长春花丙二烯氧化物合酶基因的克隆与表达

利用RT-PCR和RACE相结合的方法,从长春花中克隆了丙二烯氧化物合酶(AOS)基因。结果显示:长春花AOS基因(CrAOS)cDNA全长为2 118bp,包括5′和3′非翻译区,polyA尾和一个长1 638bp的开放阅读框,其基因组中不含内含子;CrAOS基因编码的蛋白含545个氨基酸。多重比对表明CrAOS蛋白与其他的AOS蛋白具有较高的相似性,CrAOS蛋白序列中含有AOS家族应有的保守氨基酸残基。Southern杂交表明:CrAOS基因在长春花中为低拷贝。qRT-PCR结果显示:CrAOS在各个组织均有表达但表达量存在差异,在老叶中最高,在幼花中表达最低。对长春花幼苗进行不同处理,结果表明:伤害、低温、甲基茉莉酸、乙烯利处理等可使CrAOS基因表达量显著提高,水杨酸处理对基因表达影响不大。     

地黄RgMYB10基因的克隆与表达分析

MYB转录因子是植物最大的转录因子家族之一,广泛参与植物的生长发育、逆境胁迫和次生代谢产物积累。该研究通过同源比对和功能注释,在地黄(Rehmannia glutinosa)转录组中筛选出MYB的转录本,设计特异性引物对MYB基因的cDNA序列进行PCR扩增,用水杨酸(SA)、Ag⁺、茉莉酸甲酯(MeJA)和腐胺(Put)这4种诱导子处理地黄毛状根,并通过实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测候选MYB基因的表达。结果显示:(1)成功克隆到1个地黄MYB基因,命名为RgMYB10;该基因编码247个氨基酸残基,蛋白质相对分子质量28.48 kD,等电点为5.14,属于R2R3-MYB转录因子。(2)qRT-PCR结果显示,RgMYB10在须根中表达量最高,其次为茎,块根中的表达量最低。(3)RgMYB10在MeJA处理后的毛状根中显著上调表达,为特异响应MeJA诱导的基因,推测RgMYB10基因可能是响应MeJA参与地黄毛蕊花糖苷生物合成的关键转录因子。研究表明,地黄MYB10基因可能参与地黄毛蕊花糖苷的生物合成,为进一步研究MYB10基因在地黄毛蕊花糖苷合成中...     

地黄氧-酰基转移酶WSD基因的鉴定与表达分析

植物蜡酯合成酶催化长链醇和长链脂肪酸合成蜡酯,对植物蜡质合成及其抗旱、抗致病菌袭击和紫外辐射、抗寒和昆虫侵害等环境胁迫具有非常重要的作用; 镉是环境中含量最高的有毒重金属之一,严重威胁植物的生长发育、质量、产量和食用安全。为研究地黄蜡酯合成酶基因镉胁迫表达,该文从地黄全长转录组测序数据中鉴定其成员,并用生物信息学技术与qRT-PCR对其编码蛋白质的理化性质、系统进化和保守结构域及其组织表达与镉胁迫表达进行分析。结果表明:(1)鉴定出两个蜡酯合成酶基因RgOATWSD1与RgOATWSD2,其编码蛋白质的长度、理论等电点和相对分子量依次为463 aa与473 aa、8.86与9.34、51.31 kD与52.49 kD,均为不稳定蛋白。(2)二者均具有acyl_WS_DGAT保守域与DUF1298超家族,前者占其氨基酸序列的92.65%～94.50%。(3)二者均定位于内质网中,二级结构以无规卷曲与α螺旋为主; RgOATWSD1为跨膜蛋白,而RgOATWSD2 不是。(4)二者均在地黄根、茎、叶中差异表达。(5)二者表达均受镉胁迫诱导,但其表达变化趋势不同。该研究鉴定了两个镉胁迫应答反应的蜡酯合成酶基因,为地黄RgOATWSD的镉胁迫表达及功能研究奠定了基础。     

地黄RgCDPK基因的克隆与表达分析

钙依赖型蛋白激酶(calcium-dependent protein kinases, CDPKs)是高等植物细胞中重要的钙离子信号受体,在植物抵御逆境胁迫过程中发挥着重要作用。该研究以地黄为材料,设计特异引物,克隆地黄RgCDPK基因全长序列,并使用在线软件进行生物信息学分析,采用荧光定量PCR技术进行组织特异性分析。结果表明:(1)克隆得到的地黄CDPK基因长度为1 770 bp,编码589个氨基酸;(2)多序列比对和结构分析显示,该蛋白含有钙依赖蛋白激酶典型结构域丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶区及EF-手性区。系统进化分析表明其与拟南芥 AtCDPK28 的同源关系最近,因此命名为RgCDPK(Genbank登录号为MT024235);(3)组织特异性分析得出RgCDPK在地黄叶中表达量最高。该研究成功克隆出地黄CDPK基因,且发现该基因在不同组织中的表达存在差异,为以后深入研究CDPK在地黄连作障碍等生物及非生物胁迫中的分子机制提供理论基础。     

