天山雪莲UDP葡萄糖-类黄酮-3-O-葡萄糖基转移酶基因的克隆及功能分析

UDP葡萄糖-类黄酮-3-O-葡萄糖基转移酶(Flavonoid-3-O-glucosyltransferas,3GT)是植物重要的次生代谢产物生物合成途径中的关键酶。文中采用现代生物信息手段,经3GT的同源比对后设计基因特异引物,运用RT-PCR及RACE技术从天山雪莲Saussurea involucrata Kar.et Kir.叶片中克隆得到3GT基因的全长序列(GenBank Accession No.JN092127)。3GT基因的cDNA全长序列含有1个1 548 bp的开放阅读框(ORF),编码516个氨基酸,该基因推断的蛋白与草莓GT6蛋白的相似性为91%,与毛杨梅3GT的相似性为89%;经序氨基酸序列比对,推断的天山雪莲3GT具有糖基转移酶基因家族特有的结构域PSPG-box。半定量PCR的结果显示,天山雪莲3GT基因在叶及愈伤组织中表达量最高,在根中有少量表达,茎中不表达。将该基因构建到含有35S启动子的植物表达载体上,利用农杆菌介导的遗传转化法进行同源转化,将筛选到的含有转3GT基因的愈伤组织进行悬浮培养,并用紫外分光光度法测量其黄酮含量是非转基因愈伤组织总黄酮平均值的2.06倍。     

七彩红竹二氢黄酮醇4-还原酶基因IhDFR1的克隆及表达分析

二氢黄酮醇4-还原酶（DFR）是植物花色素苷合成途径中的关键酶,在植物花色的形成过程中起重要作用。依据七彩红竹转录组数据设计特异引物,采用ImPcR技术从七彩红竹中克隆获得了一个新的DFR基因cDNA全长,命名为IhDFR1（登录号为KF728205）。序列分析结果表明,IhDFR1基因cDNA全长945bp,编码314个氨基酸。生物信息学预测显示,该基因编码的蛋白具有典型的DFR蛋白功能结构域,存在2个特异结合位点,属于非Asn／Asp型DFR酶,与禾本科植物中的DFR具有较高的相似性。对不同发育时期七彩红竹的IhDFR1基因进行时空表达的结果显示,只有在竹秆颜色呈现红紫色时,IhDFR1基因才有表达。以上结果初步显示IhDFR1蛋白可能作为一个重要的酶参与竹秆花色素苷的代谢调控,同时为进一步研究七彩红竹花色素苷产生的分子机理和综合开发利用奠定了基础。     

滇牡丹类黄酮3-O-葡萄糖基转移酶基因的鉴定及表达分析

在植物中,类黄酮3-O-葡萄糖基转移酶(F3GT)将不稳定的花色素转变为稳定的花色素苷,是花色素苷形成的关键酶。本研究采样RT-PCR技术从滇牡丹中成功克隆获得一个完整的F3GT基因(Pd F3GT1),其含有1 371 bp的开放阅读框(ORF),编码456个氨基酸。该基因推断的蛋白与葡萄(Vitis vinifera)3GT蛋白的相似性为64%;与已知功能的3GT基因进行系统进化分析,结果显示Pd3GT1与葡萄3GT聚类到同一个分支。氨基酸比对显示Pd3GT1蛋白序列还有糖基转移酶家族特有的PSPG-box结构域。半定量PCR结果显示:Pd3GT1在花蕾,花开时期的花瓣中大量表达,在叶和花芽中有微弱表达;在根和茎中没有表达。说明Pd3GT基因表达具有组织表达特异性。该研究将为研究滇牡丹花色素形成机理,以及对滇牡丹类黄酮糖基转移酶的功能鉴定和利用基因工程手段改良花卉品质提供理论依据。     

人ZP3基因的RT-PCR cDNA克隆

目的：研究人ZP3基因的结构及构建人ZP3基因原核表达系统。方法：从人卵巢组织中分离出mRNA并以此作为模版,通过RT—PCR扩增出人ZP3基因cDNA片段,然后将其克隆在pUC18质粒上,并对克隆片段进行序列分析。结果：共克隆到ZP3-A（1300bp）、ZP3-B（1180bp）、ZP3-C（1200bp）和ZP3-D（1080bp）4种不同长度的人ZP3基因cDNA片段,对其中最长的ZP3-A片段的测序结果表明,它包含了人ZP3基因阅读框内的全部序列,与NCBI Sequence Viewer中公布的人ZP3 mRNA序列（NM-007155）相比较,在1275bp长的编码区内只有一个碱基不同,两者同源性达到99．92％。结论：本研究克隆到的ZP3-A cDNA片段确是人ZP3基因无疑。     

NOBOX基因的cDNA克隆及其特性分析

NOBOX(新生儿卵巢同源基因)是一个卵母细胞特异性表达的同源基因,在早期滤泡发生中起重要的作用。本研究结合电子克隆的方法,从猪卵母细胞中成功地克隆了NOBOX基因的全长cDNA序列(GenBank Accession No.FJ587509)。猪NOBOX基因的cDNA全长为1768 bp,包含1419 bp的开放阅读框。生物信息学分析表明NOBOX基因编码了472个氨基酸,分子量为51.08 kD,等电点为5.73。该蛋白定位于细胞核中,含有一个保守的结构域——cd00086。借助Clustalw软件,采用N-J算法构建了NOBOX蛋白的系统进化树,分析了不同物种间的进化关系。应用实时荧光定量PCR技术分析该基因在母猪不同组织、细胞及4种孤雌激活胚胎的表达模式,结果表明该基因在母猪各组织中均有不同程度的表达,其中在心脏、肾脏和卵母细胞中表达水平较高,推测其可能在心脏、肾脏和卵母细胞中发挥着重要的作用;NOBOX基因在胚胎发育阶段的表达水平高于G-V期的卵母细胞,表明在胚胎发育阶段pNOBOX的表达增强。     

高丛蓝莓类黄酮3′-羟化酶基因F3′H的克隆及表达特性分析

以高丛蓝莓(Highbush blueberry)"喜来(Sierra)"和"日出(Sunrise)"为研究材料,通过RACE(rapid amplification of c DNA end,RACE)技术获得蓝莓(Vaccinium ssp.)F3′H基因的全长c DNA序列,并使用生物信息学工具对该基因编码蛋白的氨基酸组成及理化性质、二级和三级结构,以及氨基酸序列的相似性等进行了预测和分析。利用荧光定量PCR(RT-q PCR)手段来检测其在蓝莓果实不同发育时期表达情况。结果表明:Vs F3′H全长c DNA为1 871 bp,编码530个氨基酸,蛋白相对分子质量为58.33 k D,理论p I值为7.32;蛋白疏水性指数为0.004,属于疏水性蛋白,二三级结构预测可知其富含α-螺旋和无规则卷曲。RT-q PCR发现Vs F3′H主要在果实发育前期表达量较高,蓝果期表达量明显下调,且在不同品种中以蓝果期的表达量差异显著。这些研究结果为解析蓝莓果实色泽发育及果树分子育种奠定了理论基础。     

紫萍P143品系植物rbcS基因的cDNA克隆与表达

紫萍P14 3品系离体半叶状体在黑暗下培养 4d以后 ,rbcS基因的表达比完整植株显著降低 ;半叶状体在黑暗下培养 10d ,后再转移到长日照条件下培养 ,rbcS基因的表达能恢复到较高水平     

两个新的红细胞分化相关因子的cDNA克隆及功能探讨

曾报道在终末分化阶段的红细胞中可表达一些与珠蛋白基因增强子HS2序列特异结合的蛋白因子, 并利用杂交瘤技术制备了两株针对上述蛋白的单克隆抗体. 为获得编码这些因子的基因, 实验利用这两株单抗筛选构建于l gt11的人胚肝cDNA表达文库, 并获得阳性克隆. 经分析, 其中一株 cDNA克隆具有全长编码序列(EDRF1), 另一株为具有可读框的cDNA片段(EDRF2), 由它编码的氨基酸序列含有反式调节因子特有的亮氨酸拉链结构域. 与GenBank作同源比较后确定上述两株cDNA序列均未见报道. Northern印迹结果表明, 它们编码的蛋白质为红细胞分化相关蛋白. RT-PCR系统地观察了EDRF1, EDRF2在多种细胞株和组织中的表达, 提供了重要的功能线索. EDRF1和EDRF2主要在造血系统和早期的胚胎多种组织表达, 说明它与血细胞成熟和早期的组织发育相关, 也可能是传递早期造血与胚胎发育的分子语言.     

朵丽蝶兰二氢黄酮醇4-还原酶基因DtpsDFR的克隆与表达分析

二氢黄酮醇4-还原酶(dihydroflavonol 4-reduetase,DFR)是花色素苷合成途径中的一个关键酶。该研究利用RT-PCR和RACE技术从朵丽蝶兰‘满天红’深红色花瓣中克隆获得一个DFR基因,命名为DtpsDFR。该cDNA序列全长1 286 bp,编码378个氨基酸。氨基酸序列分析表明,DtpsDFR编码的蛋白与Bromheadia fi nlaysoniana、文心兰、大花蕙兰、石斛兰等兰科植物的DFR蛋白同源性均在76%以上,含有1个FR_SDR_e特征结构域,存在NADPH结合基序和底物特异性结合基序,属于NADB_Rossmann超家族;系统进化树显示,DtpsDFR与Bromheadia fi nlaysoniana的DFR蛋白亲缘关系最近。实时荧光定量PCR分析结果显示,DtpsDFR基因的表达量随着花的发育逐渐降低,凋谢期微量表达;在花瓣、萼片中的表达量高于唇瓣,在叶片和根中微量表达。     

骨关节炎相关Smad3突变基因的克隆及其初步的功能分析

以前的研究结果显示Smad3错义突变(P197N→I)可能与骨关节炎发生的病理过程有关。本研究构建了带有该点突变的Smad3 cDNA的表达载体,转染Smad3基因缺失的成纤维细胞,检测细胞培养液中MMP-2的表达水平和活性变化。结果显示,转染野生型Smad3表达载体可以使Smad3基因缺失的成纤维细胞MMP-2表达活性明显降低,而转染Smad3突变体表达载体丧失对MMP-2表达活性的调节作用。本研究结果提示骨关节炎相关的Smad3突变体可能丧失对成纤维细胞表达MMP-2的抑制作用。     

国产18种鳞盖蕨属植物叶表皮微形态特征及其系统学意义

鳞盖蕨属是一个自然类群,由于各类群之间的形态差异以及种内变异比较大,因此其分类一直存在争议。该研究利用光学显微镜(LM)和扫描电子显微镜(SEM)对鳞盖蕨属18种植物(含3变种)的叶表皮微形态进行了观察和比较,并结合形态学、孢粉学和分子系统学探讨其系统学意义。结果表明:在光学显微镜下,18种鳞盖蕨属植物叶上、下表皮的脉上均有毛,叶表皮细胞都为不规则形,垂周壁为深波状或波状; 气孔都分布在下表皮,气孔器类型主要有极细胞型和腋下细胞型两种,叶表皮微形态特征支持鳞盖蕨属是碗蕨科中的一个单系类群; 叶上、下表皮脉间毛的变异特征支持光叶鳞盖蕨、毛叶边缘鳞盖蕨和二回边缘鳞盖蕨处理为边缘鳞盖蕨变种; 在扫描电镜下,叶上表皮角质层多为脊状凸起,多数还具丝状纹饰,角质膜特征与叶片回数有一定的相关性; 共环极细胞型、聚腋下细胞型、不等细胞型和不规则四细胞型只在少数种出现,气孔外拱盖多数凹陷,光滑或有颗粒; 气孔外拱盖内缘平滑、浅波状或齿状; 保卫细胞两极大多数有“T”型加厚,不同种间叶表皮微形态特征表现出一定差异。该研究结果为其分类、演化、系统位置等进一步研究提供了参考。     

山茶属金花茶组金花茶系植物叶表皮形态学研究

在光学显微镜下观察山茶属金花茶组金花茶系25个分类群的叶表皮形态。结果表明:25个分类群的叶上表皮形态结构相似,气孔仅分布于下表皮。下表皮的细胞垂周壁式样和气孔形状在一些种间存在着明显的差异。分布于不同地貌类型的金花茶种类的气孔密度存在显著差异,分布在石灰岩山地的种类的气孔密度在整体上明显高于分布在非石灰岩山地的种类。     

凤仙花近缘种间核型分析与叶表皮微形态研究

为探究凤仙花近缘种植物的细胞学和微形态学方面的亲缘关系,该文选取荔波凤仙花(Impatiens liboensis)及近缘种赤水凤仙花(I.chishuiensis)和管茎凤仙花(I.tubulosa)的根尖和叶表皮为实验材料,采用体细胞染色体常规压片法和叶表皮光学显微镜观察法对凤仙花近缘种植物进行染色体及叶表皮特征研...     

巴西橡胶树HbMKK4基因的克隆及表达分析

采用RACE技术,从橡胶树‘热研7-33-97’中克隆了1个促分裂原活化蛋白激酶的激酶(MKK)基因HbMKK4。该基因全长cDNA序列1 580bp,编码框1 059bp,编码352个氨基酸,含有S_TKc结构域,其编码蛋白的分子量为38.83kD,理论等电点为9.36。实时荧光定量PCR结果显示,HbMKK4在橡胶树的根、树皮、胶乳及叶片中均有表达。割胶、茉莉酸甲酯和乙烯利均能上调胶乳中HbMKK4基因的表达,基因相对表达量分别在割胶后2h、茉莉酸甲酯处理8h和乙烯利处理4h后达到最高。研究结果推测HbMKK4可能通过MAPK信号途径参与茉莉酸信号途径的响应,可能在天然橡胶生物合成调控中起关键作用。     

酸枣叶表皮微形态对不同生态环境的适应特征

以生长于烟台—石家庄—宁夏—新疆不同生境形成的自然梯度干旱环境中的酸枣(Ziziphus jujuba var.spinosas)为材料,应用扫描电镜和能谱分析研究酸枣叶表皮微形态对不同自然梯度干旱环境的适应特征。结果表明:酸枣叶片的上、下表皮都有表皮毛着生且在叶脉处分布浓密;叶片表层覆盖有较厚的角质层和蜡质并形成突起,其主要成分为C、O、Ca三种元素;叶片表面气孔数量平均40个/视野且按一定规律分布。不同生境中酸枣叶片表面都分布有大量的晶体,且晶体的形态和组成成分表现出一定的生态适应特征。晶体的形状多样,有正六棱体、长六棱体、不规则片状、正方体、棒状晶体或针状,晶体的分布方式有单晶和簇晶。从烟台到新疆随干旱梯度的加剧,酸枣叶片表皮毛逐渐增多,气孔数量减少,气孔腔下陷明显,有助于植株减少蒸腾保水抗旱;晶体的体积逐渐变小,数量增多,密度增大,提升了叶片硬度及抗旱性;酸枣叶片晶体的主要成分为C、O、Ca三种元素,且随生境干旱加剧,C元素的含量逐渐增加,O和Ca元素含量依次减少,此外宁夏的晶体中还含有Si元素,进一步提升了叶片的机械性能。酸枣叶表皮微形态中表皮毛、角质层与蜡质、气孔、晶体等在形态结构、生物功能和组成成分上特异性的变化是其长期生存于不同梯度干旱生境的生态适应特征。     

