粪产碱杆菌青霉素G酰化酶在枯草芽孢杆菌中的表达、纯化及其性质

利用PCR技术克隆了粪产碱杆菌 (Alcaligenesfaecalis,CICCAS1.76 7)青霉素G酰化酶 (pencillinGacylase ,PGA)基因 (GenBank登录号AF4 5 5 35 6 )。通过构建工程菌E .coli(pETAPGA) ,该酶在大肠杆菌中获得了表达 ,表达产物分泌到周质空间。进一步构建的工程菌B .subtilis (pMAPGA)和B .subtilis(pBAPGA)实现了该酶的胞外分泌表达。分泌表达的最高表达量为 6 5 3u/L ,比野生型A .faecalis表达量高 10 9倍。表达产物经硫酸铵分级沉淀和DEAE SepharoseCL 6B两步纯化 ,纯度提高 86倍 ,活力回收率达到 81% ,纯化后的PGA活力为 1.4 6 9u/mg。研究表明 ,PGA家族成员中只有粪产碱杆菌PGA和巨大芽孢杆菌PGA可以在枯草芽孢杆菌中分泌表达。与巨大芽孢杆菌PGA相比 ,粪产碱杆菌PGA的最适pH值为 8.0 ,最适温度为 6 0°C ,而且在有机溶剂中具有更强的稳定性。该酶在水相中具有较低的头孢氨苄合成活力。本研究为粪产碱杆菌PGA的获得提供了新的途径。     

重组青霉素G酰化酶在枯草芽孢杆菌中的表达条件优化

 为获得巨大芽孢杆菌青霉素 G酰化酶 (PGA)的高产菌株和条件 ,构建了分泌表达 PGA的基因工程枯草杆菌菌株 ,对表达条件进行了优化 .以 LB作为初始培养基 ,考察了温度、苯乙酸、装液量、碳源对于工程菌 PGA产量的影响 .实验发现重组细胞产酶不再需要变温和苯乙酸诱导 .充足的通气量和适当浓度的淀粉可使细胞密度及 PGA表达量大为提高 .表达条件优化后 ,菌体 A60 0由 3提高到 2 0 ,PGA的表达量由 3～ 6U/ml提高到 35～ 40 U/ml,为目前生产用巨大芽孢杆菌表达量的 6倍 .     

不同反应器裂解青霉素制备6-APA的条件

利用固定化酶或固定化细胞裂解青霉素制备6-APA(6-氨基青霉烷酸),在半合成青霉素工业上有重要意义。但上述反应过程中,反应液的pH逐渐下降,常使反应不能正常进行,因此研究适合的反应器和反应条件非常重     

生物法合成达泊西汀

通过固定化青霉素G酰化酶(PGA)对(±)-N-苯乙酰基-3-氨基-3-苯基丙酸进行酶法拆分,得到合成达泊西汀的中间体(S)-3-氨基-3-苯基丙酸,(S)-3-氨基-3-苯基丙酸经过还原、甲基化、缩合等多步化学合成得到最终产物达泊西汀。(±)-N-苯乙酰基-3-氨基-3-苯基丙酸的最佳拆分条件:底物(±)-N-苯乙酰基-3-氨基-3-苯基丙酸2.83 g,固定化的青霉素酰化酶2.66 g,pH 7.5,25℃反应4 h,(S)-3-氨基-3-苯基丙酸收率为89.4%,e.e.值99.3%。达泊西汀的总收率25.5%,e.e.值96.7%。     

在不同的相对湿度下聚谷酸和它的钠盐红外光谱研究

聚谷氨酸(PGA)和聚谷氨酸钠(PGA-Na)在不同的相对湿度(R H)下,用红外光谱仪测得它们的结构和侧链非离子化羧基的变化.固态PGA-Na(平均分子量[MW]8000),在50%R H以下能保持无规卷曲结构,在50—70%R H之间为β-折叠,70%R H以上为x-螺旋.以二氧六环:水二1.5:1(V/V)的混合液作为溶剂的PGA(MW8000)溶液,涂为膜后,在各种相对湿度下保持α-结构,但侧链非离子化羧基有变化,而且这种变化是可逆的.当PGA分散在水中成悬浮液后涂成的膜,在很宽的相对湿度范围内,保持α-螺旋不变,直至96%R H.才出现β-折叠,而且是不可逆的.     

