重的经济损失。本文主要研究疫霉异宗配合种的交配型。根据疫霉在纯培养和成对培养(dual culture)中产生有性器官的能力,疫霉属可分为同宗配合种和异宗配合种两大类群。异宗配合种的A~1交配型与同一种或其它种的A~2交配型进行成对培养时,可以形成有性器官。两个可亲合菌系配合而形成有性器官时,可能发生基因重组,其结果将使病原菌具有更强的生存能力、致病力以及更广泛的寄主范围。因此,研究疫霉两种不同的交配型的分布,不仅对认识病害的发生发展规律,进一步设计防治措施有着重要意义,而且对疫霉属的起源、演化和移栖也有着深远的理论意义。作者对收集到的7个异宗配合种:Phytophthora capsici,P.cinnamomi,P.citrophthora,P.colocasiae,P.infestans,P.nicotianae,P.palmivora的38个分离物进行了交配型的研究,测定工作使用澄清的Campbell蔬菜汁琼脂培养基(V8C),用于确定交配型的菌系有P.nicotianae var.parasitica A~1,P.nicotianae var.parasitica A~2,P.cinnamomi A~1,P.cinnamomi A~2,P.palmivora A~1,P.palmivora A~2.每个分离物分别与已知种的A~1和A~2两个菌系成对接种于同一V8C平板上,放入25℃温箱中培养,2周后在两个菌落的连线上检查有性器官的产生情况。实验结果表明,中国疫霉属异宗配合种的这些分离物的交配型与寄主或地理分布似无相关性,同一种植物上分离到的同种疫霉可以是A~1交配型,也可以为A~2交配型;同一地区可以出现两种交配型,不同地区又有相同的交配型。云南西双版纳橡胶园中的分离物(P.citrophthora,P.colocasiae,P.palmivora)都表现为中性。     

河北省番茄上致病疫霉Phytophthora infestans群体结构的分析

番茄晚疫病是河北省番茄生产上最具毁灭性的病害之一,对引起该病害的致病疫霉群体结构进行分析有利于病害的防治。利用对峙培养法和菌落直径法对2007-2008年采自河北省保定、沧州和唐山分离自番茄的49个致病疫霉菌株进行了交配型和甲霜灵抗性的表型测定,结果表明该群体所有菌株均为A1交配型,以甲霜灵敏感菌株为主,抗性菌株仅7株。利用聚合酶链式反应-限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)、简单序列重复(SSR)和扩增片段长度多态性(AFLP)等分子技术对该群体的基因型进行了分析,结果表明供试菌株线粒体基因型均为Ia型,共鉴定出了Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ3种SSR基因型,AFLP聚类分析在相似系数0.87时可以形成α、β和γ等3个不同的分支。河北省所有番茄上致病疫霉菌株均分布在α分支上,该分支又可进一步分为7个亚分支。AFLP亚分支与甲霜灵抗性和地理来源均无明显相关性,但Ⅱ型SSR与甲霜灵抗性和地理来源有明显的相关性。综合表型和基因型数据说明河北省番茄上致病疫霉群体结构比较单一,遗传多样性程度较低。     

中国疫霉属真菌异宗配合的种的交配型

明确了异宗配合的疫霉属(Phytophthora)7个种(P.capsici,P.cinnamomi,P.drechsleri,P.melonis,P.nicotianae[=P.parasitica],P.palmivora 和 P.sinensis)47个菌株的交配型。特别有意义的是 P.drechsleri A~1和 A~2两个交配型在南京具有相同的优势,并且证实 P.cinnamomi A~1交配型的存在。     

