bFGF反义寡核苷酸增强鼠黑色素瘤B16细胞化疗药物敏感性研究

目的:研究bFGF反义硫代寡核苷酸增强肿瘤细胞对化疗药物敏感性作用。方法:设计、合成bFGF寡核苷酸,用聚乙烯亚胺(polyemyleneimine,PEI)介导bFGF反义硫代寡核苷酸转染入黑色素瘤B16细胞,MTT法检测bFGF反义硫代寡核苷酸及其与化疗药物联合处理后的细胞增殖率;半定量RT-PCR测定bFGF反义硫代寡核苷酸转染后细胞中bFGF mRNA水平;流式细胞仪分析bFGF反义硫代寡核苷酸诱导的细胞凋亡。结果:bFGF反义硫代寡核苷酸对B16细胞增殖的抑制率为64.8%,且呈剂量依赖效应。B16细胞中bFGF mRNA被bFGF反义硫代寡核苷酸显著降低,为对照细胞的57.9%,且bFGF反义硫代寡核苷酸诱导B16细胞凋亡,凋亡率为41.8%。bFGF反义硫代寡核苷酸转染能显著增强B16细胞对阿霉素、5-氟脲嘧啶及顺铂的敏感性,非特异性硫代寡核苷酸不影响阿霉素、5-氟脲嘧啶及顺铂抑制B16细胞增殖。结论:bFGF反义硫代寡核苷酸显著增强B16细胞的化疗敏感性,表明其可协同化疗药物用于治疗肿瘤。     

反义核酸的骨架修饰及其应用

反义核酸的发展经历了反义寡核苷酸,混合骨架寡核苷酸和多肽核酸等几个阶段。这３种不同类型的反义核酸均能与ＤＮＡ或ＲＮＡ结合,阻断目的基因的表达。３种反义核酸的结构有较大差异,各自的性质和反义作用机理也不尽相同。尽管作用机制还不十分明确,反义核酸已广泛应用于生物学和医学等领域,作为反义药物用于治疗癌症等疾病,或作为试剂研究生物大分子的功能。     

吗啉反义寡核苷酸在基因功能研究中的应用

吗啉反义寡核苷酸属于第三代反义寡核苷酸,主要通过阻断mRNA的剪接过程来抑制目的基因的功能。吗啉反义寡核苷酸技术现已广泛应用于发育过程中基因功能的研究;鉴于吗啉反义寡核苷酸能与病毒特异mRNA结合,形成的双链物可有效阻断病毒RNA的转录,从而抑制病毒的复制,所以该技术已应用于医学研究,如治疗病毒感染、癌症、肌营养不良症和早老综合症等疾病。主要阐述了吗啉反义寡核苷酸的结构特点、作用机制、与其它反义技术的比较,以及该技术的应用与展望。     

Fas基因mRNA反义靶点筛选和体外验证

应用PARASS(poly-A anchored RNA accessible sites screening) 技术筛选Fas基因mRNA 获得3个潜在反义作用靶点,靶点1、2、3分别位于Fas基因297nt-317nt、619nt-639nt和662nt-682nt。设计了对应靶点的反义寡核苷酸A1、A2、A3,和10-23型DNAzyme D1、D2和D3。将反义寡核苷酸和Fas基因RNA结合再加入RNase H进行反应,10-23型DNAzyme则直接与Fas基因RNA作用,结果表明：3个靶点的反义寡核苷酸组及DNAzyme均能降解Fas基因RNA,为有效靶点,其靶点反应优势次序为靶点3>靶点1>靶点2;而非靶点对照组和有效靶点突变了2个碱基的对照组均没有反应。靶点2和靶点3与ISIS公司经过多次实验筛选到的Fas反义作用靶点位置基本相同,表明PARASS技术的有效性和可靠性。获得的有效反义寡核苷酸和DNAzyme为后续研究打下基础。     

反义寡核苷酸研究进展

反义寡核苷酸可以通过与ｍＲＮＡ相互作用调节的基因表达，但是其作用的强弱受多种因素的影响。反义ＲＮＡ和反义ＤＮＡ在调节基因的表达方面各有优缺点；采取适当的方法增强反义寡核苷酸的摄取及促进其释放可以大大提高它们的作用效率；反义寡核苷酸在活体内主要经肾脏和肝脏代谢，有一定特异性和非特异性副作用。根据不同的目的，选择适当的反义寡核苷酸用于研究或疾病的治疗与预防，具有很重要的理论意义和现实意义。     

肽缀合反义寡核苷酸的合成和性能

反义寡核苷酸可作为基因表达的抑制剂和潜在的治疗药物,但多种类型的寡核苷酸为聚阴离子化合物,难以跨过细胞膜.已知包括融合肽、信号肽在内的多种生物活性多肽具有跨膜与核定位能力.讨论了反义寡核苷酸-肽缀合物的合成和生物活性.     

