番茄 DEAD-box RNA 解旋酶基因 SlDEAH1 的克隆及表达分析简

DEAD-box RNA解旋酶是一种特殊的RNA分子伴侣,参与了RNA代谢,包括前体RNA剪接、核糖体合成、RNA降解以及基因表达,并对植物的发育和抗性等也具有重要作用。根据已报道的拟南芥DEAD-box蛋白,通过同源比对,在NCBI据库中筛选得到一个DEAD-box RNA解旋酶同源蛋白,命名为SlDEAH1,并根据其基因序列设计特异引物,应用RT-PCR方法从野生型番茄（Solanum lycopersicum）AC⁺⁺中克隆得到了该基因的全长编码区序列。利用生物学网站、软件及实时荧光定量PCR方法,对其进行生物信息学、表达模式、胁迫及激素处理分析。结果表明：SlDEAH1包括2 073 bp的开放阅读框,编码690个氨基酸残基,其编码蛋白有9个保守结构基序,其所涉及到的ATP结合、ATP水解及RNA结合等功能对于解旋酶活性是至关重要的;表达模式分析表明SlDEAH1基因可能在野生型番茄萼片、叶片发育及果实成熟方面起到重要作用;高温、低温、脱水、伤害、盐胁迫不同程度的诱导了SlDEAH1的表达,但在根中该基因的表达受盐胁迫抑制;ABA、ACC、IAA、GA₃、MeJA和ZT均不同程度诱导了SlDEAH1的表达,其中ABA诱导效应最为明显。这些结果为进一步研究SlDEAH1在番茄发育和胁迫响应中的功能奠定了基础。     

水稻受盐抑制基因OsZFP1的转基因分析

OsZFP1(水稻锌指蛋白1)基因编码的蛋白含有3个推测的Cys2/Cys2-型锌指结构域,它的表达受盐胁迫负调控。构建了以35S为启动子的OsZFP1基因的植物表达载体,并将其转入拟南芥(ArabidopsisthalianaL.)植物和水稻(OryzasativaL.)愈伤组织中以过量表达OsZFP1基因。转基因的拟南芥植株和水稻愈伤组织对盐处理的敏感性都比野生型要高。这一结果表明OsZFP1基因可能编码一种负调控蛋白,它可能抑制某些盐诱导基因的表达。在ABA处理下,转基因拟南芥植株比野生型植株抽苔晚,说明OsZFP1基因的作用可能受ABA调节。     

DEAD-box基因家族在拟南芥生长发育中的作用

在RNA代谢过程中,需要许多蛋白和核酸的参与,其中一类蛋白就是RNA解旋酶。RNA解旋酶通过水解ATP获得能量来参与RNA代谢的多个方面,包括核内转录、pre-mRNA的剪切、核糖体发生、核质运输、蛋白质翻译、RNA降解、细胞器内基因的表达。DEAD-box蛋白家族是RNA解旋酶中最大的亚家族,它具有9个保守结构域,因motifyⅡ的保守氨基酸序列Asp-Glu-Ala-Asp(DEAD)而命名。该家族在酵母、拟南芥(Arabidopsis thaliana Heynh.)和人类基因组中都有较多的家庭成员。近年来,研究者对拟南芥DEAD-box蛋白家族的结构和功能进行了一些研究,本文着重总结DEAD-box基因家族对拟南芥生长发育的影响。     

水稻受盐抑制基因OsZFP1的转基因分析

OsZFP1(水稻锌指蛋白1)基因编码的蛋白含有3个推测的Cys2/Cys2-型锌指结构域,它的表达受盐胁迫负调控.构建了以35S为启动子的OsZFP1基因的植物表达载体,并将其转入拟南芥(Arabidopsis thaliana L.)植物和水稻(Oryza sativa L.)愈伤组织中以过量表达OsZFP1基因.转基因的拟南芥植株和水稻愈伤组织对盐处理的敏感性都比野生型要高.这一结果表明OsZFP1基因可能编码一种负调控蛋白,它可能抑制某些盐诱导基因的表达.在ABA处理下,转基因拟南芥植株比野生型植株抽苔晚,说明OsZFP1基因的作用可能受ABA调节.     

