抗冻蛋白基因结构与基因工程

鱼类抗冻蛋白有四种类型。Ⅰ型抗冻蛋白(AFP),富丙氨酸,如北美黄盖鲽AFP(Davies等1985,Scott等1985),Ⅱ型,富半胱氨酸,如海渡鸦AFP(Hayes等1989);     

抗冻蛋白结构基因片段的克隆

为了研究和开发利用抗冻蛋白或多肽,木文通过聚合酶链式反应（ＰＣＲ）合成了抗冻蛋白１１０ｂｐ的结构基因片段,然后将该基因片段克隆到大肠杆菌质粒载体Ｐ（Ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔ）Ⅱｋｓ＋／－上,获得了重组质粒,经酶切证明,获得的重组质粒中含有抗冻蛋白结构基因片段,以供该基因在大肠杆菌或酵母中表达抗冻蛋白。     

抗冻蛋白结构与抗冻机制

抗冻蛋白(amifreeze proteins,AFPs)是20世纪60年代从极地鱼血淋巴中分离的一种大分子抗冻剂,迄今为止科学工作者已从陆地昆虫、植物、细菌和真菌等各类生物中分离到多种抗冻蛋白,并测得了它们的基因序列及一些晶体结构,近些年的工作主要集中在该类蛋白质抗冻机制的研究上。抗冻蛋白具有广泛的应用前景,它不但可以应用于食物的冷鲜贮存及移植器官的低温保存,还可通过转基因提高经济作物的抗冻能力。     

鱼类抗冻蛋白的研究——Ⅱ.黄盖鲽抗冻蛋白基因cDNA的克隆及其在大肠杆菌中的表达

产于我国黄海的黄盖鲽(Pseudopleuronectes yokohamae)体内含有能阻止血液冰冻的抗冻肽(Antifreeze peptide AFP)。在对该蛋白进行纯化及对其特性的一系列研究的基础上,我们合成了一段抗冻肽基因的寡核苷酸片段。以此为引物,与黄盖鲽的mRNA进行杂交,从而特异性地反转录出抗冻肽基因cDNA片段。该片段经EcoRI Linker连接法克隆至大肠杆菌(E.coli)质粒载体pUC19上。抗冻肽cDNA插入片段经杂交证实后,对其进行了酶谱分析,核酸序列测定。重组克隆还在大肠杆菌JM83中得到了表达。     

转昆虫抗冻蛋白基因增强甘薯抗冻能力

为明确昆虫抗冻蛋白基因转入甘薯(Ipomoeabatatas)后是否能提升其抗冻能力,进而为培育甘薯抗冻育种材料奠定基础,将黄粉虫(Tenebrio molitor)抗冻蛋白基因TmAFP导入植物基因表达质粒,经农杆菌介导的遗传转化获得抗冻甘薯新材料。以甘薯品种Huachano为受体材料建立甘薯植株高效再生体系,并采用不同成分的体细胞胚成熟培养基培养胚性悬浮细胞。胚性愈伤组织对除草剂的敏感性测试结果表明,转基因阳性植株筛选的最适培养基为MS+0.2mg·L~(–1)2,4-D+0.8mg·L~(–1) GAP+100 mg·L~(–1)Carb。将表达质粒分别转化Huachano后共获得7个胚性愈伤团并最终获得42株再生抗性植株,其中转pSUIBEV3-AFP有23个株系,转pCAMBIA-AFP有19个株系,经PCR、Southern杂交和RT-PCR检测后证实TmAFP基因已整合至甘薯基因组中并获得表达。将转基因甘薯及对照植株在–1°C下处理15小时后转移至室温,结果表明,转基因甘薯植株的抗冻能力显著提升。     