运用反义寡核苷酸研究非洲爪蛙母源基因的功能

母源基因在动物胚胎早期发育中的功能是发育生物学研究领域的难点之一。在过去二十多年里,反义寡核苷酸介导的反向遗传学技术在多种模式生物中均得到广泛应用,在非洲爪蛙母源基因功能分析中,反义寡核苷酸介导的mRNA降解和受体转移(host transfer)技术的联合使用,确立了以转录因子VegT和Wnt信号分子家族成员Wnt11为代表的母源基因在非洲爪蛙胚胎早期图式建成中的重要功能。目前,非洲爪蛙仍然是研究脊椎动物母源基因功能最为方便的模式系统,因此,该文将在简要叙述VegT和Wnt11调控胚胎三胚层的决定与分化和背方组织者中心诱导过程中的作用的基础上,较为详细地介绍反义脱氧寡核苷酸降解母源mRNA的原理和其与受体转移技术结合使用,分析非洲爪蛙母源基因功能的详细技术流程。     

Ⅰ组mGluRs反义寡核苷酸抗谷氨酸对小鼠大脑皮层神经元的兴奋毒作用

目的研究Ⅰ组代谢型谷氨酸受体(mGluRs)反义寡核苷酸对谷氨酸钠(Glu)引起的小鼠大脑皮层神经元损伤的保护作用.方法以细胞乳酸脱氢酶(LDH)漏出、光镜下细胞形态变化为指标,观察培养液中加入Glu引起的神经元损伤及mGluRl反义寡核苷酸或mGluR5反义寡核苷酸的保护作用;用免疫细胞化学检测神经元mGlulα仪和mGluR5表达.结果实验显示0.1 mmol·L-1的谷氨酸钠可明显造成神经元损伤,使LDH漏出增加(P＜0.01),mGluRl反义寡核苷酸或mGluR5反义寡核苷酸6 μmol·L-1和8μmol·L-1可明显拮抗Glu引起的神经元损伤,使LDH漏出显著减少(P＜0.01);免疫组化实验证实体外培养神经元mGluRlα和mGluR5阳性表达.结论mGluRl反义寡核苷酸和mGluR5反义寡核苷酸可对抗Glu引起的皮层神经元损伤.     

I组mGluRs反义寡核苷酸抗谷氨酸对小鼠大脑皮层神经元的兴奋毒作用

目的:研究I组代谢型谷氨酸受体(mGluRs)反义寡核苷酸对谷氨酸钠(Glu)引起的小鼠大脑皮层神经元损伤的保护作用。方法:以细胞乳酸脱氢酶(LDH)漏出、光镜下细胞形态变化为指标,观察培养液中加入Glu引起的神经元损伤及mGluRl反义寡核苷酸或mGluR5反义寡核苷酸的保护作用;用免疫细胞化学检测神经元mGlulα仪和mGluR5表达。结果:实验显示0.1mmol.L-1的谷氨酸钠可明显造成神经元损伤,使LDH漏出增加(P<0.01),mGluRl反义寡核苷酸或mGluR5反义寡核苷酸6μmol.L-1和8μmol.L-1可明显拮抗Glu引起的神经元损伤,使LDH漏出显著减少(P<0.01);免疫组化实验证实体外培养神经元mGluRlα和mGluR5阳性表达。结论:mGluRl反义寡核苷酸和mGluR5反义寡核苷酸可对抗Glu引起的皮层神经元损伤。     

10-23型DNA酶作为鉴定mRNA靶点有效性的新工具

10-23DNA酶是能主动切割mRNA的一类反义寡核苷酸.利用10-23DNA酶的直接切割作用验证mRNA结构靶点的有效性.对筛选的绿色荧光蛋白(GFP)基因mRNA的4个靶点平行设计了4条反义寡核苷酸和4条10-23DNA酶,对照组反义寡核苷酸将最佳靶点——靶点2的反义寡核苷酸突变2个碱基,对照组10-23DNA酶将靶点2的10-23DNA酶结合臂中央突变2个碱基.体外4条10-23DNA酶切割mRNA的结果和相应的4条反义寡核苷酸依赖的RNaseH降解结果完全相似,细胞内4条10-23DNA酶对绿色荧光蛋白的表达抑制作用与相应的4条反义寡核苷酸相似,表明10-23DNA酶显示的最佳作用靶点同样是最佳作用效果的反义寡核苷酸结合靶.10-23DNA酶可以作为评价mRNA结构靶点有效性的新工具.     