地黄扩展蛋白基因RgExpA1的克隆与表达分析

采用RT-PCR方法对9个地黄扩展蛋白基因在地黄不同组织器官、不同发育时期的表达特点进行了分析,在此基础上用RACE方法克隆了主要在根中表达的RgExpA1基因的全长,并对该基因编码氨基酸的功能位点、拼接方式以及与同源基因的进化关系作了初步分析。     

不同色彩矮牵牛DFR基因的克隆与生物信息学分析

二氢黄酮醇4-还原酶基因(DFR)是花色素合成途径中的一个关键基因。以新疆种植的白、红和蓝色矮牵牛为试验材料,通过同源克隆的方法从花中克隆到3个完整的DFR基因的全长编码序列(CDS),与已知的矮牵牛DFR基因(GenBank登录号:X15537)序列的相似性分别为97.79%、96.59%和97.99%,分别命名为PhDFR1,PhDFR2和PhDFR3;3个基因编码380个氨基酸,同已知矮牵牛DFR基因编码的蛋白(GenBank登录号:CAA33544)的同源性分别是95.53%、94.21%和95.79%;生物信息学分析表明,3个蛋白均具有NADB-Rossmann家族中高度保守的NADPH结合位点、底物特异性结合位点。3个矮牵牛品种DFR都不具有信号肽,为亲水蛋白,定位于细胞质的可能性最高;均具有两个跨膜结构,α-螺旋和β-折叠是3个DFR的主要二级结构元件,并且形成了β-α-β-α-β的Rossmann折叠,整本上呈对称分布。利用同源建模分析3个DFR蛋白与已知葡萄的DFR晶体结构有很高的相似性。系统进化树分析表明,PhDFR1、PhDFR2、PhDFR3与已知矮牵牛DFR蛋白亲缘关系最近。     

紫杉醇合成关键酶BAPT基因的克隆及原核表达

目的:克隆曼地亚红豆杉紫杉醇生物合成途径中的关键酶3-氨基-3-苯基丙酰转移酶(3-amino-3-phenylpropanoyltrans-ferase,BAPT)基因,并在大肠杆菌中表达.方法:首先提取曼地亚红豆杉细胞的总RNA,反转录获得其sscDNA,并以其为模板扩增BAPT酶的基因,然后将其与原核表达载体pET32a(+)连接,构建重组质粒pET32a(+)-BAPT,并将重组质粒转入E.coli BL21宿主中诱导表达.结果:扩增获得1338 bp的BAPT基因序列,成功构建了原核表达质粒pET32a(+)-BAPT,并在E.coli BL21中实现高效表达.结论:BAPT基因表达产物的分子量约为51 kDa,与预期大小一致.该研究为进一步分析曼地亚红豆杉BAPT酶的酶学特性奠定了基础.     

不同花色黄芩中dfr基因的克隆及时空表达分析

二氢黄酮醇-4-还原酶(Dihydroflavonol-4-reductase,Dfr)是类黄酮生物合成途径中调控花青素和原花青素合成的关键酶.为探究dfr基因在同一生态环境下不同花色黄芩中的差异,以白色、紫红色和紫色3种花色的黄芩花瓣cDNA为模板,基于同源克隆和RACE技术从中克隆得到3个完整的dfr基因全长序列,...     