玉米DEAD-box RNA解旋酶基因的克隆及分析

DEAD-box RNA解旋酶参与RNA转录、前体mRNA剪切、核糖体发生、核质运输、蛋白质翻译、RNA降解等重要的生命活动.根据本室在S-Mo17Rf3Rf3cDNA芯片研究中,检测到花粉发育后期RNA解旋酶上调表达的结果,应用RACE技术从S-Mo17Rf3Rf3花粉中克隆得到该RNA解旋酶基因全长cDNA,命名为ZmRH2并在GenBank注册登记 (DQ327709).序列分析表明：该cDNA全长1 652bp,从第163 bp开始到1 386bp含有一个开放阅读框,编码407个氨基酸.其编码的蛋白质具有DEAD-box RNA解旋酶特有的9个保守模体,与水稻、拟南芥和豌豆中的DEAD-box RNA解旋酶的氨基酸序列存在着很高的同源性.RT-PCR分析表明,该基因在近等基因系S-Mo17Rf3Rf3和S-Mo17rf3rf3的叶、根、和雌穗中的表达没有差异,但在花丝和花粉中有明显差异.     

水稻含有B-box锌指结构域的OsBBX25蛋白参与植物对非生物胁迫的响应

锌指蛋白在调控植物生长发育和应对逆境过程中发挥着重要作用.为进一步研究锌指类蛋白参与植物非生物胁迫响应的分子机制,对水稻(Oryza sativa)中一个编码含有B-box锌指结构域蛋白的OsBBX25基因进行了功能分析.OsBBX25受盐、干旱和ABA诱导表达.异源表达OsBBX25的转基因拟南芥(Arabidopsis thaliana)与野生型相比对盐和干旱的耐受性增强,且盐胁迫条件下转基因植物中KIN1、RD29A和COR15的表达上调,干旱胁迫下KIN1、RD29A和RD22的表达上调.外源施加ABA时,转基因植物的萌发率与野生型之间没有明显差异.OsBBX25可能作为转录调控的辅助因子调节胁迫应答相关基因的表达,进而参与植物对非生物胁迫的响应.     

陆地棉GhPYR1基因的克隆和功能分析

植物激素脱落酸(Abscisic acid,ABA)在植物应对干旱、盐碱等逆境胁迫以及植物种子萌发、根伸长、芽休眠等阶段发挥重要作用。PYR/PYL/RCAR蛋白家族是ABA受体,与ABA结合后能够启动ABA信号传导通路,诱导ABA应答基因的表达。利用电子克隆和RT-PCR技术从陆地棉中克隆了Gh PYR1基因,其编码的Gh PYR1蛋白与拟南芥中At PYR1蛋白相似度为73%。将Gh PYR1蛋白序列与拟南芥14个PYR/PYL/RCAR家族成员蛋白序列进行比对并构建进化树,发现它与拟南芥PYR/PYL/RCAR蛋白亚家族III亲缘关系最近。过表达Gh PYR1基因的T3代拟南芥在外源ABA处理下,其种子萌发和初期根生长均滞后于野生型,表现出对ABA更加敏感;高盐和干旱胁迫对转基因种子的萌发抑制更强烈,但苗期胁迫处理下转基因拟南芥的长势却明显优于野生型;同时在外源ABA诱导条件下ABA应答基因RD29A、RAB18的表达量较野生型有明显提高。以上结果说明Gh PYR1基因编码的蛋白是ABA的受体,过表达该基因能够提高植物对ABA的敏感性和增强应对逆境胁迫的能力。     

vasa基因研究进展

DEAD-box家族基因编码一类ATP依赖的RNA解旋酶。经系统进化分析可将该家族蛋白分为VASA、PL10和p68三个亚家族。其中,vasa基因最先在果蝇(Drosophila melanogaster)中被发现,在许多动物中都已经克隆得到其同源基因,研究显示,vasa基因在生殖细胞系中特异性表达,在许多生物中为生殖细胞形成和配子发生所需。有趣的是在果蝇中VASA蛋白是生殖质的组成部分,而在斑马鱼(Danio rerio)中vasa mRNA才是生殖质的组成部分。本文主要综述了vasa基因及其蛋白的结构、功能、表达和作为原生殖细胞分子标记物的应用等方面的内容,并展望了其研究前景。     

番茄SlMYBL基因的克隆、生物信息学及表达特性分析

MYB转录因子构成了植物体内最大的转录因子家族之一,参与植物生长发育和代谢,是一种重要的转录因子。根据NCBI数据库登录的番茄序列,通过RT-PCR方法从野生型番茄AC++中克隆得到全长为1 630 bp基因片段,生物信息学分析表明,该基因ORF为1 245 bp,编码414个氨基酸,该编码蛋白有保守的DNA结合域:MYB-like、C-末端和多个磷酸化位点,主要定位于线粒体基质和细胞质中,根据其结构域该基因命名为SlMYBL。二级结构预测显示SlMYBL蛋白含有26.33%的α螺旋,65.46%的无规则卷曲和6.28%的延伸链及1.93%的β折叠。表达模式分析表明,SlMYBL在成熟叶、茎及萼片中表达量较高。荧光定量PCR分析表明SlMYBL基因表达量受外源激素IAA、ABA等的诱导。非生物胁迫结果表明,在高温、低温、伤害和盐处理中该基因表达也受到不同程度的诱导。该实验结果为进一步研究SlMYBL基因在番茄生长发育过程中的功能奠定了基础。     

番茄转录辅激活子基因LeMBF1在非生物胁迫中的抗性分析

为了研究番茄转录辅激活子基因LeMBF1在非生物胁迫中的作用,以LeMBF1超表达转基因番茄和野生型番茄组培苗为材料,对其进行高温、机械损伤、低温、H2O2、干旱和ABA等非生物胁迫处理.半定量RT-PCR分析表明,LeMBF1在根、幼叶、成熟叶片、花和果实的不同时期均有表达,但在幼叶中表达量最高,成熟叶片和果实中表达量较低.高温处理后,下游防卫反应基因HSP90、Apx2、Zat、PR1在超表达番茄植株中的表达量明显高于野生型番茄植株,并且LeMBF1超表达番茄植株存活率较高.机械损伤可以明显的诱导LeMBF1基因表达;H2O2、干旱、低温、和ABA处理后,对下游防卫基因的表达量有不同程度的影响.以上结果表明LeMBF1基因参与了多种植物非生物胁迫防御反应,并对提高番茄的抗性有一定的作用.     

玉米液泡膜焦磷酸酶基因ZmVPP1的克隆及逆境下的表达分析

采用同源克隆的方法在玉米中得到一个与拟南芥耐盐基因AVP1类似的基因.BLAST分析表明,该基因编码蛋白属于质子泵焦磷酸酶家族(H_PPase superfamily)中的Ⅰ型VPP,将其命名为ZmVPP1.ZmVPP1包舍一个2301bp的开放阅读框,编码766个氨基酸残基.蛋白比对结果表明,该蛋白在不同植物中相当保守.实时荧光定量PCR检测发现,ZmVPP1基因在成熟叶片中高丰度表达,在生殖器官中表达量较少.脱水、高盐、低温等逆境胁迫条件和ABA处理下的表达分析表明,ZmVPP1基因受逆境的诱导表达,属于不依赖于ABA的途径.由此推断,ZmVPP1可能参与玉米对Na+的隔离,从而起到耐盐的作用.     

蕨类植物问荆DEAD-box RNA解旋酶基因的克隆与分析

DEAD-box RNA解旋酶参与RNA多方面的代谢,在植物生长发育和逆境反应中起重要作用。本研究从蕨类植物问荆（Equisetum arvense）中克隆到一条DEAD-box RNA解旋酶c DNA全长序列,命名为EaRH1,并在Gen Bank注册登记（KJ734026）。序列分析显示：该c DNA全长3 230 bp,包含一个从487 bp到2 799 bp编码770个氨基酸的开放读码框,其对应的蛋白序列包含9个保守模块结构。EaRH1与其它物种DEAD-box RNA解旋酶蛋白序列比对结果显示：模块Ⅰa、Ⅱ和Ⅲ序列几乎完全相同,模块Q、Ⅰ和Ⅳ序列存在一些差异。EaRH1与江南卷柏（Selaginella moellendorffii）基因组一条假定序列相似度高达69%,其中相似度最高的区域集中在包含9个保守模块的结构域。系统进化树分析显示：EaRH1与拟南芥（Arabidopsis thaliana）DEAD-box RNA解旋酶At3g22320在氨基酸序列上有相对较高的同源性。序列结构比较和进化分析可推测出EaRH1可能参与植物体生长发育、miRNA生物合成、与RNA结合蛋白的相互作用和非生物胁迫应答。本文的研究为探索问荆DEAD-box RNA解旋酶的进一步功能提供参考。     

转CkLEA4基因拟南芥种子萌发期的抗逆性分析

该研究在实验室前期研究的基础上,将受脱水、盐胁迫和ABA诱导的柠条锦鸡儿CkLEA4基因转入野生型拟南芥,并利用实时荧光定量PCR从8株纯合体中筛选出3个表达量不同的株系,比较野生型和转CkLEA4基因过表达拟南芥种子在不同胁迫处理下的萌发率,以探讨CkLEA4基因在植物抵抗逆境胁迫中的功能。结果发现:(1)在不同浓度NaCl、甘露醇及ABA处理下,转CkLEA4基因过表达拟南芥种子的萌发率均高于野生型,随着NaCl、甘露醇及ABA浓度增加,各株系萌发率均降低,但野生型的萌发率下降幅度均高于3个过表达株系,并且在200mmol/L NaCl和400mmol/L甘露醇处理下,过表达株系子叶绿化率均显著高于野生型。(2)在低浓度ABA处理下,CkLEA4过表达植株子叶的绿化率也高于野生型。研究表明,柠条锦鸡儿CkLEA4基因提高了拟南芥种子萌发阶段对盐、ABA及渗透胁迫的耐受性。     

木薯MeHB2转录因子的克隆与表达分析

该研究以木薯(Manihot esculenta Crantz)Ku50为实验材料,采用RT-PCR方法从叶片中克隆了1个HD-Zip基因MeHB2。MeHB2基因含有882bp的开放阅读框,编码293个氨基酸。蛋白质保守结构预测显示,MeHB2编码的蛋白含有Homeodomain、Leu zipper和HD-Zip_N等结构域,属于HD-Zip II成员。进化树分析表明,MeHB2与麻疯树、杨树和杞柳中同源基因的亲缘关系较近。实时荧光定量PCR分析表明,低温胁迫、渗透胁迫、ABA和H2O2均可诱导MeHB2基因的表达,而盐胁迫抑制其表达。此外,MeHB2的表达量还受到遮荫胁迫的诱导。研究表明,MeHB2在木薯非生物逆境调控中扮演重要角色。     

水曲柳中MYBL2基因表达特征分析

MYB转录因子家族是植物中最大的转录因子家族之一,参与植物生长、繁殖和代谢的各个时期,能通过多种方式参与植物抗逆生长。该文在水曲柳中克隆FmMYBL2基因,利用生物信息学分析其结构和表达特征,并构建FmMYBL2蛋白的系统进化树。对水曲柳幼苗进行低温胁迫、盐胁迫处理以及激素分子诱导处理(包括ABA、IAA、GA_3、JA、SA)。分别在0、1、3、6、12、24、48 h取样,利用实时荧光定量PCR对上述处理样品中FmMYBL2基因进行定量分析,并分析了FmMYBL2的时空表达特征。结果表明:(1)克隆得到的FmMYBL2基因全长为762 bp,编码253个氨基酸。(2) FmMYBL2蛋白是亲水性蛋白,氨基酸序列比对表明其与棉花同源关系较近。(3)荧光定量分析表明,FmMYBL2基因响应低温胁迫和盐胁迫,同时ABA、IAA、GA_3、JA、SA共同调控该基因表达。(4)在低温处理1 h、盐胁迫48 h时,虽然FmMYBL2基因表达量最高,激素诱导后表达量持续波动,但其能在短时间内迅速响应。(5) FmMYBL2基因在根、芽、花、种子中均有表达,雄花中的表达量最高。该研究结果为深入研究MYBL2基因功能和水曲柳抗逆生长的调控奠定基础。     

小麦TaTrxh9基因的序列特征及其对渗透胁迫的响应

硫氧还蛋白是一类广泛存在于植物中的低分子量氧化还原蛋白,在植物生长发育调控和逆境响应过程中发挥重要的调控功能。以小麦(Triticum aestivum L.)品种‘中国春’和‘洛旱2号’为材料,采用RT-RCR方法克隆了小麦硫氧还蛋白基因TaTrxh9,通过生物信息学方法分析了其染色体定位及序列特征,并利用qRT-PCR技术分析了该基因对渗透胁迫的响应模式。结果显示:(1)成功克隆到小麦TaTrxh9基因,序列分析发现TaTrxh9基因位于第1染色体群的短臂上,并将其3个部分同源基因命名为TaTrxh9-1AS、TaTrxh9-1BS和TaTrxh9-1DS。(2)TaTrxh9基因包含4个内含子,且在内含子区域3个部分同源基因间序列差异较大;3个部分同源基因的编码区序列一致性在98%以上,均编码131个氨基酸,且蛋白序列完全相同;TaTrxh9蛋白包含1个Trx-family保守域和CXXC氧化还原活性位点,三维结构预测分析显示该蛋白可形成典型的硫氧还蛋白空间结构,包括由4个α螺旋组成的外围框架和由5个反向平行的β折叠组成的中心轴。(3)qRT-PCR分析显示,TaTrxh9基因受干旱胁迫诱导在叶片中下调表达,而在根系中呈先上调后下调的表达模式;盐胁迫过程中,TaTrxh9基因在叶片中无显著响应,在根系中也仅出现短暂的诱导表达现象;在ABA处理过程中,TaTrxh9基因表达模式与其对干旱胁迫的响应模式类似。研究推测,TaTrxh9基因对干旱胁迫的响应过程可能与ABA介导的基因表达调控有关。     

水稻泛素连接酶基因OsRING6的克隆及表达分析

RING(Really Interesting New Gene)型泛素连接酶在水稻生长、发育、生物和非生物胁迫中发挥着重要作用。根据水稻基因组信息,利用RT-PCR技术从粳稻日本晴中克隆了OsRING6基因的CDS序列。该基因的全长c DNA为1355 bp,包括长度为918 bp的CDS,编码一个含305个氨基酸的蛋白,预测该蛋白的分子量和等电点分别为32.96 k D和3.49,与籼稻(CT832014)和短花药野生稻(XM_006659599)中同源蛋白的序列相似性最高,分别为97%和83%。IPTG诱导表达的MBPOsRING6重组蛋白的表观分子量约为100 k D,比理论值76 k D大。启动子元件分析表明,其含有与干旱胁迫、光反应、ABA和GA信号传导相关的调控元件。Real-time PCR结果表明,该基因在水稻根、茎、叶、叶鞘、花和种子中都有表达,在萌发后4 d的种子中表达量最高,花中的表达量最低,且该基因的表达受到盐和ABA的诱导及PEG的抑制。OsRING6基因的克隆为水稻抗逆分子育种和功能分析提供了优质基因资源。     

玉米蛋白质二硫键异构酶（PDI）基因的特征和表达

蛋白质二硫键异构酶（PDI）对蛋白的折叠和二硫键的形成起重要的作用.此外,PDI还执行许多其他的生物功能,是1个多功能酶. 本文通过研究玉米中1个PDI基因的特征和表达,探讨它的功能作用. 玉米中的PDI基因编码513个氨基酸.同源分析表明,该基因和水稻、小麦的PDI基因聚为一类,有很高的蛋白相似性.蛋白结构分析表明,该基因具有明显的PDI基因的结构特点,包括硫氧还蛋白活性位点(CGHC)以及内质网定位信号(KDEL).Northern杂交分析显示,该基因在发育种子的表达量高,同时受干旱、冷、ABA和盐等逆境胁迫诱导表达.PDI与GFP融合表达研究基因的亚细胞定位,表明该基因定位在除细胞膜外的细胞质和细胞器上.     

DEAD-box解旋酶在植物非生物胁迫响应中的功能研究进展

解旋酶广泛存在于从病毒到人类几乎所有已知的原核和真核生物体中,它们能利用NTP水解获得能量促进双链DNA/RNA解链。DEAD-box解旋酶是最大的解旋酶家族,在DNA复制、修复、重组、转录、核糖体发生和翻译起始等几乎所有涉及DNA/RNA代谢的细胞过程中均发挥重要作用。近年研究表明,DEAD-box解旋酶除具有持家基因功能外,还广泛参与植物生长发育及胁迫响应过程。目前,由解旋酶介导的胁迫应答具体机制依然不清晰。现重点介绍近年来高等植物DEAD-box解旋酶在非生物胁迫响应中的功能研究进展,同时探讨解旋酶参与胁迫应答的可能机制。     

硬骨鱼中vasa基因的研究

vasa基因编码一个DEAD-box家族的ATP依赖性RNA解旋酶,最早在果蝇中发现.在绝大多数的脊椎动物和非脊椎动物中,vasa基因的杂交信号仅在生殖细胞系中特异性表达,因此它可以作为一种分子标签,广泛用于性腺发生、配子发生、原生殖细胞(primordial germ cells,PGCs)的起源、迁移、分化等方面的研究.综述了国内外有关硬骨鱼类vasa基因结构,表达与功能等方面的研究报道,并对其应用前景作了展望.