昆虫抗冻蛋白基因的克隆与表达研究进展

产生抗冻蛋白(antifreeze protein,AFP)是许多昆虫抵御寒冷的一种重要机制。昆虫抗冻蛋白基因的克隆和表达是研究抗冻蛋白活性和功能的主要途径。文章归纳GenBank所登录的昆虫抗冻蛋白基因及其特点,总结昆虫抗冻蛋白基因的天然表达和基因工程表达方面尚未明确或需要克服的一些问题。目前在GenBank注册的昆虫抗冻蛋白基因约100个,集中于9种昆虫隶属鞘翅目3个科和鳞翅目1个科。昆虫抗冻蛋白基因具有多拷贝和多同种型(isoforms)的特点。昆虫抗冻蛋白的天然表达具有物种间和同种型间的多样性。基因工程表达昆虫抗冻蛋白需要克服表达量低活性不高的问题。对昆虫抗冻蛋白表达规律的研究有助于全面认识其功能。     

昆虫抗冻蛋白: 规则结构适应功能

抗冻蛋白在环境温度低于体液熔点时能够结合到生物体内的冰核表面,通过限制冰核生长和抑制冰晶重结晶而保护有机体免受结冰引起的伤害。与其他生物抗冻蛋白比较,昆虫抗冻蛋白有很强的活性,结构上具有显著特征,如一级结构规律重复,超二级结构为β-螺旋,可与冰晶发生相互作用,具有TXT基序等。该文综述了近年来关于昆虫抗冻蛋白的结构以及分子生物学等方面研究的新进展,讨论了其结构与功能的关系。     

转昆虫抗冻蛋白基因增强甘薯抗冻能力

为明确昆虫抗冻蛋白基因转入甘薯(Ipomoea batatas)后是否能提升其抗冻能力,进而为培育甘薯抗冻育种材料奠定基础,将黄粉虫(Tenebrio molitor)抗冻蛋白基因TmAFP导入植物基因表达质粒,经农杆菌介导的遗传转化获得抗冻甘薯新材料。以甘薯品种Huachano为受体材料建立甘薯植株高效再生体系,并采用不同成分的体细胞胚成熟培养基培养胚性悬浮细胞。胚性愈伤组织对除草剂的敏感性测试结果表明,转基因阳性植株筛选的最适培养基为MS+0.2 mg·L–12,4-D+0.8 mg·L^–1 GAP+100 mg·L^–1 Carb。将表达质粒分别转化Huachano后共获得7个胚性愈伤团并最终获得42株再生抗性植株,其中转pSUIBEV3-AFP有23个株系,转pCAMBIA-AFP有19个株系,经PCR、Southern杂交和RT-PCR检测后证实TmAFP基因已整合至甘薯基因组中并获得表达。将转基因甘薯及对照植株在–1℃下处理15小时后转移至室温,结果表明,转基因甘薯植株的抗冻能力显著提升。     

抗冻蛋白研究进展

南北两极的鱼类生活在低于 0℃ (约- 1 .9℃ )的海水中 ,适应于这种环境 ,其体液内有抗冻物质———抗冻蛋白 (ＡＦＰ)或抗冻糖蛋白 (ＡＦＧＰ) ,以防止体液内冰核的形成与生长。在越冬昆虫体内 ,有活性更高的抗冻蛋白。近年来在耐寒植物中也陆续发现了抗冻蛋白。本文将介绍各类抗冻蛋白的结构和生化性质、功能特性、抗冻作用机制、有关抗冻蛋白基因工程研究及抗冻蛋白的应用研究。1 .抗冻蛋白分子结构及生化特性1 .1　ＡＦＧＰ　　ＡＦＧＰ肽链是由Ａｌａ Ａｌａ Ｔｈｒ三肽单位重复组成 ,苏氨酸残基上接双糖基团 [3 Ｏ ( β Ｄ 半乳糖 ) …     

抗冻蛋白研究进展

抗冻蛋白是一类具有热滞效应、冰晶形态效应和重结晶抑制效应的蛋白质。简单介绍了各种抗冻蛋白的生化特征、作用机制及其应用研究 ,并对抗冻蛋白的基因和基因工程研究作了较为系统的综述。     

昆虫抗冻蛋白的结构与生物学特性研究

抗冻蛋白(antifreeze proteins AFPs)是一类抑制冰晶生长的蛋白质,它能以非依数性形式降低溶液的冰点而对其熔点影响甚微,因而也被称作热滞蛋白。近几年来对于昆虫抗冻蛋白的研究取得了较快的发展,已有20多种昆虫抗冻蛋白被分离纯化。就昆虫抗冻蛋白的结构特征、生物学特性以及在农业、医学和食品工业等方面的应用进行介绍。     