2-萘酸加单氧酶基因及NADH:黄素还原酶基因的克隆与分析

伯克霍尔德氏菌(Burkholderiasp.)JT1500对2-萘酸(2-naphthoate)生物降解的关键步骤之一是通过2-萘酸加单氧酶羟化2-萘酸生成1-羟基-2-萘酸(1-hydroxy-2-naphthoate)。在已确定2-萘酸加单氧酶基因及其功能的基础上对含有该基因的一个4.8kb长度的基因簇进行了克隆测序。该序列上含有4个可能的阅读框orfB、orfC、orfD、orfA。序列比对发现,orfA序列与JaponicumUSDA110和RalstoniaeutrophaHF39中的加单氧酶基因同源性较高,orfB序列与BordetllapertussisTohamaI、RalstoniasolanacearumGMI1000和BordetellabronchisepticaRB50等菌中的黄素还原酶基因有一定的同源性。酶活分析发现只含基因orfA的重组大肠杆菌SA细胞提取液有很低的加氧活性,含基因orfB的重组子SB细胞提取液没有加氧活性,但在反应体系中同时加入SA和SB的细胞提取液后,其加氧活性显著增强,包含片段orfB orfA的重组子SB A在黄素(FMN、FAD)存在的情况下也表现出很强的加氧活性;在厌氧条件下,能检测出SB细胞提取液的黄素还原活性。基于以上信息,认为2-萘酸加单氧酶基因簇含有两个重要的组分黄素还原酶基因(nmoB)和加单氧酶基因(nmoA)。2-萘酸加单氧酶Nmo羟化2-萘酸的过程为先由黄素还原酶(NmoB)在NADH存在的条件下将黄素(FMN、FAD)还原为还原型黄素(FMNH2、FADH2),然后加单氧酶(NmoA)利用还原型黄素和O2羟化底物2-萘酸,生成1-羟基-2-萘酸。NmoB是NmoA的偶联蛋白。     

枸杞Lb_SPL12基因的克隆及表达分析

SPL(SQUAMOSA promoter-binding protein-like)是植物发育过程中特有的转录因子,SPL基因家族由多个成员组成.本研究通过RACE方法克隆到枸杞Lb SPL12转录因子的全长cPNA.研究结果表明,该cDNA基因的开放阅读框包含1 353 bp个碱基,编码450个氨基酸.Lb_SPL...     

2个慈竹bZIP基因的克隆、生物信息学分析及其诱导表达

从慈竹笋转录组数据库中筛选并克隆出2个bZIP基因（BebZIP2和BebZIP6）进行生物信息学分析。分析结果表明,它们编码序列长度分别为504和720 bp,编码167个和239个氨基酸,BebZIP2和BebZIP6属于bZIP相关蛋白,与水稻OsbZIP52/RISBZ5蛋白聚在一枝。组织表达分析表明,这2个慈竹BebZIP基因在慈竹笋、茎、展开叶和未展开叶等部位均有表达,属于组成型表达,同一基因在不同组织中的表达量差异较大,表达量的大小为未展开叶 > 展开叶 > 茎 > 笋。对慈竹幼苗进行ABA、NaCl和PEG6000非生物胁迫处理,结果表明,BebZIP2和BebZIP6对盐、干旱和ABA胁迫均具有不同程度的响应。     

地黄GGPPS1基因克隆及表达分析

以地黄为材料,通过分析地黄转录组数据,设计特异性引物,克隆了地黄牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸合酶（geranylgeranyl pyrophosphate synthase,GGPPS）基因的cDNA序列,命名为RgGGPPS1,GenBank登录号为KU258808。同时在生物信息学分析的基础上,进行原核表达、纯化以及组织特异性表达分析。结果显示：（1）RgGGPPS1基因开放阅读框为987 bp,编码328个氨基酸。（2）生物信息学分析结果显示,RgGGPPS1蛋白含有2个富含天冬氨酸的基序(DDXXXXDD和DDXXD),与芝麻等双子叶植物中的GGPPS蛋白相似性较高。（3）利用构建的原核表达载体pET 32a RgGGPPS1在大肠杆菌BL21(DE3)菌株中成功表达RgGGPPS1重组蛋白,采用Ni²⁺亲和层析得到了纯化的RgGGPPS1重组蛋白。（4）荧光定量PCR结果显示,RgGGPPS1基因在根中表达量最高,叶、茎中表达量较低。研究结果为进一步研究RgGGPPS1基因在地黄环烯醚萜苷生物合成途径中的功能奠定了基础。     

水曲柳2个PLT转录因子基因的克隆及表达分析

为初步探究水曲柳根发育中PLT转录因子的基因功能及遗传调控机理,以水曲柳转录组数据为基础,参考拟南芥AtPLT2和AtPLT3基因序列,通过PCR技术从水曲柳中克隆了两个PLT转录因子基因,通过同源比对将它们命名为FmPLT2和FmPLT3,分别编码532和497个氨基酸残基。生物信息学分析表明,其相对分子质量分别为59和55kDa,等电点分别为5.98和5.79,均为亲水性不稳定蛋白,均含有2个AP2保守结构域。系统进化分析结果显示,其与同属木犀科的油橄榄OePLT2和OeOLT3转录因子的同源性最高,亲缘关系最近。亚细胞定位预测显示,FmPLT2和FmPLT3蛋白都主要集中于细胞核中。通过qRT-PCR技术分析FmPLT2和FmPLT3在不同组织部位及生根期间的表达情况,结果表明:FmPLT2和FmPLT3具有相似的组织特异性表达,在根中表达含量均最高,在叶中的表达含量均最低;FmPLT2在生根期间的表达量变化极为显著,21天时的表达量是0天时的32倍,但FmPLT3的表达量变化并不显著,表明FmPLT2不仅在根发育中起重要作用,还可能参与细胞增殖和生长等多个发育途径。     