含硫香料——硫代芳樟醇及其衍生物的合成研究

本文对香叶醇转化为硫代芳樟醇(4)及其衍生物的合成方法进行了研究。香叶醇与N,N-二甲基琉代氨基甲酰氯反应生成N,N—二甲基琉代氨基甲酸-O-香叶基酯(5),(5)通过[3,3]-σ迁移反应转变成N,N-二甲基硫代氨基甲酸-S-芳樟基酯(6),(6)进一步还原得到硫代芳樟醇(4)。(4)转变成衍生物硫代芳樟醇乙酸酯(7a)及芳樟基甲基疏醚(7b)。(4)及(7b)在高度稀释时具有愉快的热带水果香味。     

枯草芽胞杆菌PnbA酯酶选择性拆分制备l-薄荷醇

利用重组大肠杆菌表达来源于枯草芽胞杆菌CICC 20034中的PnbA酯酶,不对称催化水解dl-薄荷醇丙酸酯制备l-薄荷醇。考察助溶剂种类、助溶剂添加浓度、温度、催化剂用量、底物浓度以及p H等对反应的影响。结果表明:添加25%(体积分数)助溶剂乙醇可显著提升该酯酶对l-薄荷醇的立体选择性,对映选择率(E)由2.4提高到99.43,为不加乙醇条件下的40倍。酶催化最佳条件:25%乙醇作为助溶剂,反应温度37℃,缓冲液为0.1 mol/L Tris-HCl(p H 8.0)并保持p H 8.0反应条件,底物量50 mmol/L,反应体系中酶的添加量750 U/m L,在此条件下,酶促反应30 min后,l-薄荷醇转化率可达34%,产物光学纯度对映体过量值(e.e._p)达95%。     

非水溶剂中Rhizopus arrhizus脂肪酶催化合成三种酯的最佳条件(英文)

以少根根霉 (Rhizopusarrhizus)脂肪酶为催化剂 ,有机溶剂为反应介质 ,合成了 3种短链脂肪酸酯 .研究了反应温度、溶剂、底物浓度、底物摩尔比、吸水剂用量等因素对酯化反应的影响 .确定了3种酯的最佳合成条件 :(1)己酸乙酯 :反应温度为 4 0℃ ,环己烷为溶剂 ,0 2 5mol L底物浓度 ,酸醇摩尔比为 1∶1 2 ;(2 )乙酸异丙酯 :5 0℃ ,环己烷为溶剂 ,0 15mol L底物浓度 ,摩尔比为 1∶1;(3)乙酸异戊酯 :5 0℃ ,异辛烷为溶剂 ,0 2 0mol L底物浓度 ,摩尔比为 1∶1.三种酯合成时均需 0 12 5g ml的0 5nm分子筛为吸水剂 ,在 8h后 ,合成酯转化率达到 97%～ 99% .     

渗透压冲击法快速高效提取青霉素酰化酶

青霉素在临床上的大量使用造成了细菌的耐药性增强,青霉素本身又具有不宜口服、过敏性强等缺点,人们正致力于研究有诸多优良特性的半合成青霉素。大肠杆菌青霉素酰化酶用于裂解青霉素生产6-氨基青霉烷酸(即6-ＡＰＡ,半合成青霉素的重要中间体),该酶的提取、纯化和固定化研究在半合成青霉素工业有重要的意义[1]。大肠杆菌青霉素酰化酶属胞内酶,文献报道多采用超声波法提取,该法得到的粗酶液比活低,一般要经过四、五步纯化才能得到较高比活[2,3,4]的酶液。采用渗透压冲击法提取青霉素酰化酶,得到的粗酶液比活高,只需经过硫酸铵沉淀一步纯化就…     