马铃薯致病疫霉研究进展

马铃薯致病疫霉(Phytophthora infestans)属卵菌纲(Oomycetes)霜霉目(Peronosporales)腐霉科(Pythiaceae)疫霉属(Phytophthora),是马铃薯和番茄晚疫病病原菌。由于晚疫病对马铃薯生产的毁灭性和严重性,对致病疫霉的研究一直是关注的重点。本文首先对病害引起的症状、发生特点及流行规律进行阐述,对有性生殖发生的遗传规律和多种交配型共存的大环境下病原菌群体结构变异特点进行归纳总结。随着2009年致病疫霉基因组测序的完成,本文比对了疫霉属目前已完成测序各个种的基因组学特点,介绍了致病疫霉在效应子克隆方面的研究进展及线粒体基因组研究现状,阐述了功能基因组学的两个重要技术:高密度遗传连锁图谱(high density linkage mapping)和全基因组关联分析(genome-wide association study,GWAS),及其在挖掘致病疫霉重要功能基因上的应用。本文有助于了解致病疫霉研究热点及后续突破方向,可为深入解析致病疫霉的功能基因及致病机制提供参考,对开发马铃薯晚疫病菌药物靶标及预测病害的大规模流行趋势也具有重要意...     

影响活体内马铃薯晚疫病菌卵孢子产生因素的研究*

研究了不同菌株组合,马铃薯植株茎、叶及接种物中A1和A2菌株孢子囊比例、温度、湿度对卵孢子产生的影响。不同菌株组合产生卵孢子的数量有显著差异;在离体接种情况下,叶片中产生卵孢子数量大于茎中产生卵孢子数量;A1和A2菌株中孢子囊不同比例对卵孢子产生影响很大,当比值为1∶1时卵孢子产生量最大;15℃光照条件下培养,并给侵染叶片持续的水分供应才能产生大量卵孢子;寄主的抗性水平对卵孢子产生有明显的影响,中抗品种上产生卵孢子量最多,高抗品种上产生卵孢子量最少,感病品种上产生卵孢子量居中。     

Exoproteinases of the oomycete Phytophthora infestans

When grown in a medium containing heat-stable potato tuber proteins, the oomycete Phytophthora infestans (Mont.) de Bary produces a set of exoproteinases active at neutral and mildly basic pH values. These extracellular proteinases have been shown by SDS-PAGE with the presence of gelatin to include at least six components differing in molecular weight. Inhibitory analysis and study of the effects of the enzymes on various synthetic substrates show that the culture liquid of P. infestans contains mainly serine proteinases specific to trypsin and subtilisin and metalloproteinases. Their activity is suppressed by proteinase-inhibitor proteins from potato tubers. It is suggested that P. infestans exoproteinases may be the metabolic target for natural proteinase inhibitors from potato.     

利用马铃薯晚疫病菌粗毒素离体筛选马铃薯抗晚疫病无性系

以3个马铃薯品种叶片外植体的愈伤组织为材料、马铃薯晚疫病病菌培养粗毒素为筛选压力进行马铃薯抗晚疫病细胞变异无性系筛选。结果表明,不同品种的叶片、愈伤组织对毒素有不同的忍耐力。“费乌瑞它”最大忍耐的粗毒素浓度为40％,“东农303”、“早大白”则为50％。马铃薯晚疫病病原菌粗毒素对愈伤组织的诱导、生长、不定芽的分化及再生苗生根有显著的抑制作用,而且浓度越大,抑制作用越强。筛选结果抗性鉴定表明,经过粗毒素筛选的细胞无性系及其再生植株对高浓度粗毒素的抗性能力显著高于对照。     

Alteration of pathogenicity-linked life-history traits by resistance of its host Solanum tuberosum impacts sexual reproduction of the plant pathogenic oomycete Phytophthora infestans

Although sexual reproduction implies a cost, it represents an evolutionary advantage for the adaptation and survival of facultative sexual pathogens. Understanding the maintenance of sex in pathogens requires to analyse how host resistance will impact their sexual reproduction through the alteration of their life-history traits. We explored this experimentally using potato (Solanum tuberosum) and one of its pathogens, the heterothallic oomycete Phytophthora infestans. Sexual reproduction was highest on hosts favouring asexual multiplication of the pathogen, suggesting similar nutritional requirements for both sexual and asexual sporulation. Sexual reproduction was also highest on hosts decreasing the latent period, probably because of a trade-off between growth and reproduction. Distinguishing host effects on each pathogenic trait remains however uneasy, as most life-history traits linked to pathogenicity were not independent of each other. We argue that sexual reproduction of P. infestans is an adaptation to survive when the host is susceptible and rapidly destroyed.     

THE REACTION OF VIRUS-INFECTED POTATO PLANTS TO PHYTOPHTHORA INFESTANS

The growth of Phytophthora infestans was retarded on leaves of potato plants that had been artificially inoculated with virus X or with virus Y.
Using different virus strains and potato varieties, the effect of virus infection on blight development was found to be greater, the more severe the systemic virus symptoms exhibited on the infected leaves before P. infestans inoculation.
The development of the fungus was never increased by virus infection.
The reduced blight development on virus-infected leaves is partially caused by an increase of resistance to infection. It is also suggested that virus infection alters the nutritional status of leaves to one less favourable for the development of P. infestans.     

Development of PCR primers from internal transcribed spacer region 2 for detection of Phytophthora species infecting potatoes.

We developed PCR primers and assay methods to detect and differentiate three Phytophthora species which infect potatoes and cause late blight (Phytophthora infestans) and pink rot (P. erythroseptica and P. nicotianae) diseases. Primers based on sequence analysis of internal transcribed spacer region 2 of ribosomal DNA produced PCR products of 456 bp (P. infestans), 136 bp (P. erythroseptica), and 455 bp (P. nicotianae) and were used to detect the pathogens in potato leaf (P. infestans) and tuber (P. infestans, P. erythroseptica, and P. nicotianae) tissue with a sensitivity of 1 to 10 pg of DNA. Leaf and tuber tissue were processed for PCR by a rapid NaOH method as well as a method based on the use of commercially available ion-exchange columns of P. infestans primers and the rapid NaOH extraction method were used to detect late blight in artificially and naturally infected tubers of potato cultivar Red LaSoda. In sampling studies, P. infestans was detected by PCR from artificially infected tubers at 4 days postinoculation, before any visible symptoms were present. The PCR assay and direct tissue extraction methods provide tools which may be used to detect Phytophthora pathogens in potato seedlots and storages and thus limit the transmission and spread of new, aggressive strains of P. infestans in U.S. potato-growing regions.     

利用抑制差减杂交技术分离马铃薯晚疫病抗性相关基因

以晚疫病病原菌混合小种接种处理48h的马铃薯水平抗性材料(R-gene-free)叶片为目的材料,以未处理材料作为对照,用抑制差减杂交技术构建了一个富集晚疫病抗性相关基因的差减文库。应用反向Northern技术对840个克隆进行斑点杂交筛选,筛选出150个病原诱导后信号明显增强的克隆。26个片段测序结果表明：部分片段基因功能与抗病性明显相关。7个差异表达片段与GenBank EST数据库中已有晚疫病原诱导马铃薯叶片得到的EST有很高同源性(达95％～100％);部分片段核苷酸或氨基酸序列分别与番茄、烟草、拟南芥等的EST序列或氨基酸序列有较高同源性;另有4个基因片段在GenBank EST数据库中未找到明显的同源序列,可能为新发现的基因片段。     

PHYSIOLOGIC RACES OF PHYTOPHTHORA INFESTANS (MONT.) DE BARY IN NORTHERN IRELAND*

By using the detached-leaf technique and Black's series of differential host varieties, seven physiologic races of Phytophthora infestans (Mont.) de Bary have been distinguished as occurring in Northern Ireland. Six were found at the Dunanney potato variety trial plots, namely: race 1; race 2; race 4; race I, 2; race 1,4; and race I, z, 4. The remaining race, race 0, was isolated from the commercial potato crop.
In a survey, comprising seventy-three isolates, of the physiologic races occurring in the commercial potato crop, only race o and race 4 were found (3 and 70 isolates respectively).
Certain modifications to the detached-leaf technique have given improved results, including the formation of normal lesions and the elimination of atypical infections showing sparse sporulation.
The variation in the host-parasite reaction of the detached leaves and the identity of the common race in commercial potato crops are discussed.