反义寡核苷酸递送方法研究进展

如何将反义寡核苷酸 (AS ODNs)有效递送进入细胞是反义核酸领域面临的一大难题。近年来 ,出现了多种寡核苷酸 (ODNs)的递送方法。在培养细胞中 ,使用的递送方法包括阳离子载体包裹、特异受体的配体导向、ODNs偶联修饰、细胞膜辅助穿透以及利用逆转录病毒载体转染等 ,其应用有效增强了AS ODNs的作用效果 ,大幅度降低了AS ODNs的使用浓度 ;在体内 ,由于临床使用裸露AS ODNs连续给药能达到一定的反义效果 ,而使递送方法的研究和应用尚处于初步尝试和探索之中 ,迄今报道的递送方法有脂类和非脂类两类。     

小分子干扰RNA和反义寡核苷酸技术的比较及其应用意义

研究小分子干扰RNA和反义寡核苷酸技术在不同方面的比较和实际应用意义。尽管小分子干扰RNA,和反义寡核苷酸技术在有些方面的价值不是特别相同,然而从另外一个方面说,还是存在一些关联的地带,包括mRNA的作用靶点等。通过一些医学实验可以很清楚的发现,按照对反义寡核苷酸的研究来分析,小分子干扰RNA的研究也获得了一定程度的成效。本文详细的分析小分子干扰RNA,以及反义寡核苷酸技术相互之间的差异,从长远来看,这对于小分子干扰RNA的研究和医学临床实践的应用,具有很高的价值和意义。从临床实践上来分析,总结反义寡核苷酸技术的相关的经验和结果,从一个层面来说,对于小分子干扰RNA的研讨,价值深远,按照有关医学专家的预测和分析,小分子干扰RNA,在未来一定会在治疗肿瘤上发挥重要的作用。     

受精卵反义寡核苷酸显微注射影响因素的研究

以金鱼受精卵为材料,通过胚胎培养探讨反义寡核苷酸显微注射剂量、受精卵质量、胰酶消化浓度等对受精卵反义寡核苷酸显微注射的影响．研究表明,反义寡核苷酸注射剂量在4．6nL、胰酶消化浓度在0.4％的情况下,选用质量较好的受精卵注射,显微注射效果较好,可为之后的基因功能研究提供材料保障．利用显微注射法导入反义寡核苷酸来研究基因的功能．是研究基因功能的有效途径．     

鞘内注射NOS反义寡核苷酸抑制吗啡戒断大鼠脊髓和脑干NMDA1A受体mRNA表达的影响

运用逆转录－多聚酶联反应（RT－PCR）、鞘内注射和反义技术,研究脊髓水平一氧化氮（NO）对大鼠吗啡戒断反应和脊髓及脑干NMDA1A受体mRNA(NMDA1AR mRNA)表达的影响。结果表明,鞘内注射NOS反义寡核苷酸能明显减轻吗啡戒断反应,且脑型NOS（nNOS）反义寡苷酸的作用强于内皮型NOS(eNOS）反义寡核苷酸,吗啡依赖大鼠脊髓和脑干NMDA1AR mRNA表达增加,纳洛酮催促戒断,使其进一步增加;鞘内注射nNOS反义寡核苷酸,能明显抑制吗啡戒断大鼠脊髓和脑干NMDA1AR mRNA表达的增加;eNOS反义寡核苷酸也可抑制吗戒断大鼠脊髓NMDA1AR mRNA表达的增加,但作用弱于nNOS反义寡核苷酸,对脑干NMDA1AR mRNA表达无明显影响,上述结果提示：脊髓水平NO参与介导吗啡戒断反庆和NMDA受体表达的调控。     

反义寡核苷酸抑制Fas表达用于治疗肝脏疾病

Fas(CD95)是肿瘤坏死因子受体(TNFR)家族成员。在肝脏中,Fas激活的凋亡信号可能对调节肝细胞动态平衡起作用。但在很多炎症情况下,肝脏Fas的表达水平增高。在多种临床肝病发展过程中,肝损伤与Fas表达和细胞凋亡相关。因此通过对Fas表达进行调控,从而控制肝脏中过量和异常的细胞凋亡,是一种极具潜力的保护肝脏的治疗途径。反义寡核苷酸技术已被广泛用于在许多组织中抑制特定基因的表达。用反义寡核苷酸抑制肝脏Fas表达,可以保护动物避免由细胞凋亡而造成的肝损伤以及爆发性肝炎死亡。讨论了Fas在几种肝脏疾病中的病理作用和利用反义寡核苷酸技术阻止和控制这类肝脏疾病的病变。     