巴西橡胶树两个蔗糖合成酶基因的克隆和表达分析

为了解蔗糖合成酶在巴西橡胶树(Hevea brasiliensis)生长和发育过程中的功能,利用RACE技术从巴西橡胶树中克隆了蔗糖合成酶基因,并对基因的表达特征进行了分析。结果表明,从巴西橡胶树中克隆了两个蔗糖合成酶基因(HbSS1和HbSS2),HbSS1全长2864 bp,编码806个氨基酸;HbSS2全长2815 bp,编码811个氨基酸。两个基因编码的蛋白具有典型的植物蔗糖合成酶结构特征,包含1个磷酸化位点和两个保守的功能域。半定量RT-PCR分析表明,HbSS1和HbSS2在各组织器官中均有表达,其中HbSS1在叶中的表达量最高,HbSS2在树皮中的表达量最高,这说明HbSS1和HbSS2可能参与了各组织的生长和代谢过程,且功能有所分化。     

长白落叶松转录因子LobHLH34克隆及表达分析

为了解转录因子bHLH在长白落叶松（Larix olgensis）中的功能,探究该基因在长白落叶松不同组织中及不同逆境胁迫下的表达特性,从长白落叶松根、茎和叶3个不同部位的转录组数据中获得bHLH34基因全长序列,并设计引物,克隆得到长白落叶松bHLH34基因,其完整的开放阅读框（ORF）长度为696 bp,共编码231个氨基酸。构建亚细胞定位表达载体,瞬时转化毛果杨（Populus trichocarpa）原生质体,在激光共聚焦显微镜下观察显示,LobHLH34基因定位在细胞核内。系统进化树分析结果显示,长白落叶松与云杉（Picea asperata）、卷柏（Selaginella tamariscina）树种该基因的亲缘关系较近。利用qRT-PCR技术分析了bHLH34基因在长白落叶松中的组织表达特异性和应对非生物胁迫的表达。结果表明LobHLH34基因在长白落叶松的根、茎、叶中均有表达,其中在茎部表达量最低,在叶中相对表达量最高。LobHLH34基因在NaCl、PEG和ABA处理时,不同器官中的表达量也有所不同。推测长白落叶松bHLH34基因参与了植物的生长、发育、响应逆境胁迫的过程,且在不同器官中具有特异性。     

Cloning and Functional Analysis of an Allene Oxide Synthase in Physcomitrella patens

Jasmonic acid (JA) is a plant hormone that plays important roles in a large number of processes in stress adaptation and development in flowering plants. A search of genome database indicated the existence of allene oxide synthase (AOS), an enzyme of JA biosynthesis, in Physcomitrella patens, a model plant among mosses. In this study, the presence of JA was detected in P. patens. The recombinant AOS of P. patens, which was overexpressed in Escherichia coli, showed AOS activity. These data suggest that the octadecanoid pathway also exists in P. patens.     

长白落叶松过氧化氢酶LoCAT1基因克隆及表达分析

为了解长白落叶松过氧化氢酶(CAT)基因的相关信息,探究该基因在长白落叶松不同组织中及不同逆境胁迫下的表达特性,本研究根据长白落叶松转录组数据库中获得的CAT1基因全长序列设计引物,克隆得到长白落叶松CAT1基因,命名为LoCAT1。该基因完整的开放阅读框(ORF)长度为954bp,共编码317个氨基酸。系统进化树分析结果显示,LoCAT1基因与北美云杉、银杏等CAT基因亲缘关系较近。利用实时定量RT-PCR技术分析了LoCAT1基因在长白落叶松中的组织表达特异性和应对非生物胁迫的表达模式。结果表明:LoCAT1基因在长白落叶松的根、茎、叶中均有表达,其中在茎部表达量最低,在叶中相对表达量最高。在非生物胁迫下,LoCAT1基因在长白落叶松根、茎、叶中的表达均发生了变化,但表达模式不同。在NaCl处理后,根和茎中LoCAT1基因均表现为下调表达,在12h时表达量最低,而叶中LoCAT1基因表达在24h明显受抑制,随后被上调表达,胁迫96h时表达量最高。PEG6000处理后,根和茎中LoCAT1基因的表达在胁迫早期被明显抑制,随后被上调表达。而叶中LoCAT1基因的表达在所有时间点均表现为上调表达。本研究推测长白落叶松LoCAT1基因可能参与了植物响应逆境胁迫的应答。