低温对转抗冻蛋白基因罗非鱼影响的初步研究

本文阐述了逐渐降低水温对转抗冻蛋白基因罗非鱼生存影响的初步观察结果。用３０尾转抗冻蛋白基因罗非鱼,从２２℃开始,以２℃／ｈ下降至７℃,发现在９℃有６尾死亡,７℃又有１０尾死亡,有１４尾存活,但有不同表现,从存活１４尾鱼和死亡的６尾鱼中提取总ＤＮＡ,作原位杂交,有１０尾为阳性,再从这１０尾呈阳性鱼肝中分离总ＲＮＡ,作ＲＮＡ—ＤＮＡ杂交并未发现阳性结果,表明有外源ＤＮＡ的整合,但未发生转录或弱的转录,不过有部分转基因鱼表现出具有耐低温能力。     

赤翅甲抗冻蛋白基因的原核表达及蛋白生物活性检测

根据GenBank中序列人工合成赤翅甲Dendroides canadensis的抗冻蛋白基因（afp）,将其克隆到载体pGEX-4T-1上,构建融合表达的重组质粒,转化大肠杆菌 BL21并进行原核表达。通过优化表达的诱导条件和SDS-PAGE检测,证明人工合成的赤翅甲抗冻蛋白基因能够特异性地表达,并以可溶性融合蛋白形式存在,相对分子质量约为40 kD。抗冻蛋白的生物活性检测表明,赤翅甲的抗冻融合蛋白能够提高细菌的耐寒能力。     

黄粉虫不同抗冻蛋白基因家族成员的低温应激表达

黄粉虫Tenebrio molitor L.抗冻蛋白基因家族有多个成员,其氨基酸数量和蛋白结构存在差异。尽管有报道发现冷驯化后这些抗冻蛋白的表达量会升高,但不同家族成员是否存在功能分化尚不清楚。本研究中,检测了冷驯化对低温死亡率的效应和对不同类型的抗冻蛋白家族成员基因表达量的影响。结果表明,冷驯化可以显著降低黄粉虫幼虫的低温死亡率和提高不同类型抗冻蛋白基因的表达量。其中,长的抗冻蛋白和低温死亡率的相关关系最为明显。说明不同的抗冻蛋白家族成员的功能有明显的分化,为进一步理解抗冻蛋白的活性和利用抗冻蛋白提供了新的认识。     

用美洲拟鲽抗冻蛋白基因转化植物的问题

评估了我们用美洲拟鲽抗冻蛋白基因转化烟草和国内有人用同一基因转化蕃茄的研究,提出植物耐寒性状的提高与转基因植物中抗冻蛋白含量呈正相关是转基因植物成功的关键性指标。同时,美洲拟鲽抗冻蛋白的空间结构与冷诱导蛋白相似而且都保护细胞膜免受冻害,因而提出了用冷诱导蛋白调节元的顺式作用元件和反式作用因子的调控序列来控制抗冻蛋白基因在植物中冷诱导表达的思路。     

用美洲拟鲽抗冻蛋白基因转化植物的问题

评估了我们用美洲拟鲽抗冻蛋白基因转化烟草和国内有人用同一基因转化蕃茄的研究 ,提出植物耐寒性状的提高与转基因植物中抗冻蛋白含量呈正相关是转基因植物成功的关键性指标。同时 ,美洲拟鲽抗冻蛋白的空间结构与冷诱导蛋白相似而且都保护细胞膜免受冻害 ,因而提出了用冷诱导蛋白调节元的顺式作用元件和反式作用因子的调控序列来控制抗冻蛋白基因在植物中冷诱导表达的思路。     

抗冻蛋白及其在植物抗冻基因工程的应用

从应用的角度系统综述了抗冻蛋白（ＡＦＰs)的特性、活性、用途、生化特征、在细菌中的表达,在植物抗冻生理中的作用及其基因工程,简洁地讨论了抗冻蛋白的研究现状和最新进展。