色谱反应分离器中青霉素G的水解特性

6-氨基青霉烷酸(6-APA)是半合成青霉素的关键中间体,通常采用固定床反应器在青霉素酰化酶作用下水解青霉素来制备^[1]。由于该反应是典型的产物抑制可逆反应,工业生产中需不断加碱中和苯乙酸,以维持反应在最适pH条件下进行。为进一步提高青霉素的水解速率,除了维持最适反应条件外．消除产物抑制具有重要作用。近年来一些研究者提出采用伴有分离作用的反应分离组合系统水解青霉素 制取6-APA。Ishimura等^[2]采用电渗析膜耦合式生物反应器连续移除苯乙酸．将反应速率提高了近1倍;陈坚等^[3]研究了固定化酶-离子交换组合系统移除苯乙酸过程。本文报道青霉素在生化反应与液相谱分离过程相耦合而形成的色谱反应分离器中的水解特性。     

丹参酮IIA衍生物的合成

目的:丹参酮IIA是中药丹参的脂溶性成分,具有抗肿瘤、抗氧化、抗心脑血管疾病等多种生理活性。本文拟对其进行结构改造以获得活性更好的丹参酮IIA衍生物。方法:首先,以丹参酮IIA为原料,通过Vilsmeier反应在其16-位引入醛基,再与醋酸胺进行还原胺化反应,以较高收率得到16-位胺甲基取代的丹参酮IIA衍生物。接着,对其氨基进行修饰,得到10个不同N-取代的丹参酮IIA衍生物。同时考察反应温度、反应溶剂和反应时间等条件对还原胺化反应的影响,确定最佳反应条件。结果:通过1H-NMR、13C-NMR以及LC-MS对所有产物结构进行了确认。还原胺化反应的最佳反应条件为:以1,2-二氯乙烷为溶剂,温度保持40℃,反应时间为2h。结论:反应步骤简单、条件温和、产率较高,是合成16-位取代的丹参酮IIA衍生物的理想方法。     

产(R)-1,3-丁二醇的工程菌构建及转化条件研究

[目的]利用重组大肠杆菌实现(R)-1,3-丁二醇的生物合成。[方法]从脱硫球菌(Desulfococcus biacutus)中克隆得到羰基还原酶基因DbCR,构建pET28a-DbCR表达载体并在大肠杆菌E.coli BL21中表达,利用气相色谱对反应液进行检测。[结果]DbCR在pH 7.5、35℃的最适条件下的酶活力为4.5 U/mL。在50 mL全细胞反应体系中,重组工程菌在pH 7.5、30℃条件下,反应48 h时,对300 mmol/L底物4-羟基-2-丁酮的转化率 96%,产物(R)-1,3-丁二醇的e.e.值 99%。[结论]构建得到高效催化合成(R)-1,3-丁二醇的工程菌,工程菌对底物的转化率96%,产物纯度 99%。     

丁酸发酵液萃取-酯化偶联合成丁酸乙酯的研究

丁酸乙酯是一种广泛应用于食品、香精、化学、医药和能源等工业的短链酯类。为实现利用丁酸发酵液合成丁酸乙酯,通过络合萃取丁酸发酵液并在萃取相中直接进行脂肪酶催化丁酸和乙醇发生酯化反应,实现了丁酸发酵液萃取-酯化偶联合成丁酸乙酯。首先,确定了三辛胺(TOA)-环己烷为合适的萃取剂和酯化反应的反应溶剂。其次,对反应条件进行优化,在最优反应条件下,萃取相中Novozym 435催化合成丁酸乙酯反应5 h基本达到平衡,酯化率为81.42%,体积产率为65.96 mmol/(L·h);酶在该体系中重复利用6次,酯化率仍未见明显降低,维持在85.40%-87.83%之间。100 m L丁酸发酵液通过萃取-酯化后,丁酸乙酯相对于丁酸的得率为0.65 mol/mol。利用丁酸发酵液萃取-酯化偶联合成丁酸乙酯的工艺具有工业应用价值。     

