3月份生物各科实验准备

植物学衣藻和水绵的采集、培养和装片制作时值春末夏初时节,气温约10-20℃左右,在有机物丰富、无污染、水流平缓的水池或水沟中,采集发绿的水样,带回在显微镜下观察,水中常含有衣藻。如果水样中衣藻数量较多,可以直接用于实验观察。     

衣藻、水绵的采集和观察

要观察衣藻和水绵的结构特征,以及水绵接合生殖的过程,首先必须采集标本。淡水藻类繁多。采集时,要根据不同藻类植物、不同环境条件和生态特点,准确地采集所需要的标本。衣藻喜生于有机质较少的静水里,如果是在有机质较丰富的水体中采集标本,大多是眼虫而不是衣藻。水绵则常生活在酸性、缺钙的水中,如酸性的红壤土地带的积水、沼泽及水库下游积水处。     

衣藻的藻种保存`扩大培养和观察

衣藻属(Chlamydomonas)是常见的淡水绿藻。在生长季节里,衣藻常在营养特别是氮、磷较丰富的坑塘中有时长成纯群,但在池水或缓流中则常与其他藻类等混生,不易采集。在非生长季很难找到它们。这给教学和科研带来许多困难。几年来,我们对衣藻的藻种保存、扩大培养进行观察试验,总结出一些经验,现介绍如下:     

中国团藻目研究（I）

为了配合中国孢子植物志《团藻目》编志的需要,作者到广西壮族自治区、内蒙古自治区、湖北省等地采集标本进行分类研究。文中报道了团藻目6个属的4个新种,1个新变种和9个中国新记录,其中拟衣藻属Chloromonas和朴罗藻属Provasoliella为我国新记录属,武汉朴罗藻、嗜碱衣藻、多粒衣藻、广西拟衣藻为新种,星状四鞭藻广西变种为新变种。     

中国团藻目研究(Ⅰ)

为了配合中国孢子植物志《团藻目》编志的需要 ,作者到广西壮族自治区、内蒙古自治区、湖北省等地采集标本进行分类研究。文中报道了团藻目 6个属的 4个新种 ,1个新变种和 9个中国新记录 ,其中拟衣藻属Chloromonas和朴罗藻属 Provasoliella为我国新记录属 ,武汉朴罗藻、嗜碱衣藻、多粒衣藻、广西拟衣藻为新种 ,星状四鞭藻广西变种为新变种。     

转基因衣藻lba及对照藻产氢培养条件的优化

通过对莱茵衣藻849及其转基因衣藻lba进行光照强度、细胞浓度和培养基中硫酸盐含量三因素三水平的正交实验,确定了两个藻种的最佳产氢条件,同时对转基因藻和849产氢培养条件下的光合放氧速率和pH进行了检测。实验结果表明,在25 ℃下,莱茵衣藻849和转基因衣藻lba的最佳产氢条件都为光照强度 60μmol/(m²·s),细胞浓度为叶绿素含量12.5μg/ml,培养基中硫酸盐含量0μmol/L。莱茵衣藻849和转基因衣藻lba的最高氢气产量分别达到了349μl/mg chlorophyll 和634μl/mg chlorophyll。在产氢条件下,转基因藻lba的净光合放氧速率比849低。结果为利用豆血红蛋白特性通过基因工程手段提高莱茵衣藻产氢量提供基础实验数据。     

介绍一种培养衣藻的新方法

最近,我用琼脂培养基培养衣藻效果很好,其配方如下:硝酸钾1克、氯化钾0.25克、硫酸镁0.25克、磷酸氢二钾0.25克、1％的硫酸亚铁0.2毫升、水1000毫升。以上各盐类溶于1000毫升水中,再加10克琼脂,加热溶解后,倒入试管中(占1/4)高压(1.5kg/cm)灭菌40分钟,取出摆成斜面,自然冷却后在无菌条件下,用接种环将衣藻接种在斜     

中国衣藻属研究(Ⅰ)

报道了衣藻属(Chlamydomonas)的9个新种:近条纹衣藻、具孔衣藻、顶角衣藻、近环形衣藻、具粒衣藻、近具喙衣藻、不整衣藻、疣突衣藻、倒卵形衣藻,以及4个新变种:阿美衣藻大型变种、似博泡衣藻大型变种、侏儒衣藻陈氏变种和锥形衣藻胶被变种。     

莱茵衣藻纤毛内运送蛋白IFT27的原核表达、纯化及多克隆抗体制备

[目的]制备莱茵衣藻纤毛内运送蛋白IFT27的多克隆抗体。[方法]利用莱茵衣藻ift27基因的cDNA序列构建了原核表达载体p ET28a-ift27和p MAL-C2X-ift27,转入大肠杆菌BL21(DE3)诱导表达,获得了6×His/MBPIFT27两种重组融合蛋白。将纯化后的MBP-IFT27融合蛋白免疫新西兰大白兔,5次后采集抗血清,间接ELISA法测定效价,并对抗血清依次经protein A和抗原抗体两步纯化后使用Western Blot和免疫荧光对抗体特异性进行检测。[结果]MBP/6×His-IFT27融合蛋白表达后分子量分别为27 k Da和67 k Da。ELISA测定其效价为1∶256 000,Western Blot检测可特异性识别莱茵衣藻中的IFT27蛋白,免疫荧光结果显示可检测到纤毛中的IFT27蛋白。[结论]制备出特异性抗莱茵衣藻IFT27的多克隆抗体,效价为1∶256 000,Western Blot可特异性检测到莱茵衣藻中IFT27蛋白的目的条带,免疫荧光可定位IFT27在细胞内分布。     

小球藻和莱茵衣藻原生质体的电转化研究

以小球藻及莱茵衣藻原生质体为受体细胞,利用电击法将质粒p CAMBIA1301转入小球藻和莱茵衣藻,摸索电击转化条件并进行分子检测。结果表明:两类藻都对潮霉素敏感,小球藻及莱茵衣藻分别在含25 mg/L和100 mg/L潮霉素的固体培养基上的生长被完全抑制;小球藻和莱茵衣藻原生质体电击转化的最佳电击场强分别为0.8 k V/cm和0.6 k V/cm,最佳脉冲时间均为10 ms;制备原生质体和通过2-脱氧-D-葡萄糖处理可明显提高转化效率;分子检测说明GUS报告基因成功转入两种藻并可稳定遗传。     

基因编辑技术在莱茵衣藻中的应用进展

基因编辑技术已经成为功能基因组学和作物分子育种精准且有力的工具。莱茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtii,简称衣藻)是光合作用、黑暗异养代谢、厌氧代谢和生物制氢、营养和能量代谢等研究领域的重要模式生物。近20年来,基因编辑技术,如锌指核酸酶(ZFNs)、转录激活物样效应物核酸酶(TALENs)、CRISPR/Cas9和CRISPR/Cpf1等的发展,更加推动了以衣藻为模式生物的研究。现对衣藻中的核基因组靶向基因编辑技术的应用及最新研究进展等进行总结,以期为衣藻相关领域的研究提供参考。     

饵料对河蟹溞状幼体变态发育的影响

报道饵料对河蟹状幼体 ( Z1～ Z3)变态的影响。结果表明 :梅尼小环藻是 Z1的适口饵料 ,适量投喂浓度为 80万个 /ml至 1 0 0万个 /ml;投喂衣藻或小环藻与衣藻的等浓度混合饵料都不能使 Z1顺利变态为 Z2 。2 0个 /ml褶皱臂尾轮虫密度是适于 Z2 的饵料密度 ,轮虫密度低于 5个 /ml或高于 40个 /ml都对 Z2 的变态有不良影响。另外 ,投喂 60万个 /ml小环藻加 2 0个 /ml轮虫混合饵料对 Z2 变态发育更为有利 ;而用 2 0万个 /ml衣藻加 2 0个 /ml轮虫投喂 Z2 ,却使 Z2 的变态率明显降低。 30个 /ml轮虫密度是适于 Z3的饵料密度 ,轮虫密度低于 2 0个 /ml或高于 40个 /ml都会对 Z3变态产生不良影响。     

衣藻鞭毛永久装片的简便方法

鞭毛是衣藻在水中的运动器官.衣藻的鞭毛很纤细,不经染色,难以在普通显微镜下观察.观察衣藻的鞭毛,通常用鲁哥氏液染色,虽然这种方法很简便,但用此法染色后,经过脱水,鞭毛的颜色就会复失.为了制成永久装片长期观察,我们认为用以下方法制作手续比较简单,鞭毛的染色效果也较好.具体做法是:     

谷氨酸废液培养莱茵衣藻的产氢研究

通过在一般培养基中添加尿素、谷氨酸、葡萄糖等有机物,考察了菜茵衣藻混合营养培养的产氢效果。结果表明,含尿素混合营养培养菜茵衣藻产氢是含铵氮的培养基培养的6倍,无硫含尿素的混合营养培养具有最佳的产氢效果,是有硫含铵氮的培养基的10倍。谷氨酸及葡萄糖的添加对其生长和产氢也有促进作用,对菜茵衣藻生长和产氢促进作用的尿素的最佳添加量为0．25g/L,谷氨酸的最佳添加量为0．7g/L,葡萄糖的添加量为0．2g/L。     

转衣藻染色质烟草细胞核的变化及衣藻核基因的表达

应用反复冻融法以衣藻原生质体为材料制备衣藻染色质,应用显微操作技术准确将衣藻染色质转移到烟草叶片外植体中,进行连续培养并镜检观察。结果表明,经染色质转移处理的烟草叶片外植体、衣藻细胞核与烟草细胞核均发生形态上的变化。同时烟草叶片外植体正常发芽并获得再生苗,经RT-PCR检测发现,有衣藻核基因(rbcs2)的表达。     

小G蛋白BBS3b的原核表达纯化及其多克隆抗体制备

[目的]制备莱茵衣藻小G蛋白BBS3b的多克隆抗体。[方法]利用莱茵衣藻bbs3b基因的c DNA序列分别构建了带有GST和6×His标签的原核表达载体p GEX-2T-BBS3b和p ET-28a(+)-BBS3b并转化至大肠杆菌BL21(DE3)诱导表达,以12%SDS-PAGE鉴定。用纯化的GST-BBS3b融合蛋白免疫新西兰大白兔,采集第4次免疫后血液并分离血清,利用间接ELISA法进行效价测定,并将抗血清依次经过Protein A纯化和硝酸纤维素膜纯化,用Western Blotting检测抗体特异性。[结果]GST-BBS3b和6×His-BBS3b融合蛋白的分子量分别为46、20 k Da。用ELISA的方法测定抗血清效价为512 000,Western Blotting检测结果显示制备的多克隆抗体能够特异性识别莱茵衣藻BBS3b蛋白。[结论]制备的多克隆抗体效价为512 000,能够特异性识别莱茵衣藻中BBS3b蛋白,为利用莱茵衣藻作为模式生物进行BBS3b在纤毛信号传导中的作用机理研究奠定了基础。     

来源于Pyrococcus furiosus的耐高温α-淀粉酶基因在衣藻叶绿体中的表达

来源于Pyrococcusfuriosus的耐高温α-淀粉酶是一种重要的酒精工业用酶,在植物中表达耐高温α-淀粉酶可以大大降低用植物秸秆生产酒精的成本。选择衣藻叶绿体基因组同源片段clpP-trnL-petB-chlL-rpl23-rpl2和壮观霉素抗性基因,构建了来源于Pyrococcusfuriosus的耐高温α-淀粉酶基因的衣藻叶绿体表达载体p64A。通过基因枪将其导入衣藻叶绿体中,经壮观霉素抗性(100mg/L)筛选,获得了9个抗性衣藻转化子。转化子经过抗性继代筛选后,经PCR、Southernblot检测分析及暗培养,证实耐高温α-淀粉酶基因已整合到衣藻叶绿体基因组中并得到表达。酶活性检测表明,转基因衣藻表达产物具有耐高温α-淀粉酶活性,每克鲜重衣藻最高达77.5u。实验结果证明在植物叶绿体中表达工业酶制剂是可行的。     

转基因衣藻对重金属的抗性及对镉离子的富集

目的：研究了转基因衣藻对不同重金属离子的抗性和对Cd^2＋的富集行为。方法：将MT-like基因在莱茵衣藻细胞中的表达后通过摇瓶实验测试其对重金属离子的抗性和富集能力。结果：转基因衣藻对Pb^2＋、Zn^2＋和Cd^2＋三种重金属离子的抗性得到明显增强,其中以对Zn^2＋的抗性增强最为显著。转基因藻对Cd^2＋的富集能力经MT-like蛋白表达后较野生藻细胞有较大增加,最大达到144．48μmol／g,为野生藻的8．3倍。结论：转基因衣藻对重金属离子的抗性和对Cd^2＋的富集能力较野生衣藻有较大提高。     

小G蛋白BBS3b的原核表达纯化及其多克隆抗体制备北大核心

[目的]制备莱茵衣藻小G蛋白BBS3b的多克隆抗体。[方法]利用莱茵衣藻bbs3b基因的c DNA序列分别构建了带有GST和6×His标签的原核表达载体p GEX-2T-BBS3b和p ET-28a(+)-BBS3b并转化至大肠杆菌BL21(DE3)诱导表达,以12%SDS-PAGE鉴定。用纯化的GST-BBS3b融合蛋白免疫新西兰大白兔,采集第4次免疫后血液并分离血清,利用间接ELISA法进行效价测定,并将抗血清依次经过Protein A纯化和硝酸纤维素膜纯化,用Western Blotting检测抗体特异性。[结果]GST-BBS3b和6×His-BBS3b融合蛋白的分子量分别为46、20 k Da。用ELISA的方法测定抗血清效价为512 000,Western Blotting检测结果显示制备的多克隆抗体能够特异性识别莱茵衣藻BBS3b蛋白。[结论]制备的多克隆抗体效价为512 000,能够特异性识别莱茵衣藻中BBS3b蛋白,为利用莱茵衣藻作为模式生物进行BBS3b在纤毛信号传导中的作用机理研究奠定了基础。     

几种高等水生植物的克藻效应

研究了水花生、水浮莲、满江红、紫萍、浮萍和西洋菜对雷氏衣藻的相生相克关系,并和水葫芦的作用进行了比较。试验指出前五种水生植物对雷氏衣藻表现了克制作用,但它们的克藻效能不如水葫芦强。西洋菜没有克制作用,甚至稍有促进效应。从水花生、水浮莲、水葫芦的种植水中得到的分泌物粗提物,都显示了对雷氏衣藻的抑制效应,进一步证实了有相生相克关系的存在。试验结果说明高等水生植物对藻类的克制作用似有一定的普遍性,在水生生态系统的形成和演替过程中可能起着重要的作用。