mRNA靶点筛选方法研究进展

mRNA靶点筛选问题是反义核酸领域的一个难题。近年来出现了多种筛选mRNA上可接近位点以确定靶位点的方法,包括mRNA实测分析法和计算机模拟分析两大类。其中mRNA实测分析法又包括多种针对自然折叠mRNA的实验分析技术;即基因walk技术,RNaseH作图技术、寡核苷酸微阵列技术,酶作图法确定二级结构技术,核酶导向型随机RNA库位点筛选技术和随机寡核苷酸库结合逆转录位点筛选技术。这些方法在鉴定RNA可接近位点及反义核酸的设计方面均有重要作用。     

青岛文昌鱼LIM类同源模型基因反义寡核苷酸对其胚胎发育的影响

研究了青岛文昌鱼ＬＩＭ类同源框基因Ｂｂｌｉｍ反义寡核苷酸对文昌鱼胚胎发育的影响。根据已克隆的Ｂｂｌｉｍ基因序列,设计并合成了对应于该基因同源框区的两条反义寡核苷酸链,用电脉冲方法将其导入文昌鱼受精卵。结果表明：反义寡核苷酸与随机序列寡核苷酸都不影响胚胎细胞分裂,而反义寡核苷酸能掏胚胎细胞Ｂｂｌｉｍ基因的表达。还发现只存在于导入反义寡核苷酸的幼体中的两种畸形－一是在幼体的腹侧近咽部有一圆形突起的结构     

一种新型反义RNA技术:RNA错折叠

反义RNA技术的发现对现代医疗技术的发展有着重要的作用,常规的反义RNA技术是设计出与靶RNA互补的寡核苷酸,通过它与靶RNA结合来干扰转录或翻译过程,使蛋白质不能被表达出来。目前,一项新的技术——寡核苷酸导向的RNA错折叠将反义RNA技术进一步简化,从另一个角度丰富了反义RNA技术。     

反义寡核苷酸的抗病毒作用及其研究进展

根据靶核酸序列设计的具有一定长度的反义寡核苷酸可与靶核酸特异结合,从而发挥调节基因表达的功能。本文涉及反义寡核苷酸及其类似物的抗病特性、抗病毒机理、反义寡核苷酸的毒性和药物动力学以及未来的发展前景。     

X连锁凋亡抑制蛋白反义寡核苷酸逆转K562细胞及难治性癫痫大鼠对卡马西平和苯妥英钠耐药性

凋亡在癫痫发生机制中起重要作用,但其在难治性癫痫耐药机制中的作用尚不清楚．为研究X连锁凋亡抑制蛋白(X-linked inhibitor of apoptosis protein, XIAP)反义寡核苷酸对K562/Dox(阿霉素诱导)耐药细胞及难治性癫痫大鼠耐药性的影响,首先建立耐药的K562/Dox细胞株,比较XIAP在耐药细胞株和正常K562细胞株的表达情况,观察转染XIAP反义寡核苷酸后,线粒体膜电位变化以及对卡马西平和苯妥英钠耐药性的影响．另外,建立慢性杏仁核点燃癫痫模型,筛选出耐药组和药物敏感组,通过侧脑室注射XIAP反义寡核苷酸,对照组注射生理盐水．观察其对各组大鼠后放电阈值(after discharge threshold,ADT)、后放电时程(after discharge duration,ADD)等电生理指标的影响．结果发现,XIAP在K562/Dox耐药细胞上的表达明显高于正常K562细胞,XIAP反义寡核苷酸转染K562/Dox耐药细胞后,XIAP的表达明显下降．导致了K562/Dox细胞线粒体跨膜电位的下降,而且对苯妥英钠和卡马西平的耐药性明显下降,IC₅₀分别由(1 978.2 ± 90.3) mg/L和(1 875.6 ± 83.2) mg/L,降低到(1 123.5 ± 54.2) mg/L和(1 084.5 ± 60.6) mg/L,逆转倍数分别为1.76和1.73．同时动物实验发现,耐药组大鼠在给予XIAP反义寡核苷酸后,ADT明显高于对照组(P < 0.05), ADD时程也明显缩短．上述结果证明,XIAP在耐药的K562/Dox细胞株存在高表达,下调XIAP在K562/Dox细胞株表达可以改善K562/Dox对卡马西平和苯妥英钠的耐药性．而且下调XIAP表达可以协助AEDs改善耐药大鼠的电生理活动,提示XIAP参与了难治性癫痫的耐药．