球孢白僵菌固定化生物转化合成D-HPPA

[目的]利用球孢白僵菌进行固定化生物转化,将底物R-(+)-2-苯氧基丙酸(D-PPA)转化合成产物R-(+)-2-(4-羟基苯氧基)丙酸(D-HPPA)。[方法]利用海藻酸钠和聚乙烯醇对球孢白僵菌进行包埋处理,并对包埋条件进行累积优化。[结果]4%海藻酸钠和4. 5%聚乙烯醇混合后,再加入2. 5%的氯化钙作为交联剂交联8 h。在此包埋条件下制备的白僵菌凝胶珠,置于30 g/L的D-PPA进行固定化生物转化。反应5 d后,产物浓度最终为29. 9 g/L,平均生产强度为5. 98 g/(L·d),底物转化率为99. 7%。[结论]海藻酸钠和聚乙烯醇可用于白僵菌的固定化,且较游离菌体的生物转化的反应周期缩短28. 6%,平均生产强度增加64. 7%,底物转化率提高17. 7%。     

昆虫拒食剂蓼二醛的合成及其对害虫的拒食活性

以 β-环柠檬醛为原料 ,经 6步合成了蓼二醛 ( ( -) -polygodial)的消旋体 ,总收率为 1 9 8% ;并合成了其甲胺衍生物。经生物活性测定 ,辣蓼的粗提物和合成的蓼二醛及其甲胺的衍生物对蚜虫和菜青虫有很好的拒食活性     

大肠杆菌BL21(DE3)膜组分相关基因的敲除对重组蛋白胞外分泌的影响

摘要:【目的】探究Escherichia coli BL21(DE3)中膜组分相关的脂多糖合成基因waaF或msbB的敲除对重组蛋白胞外分泌的影响。【方法】运用Red重组技术将E.coli BL21 (DE3)染色体上的基因waaF或msbB敲除,构建敲除菌株E.coli BL21(ΔwaaF)、E.coli BL21(ΔmsbB)。将本实验室保存的带有β-呋喃果糖苷酶(β-fructofuranosidase,β-FFase)、青霉素G 酰化酶(penicillin G acylase,PGA)基因的重组质粒pET-ffase、pET-pga分别转入敲除菌株及出发菌株中,构建工程菌株E.coli BL21(ΔmsbB)/pET-ffase、E.coli BL21(ΔwaaF)/pET-ffase、E.coli BL21(DE3)/pET-ffase、E.coli BL21(ΔmsbB)/pET-pga、E.coli BL21(ΔwaaF)/pET-pga、E.coli BL21(DE3)/pET-pga。最后通过摇瓶发酵研究敲除菌株对β-FFase、PGA胞外分泌的影响。【结果】当诱导表达4 h,以出发菌株E.coli BL21(DE3)为宿主时,β-呋喃果糖苷酶β-FFase的胞外分泌量占总表达量的2.6%,以敲除菌株ΔmsbB为宿主时,胞外分泌量达到19.7%,而以敲除菌株ΔwaaF为宿主时,胞外分泌量达到50.9%。另外,当诱导表达24 h,以敲除菌株ΔwaaF为宿主时,青霉素G酰化酶PGA的胞外酶活是出发菌株中的4.1倍,达到1708 U/L。【结论】本研究成功构建了敲除菌株ΔmsbB和ΔwaaF,ΔmsbB能明显增强β-FFase的胞外分泌,而ΔwaaF对β-FFase和PGA的胞外分泌均有显著的强化作用。     