兜兰DEFICIENS(DEF)-和GLOBOSA(GLO)-like基因的克隆及表达分析

以‘同色兜兰’品种为材料,采用RT-PCR和RACE技术获得了DEFICIENS(DEF)-和GLOBOSA(GLO)-like基因的cDNA全长,命名为PcDEF和PcGLO,并用半定量RT-PCR和实时PCR研究了PcDEF和PcGLO在花芽发育过程和不同组织部位的表达特性。结果表明,PcDEF和PcGLO的全长cDNA分别为1 039bp和934bp,分别编码224和210个氨基酸;蛋白比对表明,PcDEF和PcGLO蛋白都具有典型MADS-box蛋白的MADS和K结构域;蛋白同源性分析显示,PcDEF和PcGLO与已登录的其它兰科植物的DEF/AP3和GLO/PI蛋白的相似性分别在75%～96%和87%～98%;系统进化树分析表明,PcDEF和PcGLO分别属于B类MADS-box蛋白家族的AP3和PI亚家族。表达分析显示,PcDEF和PcGLO在花芽发育中均有表达,PcDEF在成熟花、唇瓣和花瓣中的表达量高,在蕊柱、萼片、苞叶和根中次之,在花茎和叶中较低,在子房中几乎不表达;PcGLO在各组织中均有不同丰度的表达。     

思茅松HDR基因全长cDNA克隆与序列分析

1-羟基-2-甲基-2-E-丁烯基-4-焦磷酸还原酶(HDR)是甲基-D-赤藓醇-4-磷酸(MEP)途径中的最后一个酶,在植物萜类生物合成中起主控作用。该研究根据思茅松(Pinus kesiya var.langbianensis)树皮转录组数据分析结果,首先获得了思茅松HDR基因片段,然后根据所获得的基因片段设计特异引物,提取受伤后的思茅松树皮的RNA,并运用RT-PCR和RACE技术从思茅松树皮中克隆得到完整的HDR基因(Pk HDR)。生物信息学分析表明:克隆获得的Pk HDR1基因c DNA全长序列为1 876 bp,含有1个1 464 bp的开放阅读框(ORF),编码487个氨基酸。同源性分析结果表明:思茅松HDR蛋白与赤松(Pinus densiflora)HDR蛋白的相似性高达99%。亚细胞定位及结构域分析结果表明:思茅松Pk HDR氨基酸序列中包含转运肽序列(A1-A61)及植物HDR蛋白多个保守的功能位点(A143,A234,A288,A371)。系统进化分析结果表明:Pk HDR蛋白与赤松HDR蛋白的亲缘关系最为接近。半定量PCR检测结果表明:树皮的创伤促进思茅松HDR基因的表达。该研究成功克隆获得HDR基因,并确定其与松脂代谢密切相关,为阐明思茅松松脂生物合成机制和分子育种提供了参考。     

大叶落地生根类糖原合成激酶KdSK基因的克隆与表达分析

类糖原合成酶激酶(SKs)属于丝氨酸/苏氨酸类蛋白激酶,在植物器官发育、激素信号传导过程中十分重要,并参与生物胁迫、非生物胁迫的应答过程。大叶落地生根中的胎生苗发育过程,同时具备胚胎发生和器官发生的特征,是研究无性生殖的理想模型。为了更好地理解大叶落地生根中胎生苗发育的分子机制,该研究利用RACE-PCR技术,从大叶落地生根中克隆了1个新的基因KdSK。该基因具有423个氨基酸残基,分子量为47.79 kD,等电点为8.37,其开放阅读框长为1 272 bp。其蛋白与黄瓜的同源性最高,属于植物类GSK3/shaggy蛋白激酶家族的第Ⅳ类,与苜蓿(MSK4)蛋白在进化关系上最近,且与拟南芥(AtSK4-1、AtKSK4-2)聚为一枝。保守域结构分析表明,KdSK蛋白具有明显的蛋白激酶的结构域,包括蛋白激酶的ATP结构域和丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶活化结构域。实时荧光定量PCR分析表明,该蛋白基因在大叶落地生根的根中表达量最高,且受渗透胁迫(甘露醇)的诱导上调表达。该研究首次从大叶落地生根中克隆出KdSK基因,该研究结果为进一步研究该基因的功能打下了基础。