重组大肠杆菌高效催化合成γ-氨基丁酸

[目的]实现重组大肠杆菌高效合成γ-氨基丁酸(γ-aminobutyric acid,GABA)。[方法]构建表达谷氨酸脱羧酶的基因工程菌Escherichia coli p ET-GAD,对催化工艺进行初步优化,实现高效催化L-谷氨酸脱羧反应合成GABA。[结果]在谷氨酸脱羧酶的表达过程中,维生素B6盐酸吡哆醇(PN)可以替代5-磷酸吡哆醛(PLP)作为辅酶补给,提高工程菌E. coli p ET-GAD的催化活力。在50 m L反应体系中,重组细胞浓度为8 mg/m L,底物浓度为200 mmol/L,在35℃、p H 4. 4条件下反应2 h,L-谷氨酸的转化率 98%。为了提高GABA的生产效率,采用谷氨酸/谷氨酸钠分批补料方式控制反应过程中的p H值,GABA的最终浓度达到247 g/L。[结论]重组大肠杆菌可以高效催化合成γ-氨基丁酸,为基因工程菌工业化制备GABA提供实验依据。     

高产青霉素酰化酶巨大芽胞杆菌的诱变选育及产酶条件优化

【目的】选育高产青霉素G酰化酶(PGA)工业菌株。【方法】采用LiCl-紫外线复合诱变以及常压室温等离子体(ARTP)诱变技术对巨大芽胞杆菌(Bacillus megaterium) ATCC 14945进行处理。处理菌体涂平板后,将长出的菌落接种到液体培养基中,向培养6 h后的二代菌液中添加终浓度为0.1%的苯乙酸,28 °C、250 r/min条件下诱导培养40 h。对离心后获得的上清(粗酶液)采用NIPAB法测定PGA酶活力。以PGA酶活力最高的菌株为材料,对苯乙酸最佳添加量和最佳诱导时间进行优化,采用NIPAB法测定PGA酶活力。采用SDS-PAGE检测诱变前后巨大芽胞杆菌粗酶液中PGA的蛋白特性。【结果】从诱变菌落中筛选到PGA酶活力为39.60 U/mL的菌株12-4,酶活力比出发菌株提高了8.5倍。该菌株在液体培养6 h后添加终浓度为0.2%的苯乙酸,继续培养50 h后,PGA酶活力可达78.45 U/mL,比出发菌株提高了16.8倍。诱变前后菌株培养液中的PGA蛋白均具α、β亚基;诱变后菌株PGA α亚基的量没有明显变化,β亚基的量明显增多;α、β亚基之间的蛋白条带明显增多。【结论】采用诱变技术可提高巨大芽胞杆菌PGA活性,获得的诱变菌株12-4及培养条件对PGA工业化生产具有重要价值。     

碱催化合成4-甲基-2'-羟基-4'-甲氧基查尔酮及其晶体结构

探讨超声波辅助下用碱催化合成查尔酮的方法。常温超声波辅助下用碱催化使丹皮酚和4-甲基苯甲醛发生克莱森-斯密特反应,生成一种含有1,3-二苯基丙烯酮结构的丹皮酚衍生物:4-甲基-2'-羟基-4'-甲氧基查尔酮,产率高达71.57%,经过现代光谱学技术紫外、红外、质谱并结合核磁的氢谱、碳谱以及135°DEPT谱表征其结构。用X射线衍射技术分析该丹皮酚衍生物的单晶结构并确定其分子的构型和构象,4-甲基-2'-羟基-4'-甲氧基查尔酮属于单斜晶系中的P2(1)/n空点群,晶胞参数:a=1.1288(10)nm、b=0.6916(6)nm、c=2.0509(4)nm、α=90.0(8)°、β=109.8(8)°、γ=90(8)°,晶胞体积V为1.4056(5)nm3,密度Dc为1.272 mg/cm3。在超声波辅助下用碱催化可使丹皮酚和4-甲基苯甲醛通过克莱森-斯密特反应来合成含有1,3-二苯基丙烯酮结构的丹皮酚衍生物。     

4PU-30对猕猴桃组织培养影响的初步研究

在植物组织培养研究中常采用腺嘌呤的衍生物(如 KT,6-BA,玉米素,2ip 等)作为细胞分裂素(CTK)与生长素配合进行植物离体组织的分化与脱分化。本研究采用四川大学化学系周明跃先生合成的4PU-30[N-(4-吡啶基)N′-苯基脲]在猕猴桃组织培养中促使分化的作用并与腺嘌呤类化合物作一比较,简要结果如下: