青藏高原藏羚羊朊蛋白基因及氨基酸序列分析

羊瘙痒病是一种自然发生的传染性海绵状脑病,它可以在绵羊和山羊羊群之中传播,其疾病的易感性、潜伏期和跨物种传播的能力主要受宿主朊蛋白基因(prion protein gene,PRNP)的影响。研究藏羚羊PRNP有助于明确藏羚羊和羊瘙痒病之间的关系,从而更好地保护藏羚羊。参照GenBank上已经发表的绵羊PRNP序列设计引物,然后对藏羚羊的PRNP序列进行扩增、测序和分析。测序结果显示藏羚羊PRNP序列由771个核苷酸构成,编码256个氨基酸。序列分析结果显示21只藏羚羊PrP(prion protein,PrP)氨基酸序列完全同源,并且与野生型绵羊PrP氨基酸序列完全一致。此外,藏羚羊PrP氨基酸序列与山羊(99.2%)、汤氏瞪羚(99.2%)、印度羚(99.2%)、驯鹿(98%)、马鹿(98%)、家牛(97.7%)和水牛(96.1%)也具有较高的同源性。在对PrP氨基酸序列136、154、171位多态性分析后发现本次收集的21只藏羚羊样本可能和野生型绵羊一样对羊瘙痒病易感。本研究为羊瘙痒病在藏羚羊羊群中可能出现的风险提供了理论依据,提示要加强藏羚羊羊群中羊瘙痒病的监测。     

最小的生命体——类病毒

类病毒是已知生物中最小的一类非细胞结构的病原微生物,具体地说是分子量较低的RNA或DNA分子所构成的生命体。类病毒不象病毒那样有衣壳包着,是最小的、裸露的、结构独特的核酸生物,主要存在于某些高等植物中,并使之罹病。类病毒由美国农业部植物病毒实验室类病毒研究组T.O.Diener博士在十年前首先发现。尽管类病毒非常小而简单,但是能在敏感宿主中进行自我复制,存在着基本的生物学的和遗传学的体系。由于类病毒在某些宿主中容易造成明显的病征而被发现,当然也有些种类的类病毒在复制时,常常不对宿主产生明显的破坏。在试图提纯和定性马铃薯纺锤体块茎病的病原体时,就首先发现了类病毒,但是多年来一直把这种病原体当作是病毒。Diener和Raymer(1967)曾报告这种疾病的传递因子是一种游离的RNA,因为在感病组织中没有发现病毒的核蛋白颗粒。直到1971年,Diener用沉淀和凝胶     

朊病毒播散机制的研究进展

传染性海绵状脑病(Transmissible spongiform encephalopathies,TSE)是一类致死性中枢神经系统的慢性退化性疾病,它包括了疯牛病(Mad cowdisease,MCD)即牛海绵状脑病(Bovine spongiformencephalopathy,BSE)、羊瘙痒病(Scrapie)、克雅病(Creutzfeldt-Jakob disease,CJD)、GSS综合征     

朊病毒播散机制的研究进展

传染性海绵状脑病(Transmissible spongiform encephalopathies,TSE)是一类致死性中枢神经系统的慢性退化性疾病,它包括了疯牛病(Mad cowdisease,MCD)即牛海绵状脑病(Bovine spongiformencephalopathy,BSE)、羊瘙痒病(Scrapie)、克雅病(Creutzfeldt-Jakob disease,CJD)、GSS综合征     

免疫印迹法检测牛海绵状脑病和羊瘙痒病

用大肠杆菌表达的牛朊病毒正常成熟蛋白 (BoPrPC)免疫新西兰白兔 ,获得了与朊病毒蛋白 (PrP)反应的抗体T1。根据致病型朊病毒 (PrP^SC)能抵抗蛋白酶消化的特性 ,用蛋白酶K消化脑组织提取物 ,以抗体T1进行免疫印迹反应 ,结果表明从接种羊瘙痒病朊病毒 2 6 3K的金黄地鼠脑组织提取物内检测到抗蛋白酶K消化的致病型PrPSC ,而正常金黄地鼠脑组织中没有抗蛋白酶消化的蛋白。以我国正常牛羊为材料 ,制备其脑组织提取物 ,用上述方法和抗体T1进行检测 ,结果没有发现抗蛋白酶K的任何蛋白存在 ,说明没有牛海绵状脑病和羊瘙痒病存在。用 1A8抗体也获得了同样的结果。这些结果表明可以用自制的抗血清检疫牛海绵状脑病和羊瘙痒病 ,防止其传入我国     

亚病毒——病毒学的一个新分支

1971年美国的Diener发现马铃薯纺锤形块茎病是由分子量仅为1.2×10~5的、具有很高碱基配对的单链环状RNA引起的,称谓“类病毒” (Viroid)。这一发现揭示了自然界存在着比病毒更简单的病原物。后来在许多经济植物上不断报道新的类病毒,在澳大利亚又发现,类似类病毒的环状RNA还能与类似病毒的线状大RNA共同包被于线状RNA编码的外     

柑桔裂皮类病毒和菊花矮化类病毒互补DNA探针的合成及检测

分别用人工合成的柑桔裂皮类病毒和菊花矮化类病毒的互补DNA探针,经固相分子杂交(dot blot)检测了柑桔、菊花等样品。结果表明:与生物学检测和聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)分析相比,这是早期诊断类病毒病和检测类病毒的一种较为灵敏、快速的方法。     

比较类病毒和卫星RNA的复制及其某些性质

一、类病毒、拟病毒和卫星RNA 1967—1971年,美国的Diener发现马铃薯纺锤块茎病是由分子量仅为1.2×10~5的RNA引起的,称作类病毒。类病毒的发现是生物学史上的一个重要事件,揭示了一类比病毒更小的病原的本质。这样小的核酸引入到适当的寄主后,能独立复制和致病,开拓了研究生命物     

羊瘙痒因子263K毒株感染金黄地鼠后鼠脑组织中检出PrP-res蛋白及其神经病理学研究

羊瘙痒病是累及山羊及绵羊的可传播海绵状脑病。为了观察羊瘙痒因子 (Scrapie)的病原特征及病理组织改变特点 ,将羊瘙痒因子 2 6 3K毒株颅内接种至金黄地鼠。经过 81～ 110天的潜伏期 ,89%的动物发病 (17/19只 )。对发病地鼠的神经病理学检测发现 ,海绵状空泡变性的检出率为 5 9% ,淀粉样斑的检出率为 17 6 %。利用免疫组化和蛋白酶消化后的Westernblotting检测证实 ,10 0 %的发病地鼠的脑组织中都出现蛋白酶抗性朊蛋白 (PrP res)。17只发病地鼠脑组织提取物中 ,PrP res的泳动位置和分子量大小完全一致 ,出现两条分子量在 2 5kD～ 31kD的反应带。尝试应用快速玻片印迹法检测病变组织中的PrP res,结果显示 ,与常规固定包埋切片的免疫组化检出效果相似。这提示脑组织印片法可成为临床检测克 雅氏病 (Creutzfeldt Jacobdisease ,CJD)患者脑组织活检标本中PrP res的快速、有效的方法。羊瘙痒因子 2 6 3K成功感染金黄地鼠再次证明 ,金黄地鼠是TSE感染因子良好的动物模型 ,发病率高 ,潜伏期短 ,发病动物PrP res的检出率明显高于典型病理改变的检出率。新生成的PrP res的电泳类型与接种的TSE因子有关 ,与宿主的个体差异无关 ,提示TSE感染因子的确存在“株”的现象。     

菊花矮化类病毒cDNA的分子克隆

菊花是世界上重要花卉品种之一,由菊花矮化类病毒(Chrysanthemum stunt viroid,CSV)引起的矮化病,近些年来在一些国家中有不断扩展的趋势。由于类病毒感染的潜伏期较长,所以早期诊断十分重要。我们曾用互补DNA(cDNA)探针和聚丙烯酰胺凝胶电泳检测我国的菊花矮化类病毒。分子杂交技术检测类病毒比生物学方法快速,较电泳方     

桑花叶萎缩类病毒基因组结构特征及聚类分析

桑花叶萎缩类病毒(Mulberry mosaic dwarf viroid, MMDVd)是近些年发现的桑花叶型萎缩病的病原物,本研究利用Mfold等软件和保守序列分析了MMDVd的二级结构及其中存在的核酶,并进一步对类病毒和卫星RNA进行了聚类分析,以期解决其分类和进化地位。结果表明MMDVd的正链存在典型的锤头型核酶结构,自切割位点为AUC,负链存在有疑似发夹型核酶的二级结构,是目前发现的第四个发夹核酶。聚类分析研究中,Pospiviroidae科类病毒单独形成一分支,Avsunviroidae科PLMVd和CChMVd首先与v LTSV聚合,而本研究MMDVd首先与卫星RNA s TRSV、s ArMV聚合,结合MMDVd正负链不同于已知Avsunviroidae科的两个锤头型核酶的结构,表明MMDVd应为一个新的未分类属,对于其核酶的自切割活性及其复制机制,则需要进一步的实验研究来验证。     

柑桔树中的一种小分子RNA

从柑桔裂皮病疫区采集的柑桔植株叶片中提取核酸,经双方向聚丙烯酰胺凝胶电泳分析,发现两种小分子环状RNA,采用分子杂交鉴定,此两种小分子RNA均与大多数类病毒中心保守区段有明显的序列同源性,其中一种分子量较柑桔裂皮病类病毒(CEV)小,与马铃薯纺锤体块茎类病毒(PSTV)大小相近。将含CEV和小分子RNA的柑桔叶汁接种于爪哇三七,经一定时间后,从爪哇三七中提取核酸,通过电泳和分子杂交方法分析,获得与柑桔植株相同的结果。对此种小分子RNA的性质本文进行了初步分析。     

一种有效的分离制备柑桔裂皮病类病毒的方法

类病毒分子量小,在寄主体内含量低,不易提纯。一般提纯方法需经过酚抽提,去糖、透析、氯化锂处理、DNase消化和纤维素层析,由于步骤复杂,所以回收率较低,同时所得样品纯度不高,难以满足各种需要。本文报道一种柑桔裂皮病类病毒(CEV)的分离制备方法,采用苯酚-氯仿抽提核酸,核酸经LiCl处理后,进行纤维素(CF-11)层析,然后经PAGE纯化CEV。该方法具有操作简便,所使用的设备简单,纯化CEV效果好等优点,是柑桔裂皮病类病毒早期诊断,序列分析,分子克隆和防治等研究必不可少的基础工作。     

接种外表健康的梨树芽片诱发苹果锈果病类病毒

曾报道苹果锈果病的病原为类病毒,称为苹果锈果类病毒(Apple Scar SkinViroid,ASSV)。在分类上与已知的几组类病毒均不同,其侵染性也已得到证实。50年代已观察到由梨树园改栽的苹果园,或梨树与苹果混栽的果园中,苹果锈果病发病率较高,但梨树却未见任何症状。其后,曾用十几个品种的梨(包括产于未栽过苹果的梨产     

柑桔裂皮类病毒感染——爪哇三七的研究

爪哇三七(Gynura aurantiaca)是柑桔裂皮类病毒(CEV)的敏感鉴定植物之一,也是CEV能得到大量增殖的寄主植物。本文报告了采用反向双相聚丙烯酰胺凝胶电泳银染色法和分子杂交技术,对CEV感染爪哇三七的若干特性的研究结果表明:感染了CEV的爪哇三七,无论是否表明症状,都比健株要多一条CEV-RNA带;感染了CEV的爪哇三七核酸提取物与CEV-cDNA探针能产生杂交点,而健株的核酸提取物则不能。以感病爪哇三七植株上发病的芽,再进行剪插,其病症的表现与光照有关,但经电泳检测CEV-RNA带的存在与病症表现无关。生物鉴定是对病毒及类病毒进行鉴定的经典方法。人们发现芸香科(Rutaceac)的香橼(Citron)等对柑桔裂皮病类病毒(CEV)敏感。此外,菊科(Compositae)的爪哇三七(Gynura aurantiaca)是对CEV敏感的草木植物之一。国内从部分地区田间柑桔裂皮病症状的调查和以香橼为指示植物鉴定CEV发生情况等研究都已有报道,但要对CEV的理化性质和分子生物学性质作深入研究,搞清楚CEV的致病机理及复制方式,并找到防治CEV的有效对策,首先需要大量高纯度的CEV-RNA,而直接从柑桔叶片中提取CEV则相当困难。爪哇三七不仅是CEV的敏感鉴定植物,可用于柑桔裂皮病的早期生物诊断,同时也是CEV大量增殖的理想寄主。为此,已有学者从CEV影响爪哇三七插条生根,使植株整体变化到CEV引起爪哇三七细胞病变,以及CEV引起爪哇三七蛋白质的变化等都作了细致的研究和报道。近年来,类病毒的研究方法又有新的进展,除了用简便的聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)甲苯胺兰染色法外,又采用了灵敏的反向双相PAGE银染色法来检测类病毒。我们采用双相PAGE银染色法和分子杂交技术,进一步考察了CEV感染爪哇三七的若干特性,其结果报告如下     

羊瘙羊因子263K毒株感染金黄地鼠后鼠脑组织中检出PrP—res蛋白及其神经病理学研究

羊瘙痒病是累及山羊及绵羊的传播海绵状脑病。为了观察羊瘙痒因子（Scrapie）的病原特征及病理组织改变特点,将羊瘙痒因子263K毒株颅内接种至金黄地鼠。经过81－110天的潜伏期,89％的动物发病（17／19只）。对发病地鼠的神经病理学检测发现海绵状空泡变性的检出率为59％,淀粉斑的检出率为17.6％,利用免疫组化和蛋白酶消化后Western blotting检测证实,100％的发病地鼠的脑组织中都出现蛋白酶抗性朊蛋白（PrP-res）。17只发病地鼠脑组织提取物中,PrP-res的泳动位置和分子量大小完全一致,出现两条分子量在25kD-31kD的反应带。尝试应用快速玻片印迹法检测病变组织中的PrP-res,结果显示,与常规因定包埋切片的免疫组化检出效果相似。这提示脑组织印片法可成为临床检测克－雅氏病（Creutzfeldt-Jacob disease,CJD)患者脑组织活检标本中PrP-res的快速、有效的方法,羊瘙痒因子263K成功感染金黄地鼠再次证明,金黄地鼠是TSE感染因子良好的动物模型,发病率高,潜伏期短,发病动物PrP-res的检出率明显高于典型病理改变的检出率,新生成的PrP-res的电泳类型与接种的TSE因子有关,与宿主的个体差异无关,提示TSE感染因子的确存在“株”的现象。     

朊病毒的研究进展

自1982年美国生物学家斯垣利·普鲁辛纳(S.B.Prusiner)在研究羊瘙痒病时意外发现一种新型亚病毒粒子—朊病毒(Prion);也因S.B.Prusiner在研究朊病毒中作出卓越贡献而获得1997年诺贝尔医学或生理学奖,Prion是一种小型的蛋白质颗粒,大小仅为最小病毒的1%,但是其毒害非常的严重,而且有很强的传染性,主要引起人畜的脑组织等神经组织出现一些神经症状,朊病毒与正常的病毒最大的不同之处再与它是一种不含核酸(DNA或RNA)的病毒粒子,这也是对科学界的一个巨大的挑战,本文就朊病毒的一些特性以及生物学特性进行探究及其讨论研究作出详细叙述。     

羊瘙痒病小鼠适应株139A可突破种属屏障颅内感染金黄地鼠

羊瘙痒病感染因子可以根据疾病发生的潜伏期、临床病程、神经病理学特征以及PrPSc分子特征等分为不同的毒株,目前已经证实有20余种.在可传播性海绵状脑病的发病过程中存在着明显的种属屏障作用.将小鼠适应株139A颅内接种至金黄地鼠,以观测感染因子对种属屏障的突破及感染特征.在接种385～405天后,感染动物出现明显症状,与以往报道的金黄地鼠适应株263K不同,139A毒株发病动物出现严重的瘙痒,而无明显的共济失调.感染动物自出现明显症状到死亡的时间明显长于263K毒株感染金黄地鼠.进一步脑组织电镜和Western blot检测证实,存在有羊瘙痒病相关纤维和PrP-res.这证明小鼠适应株139A可突破种属屏障感染金黄地鼠.经系统比较,139A和263K毒株在潜伏期、主要临床症状和临床病程显示出明显的差异,而PrP-res的泳动位置和糖基化比率差异不大,仅139A毒株的单糖基化分子位置似乎略高于263K.动态观测处于潜伏期的接种动物脑组织羊瘙痒病相关纤维和PrP-res,发现PrPSc的出现明显早于临床症状.     

用改进的往复式凝胶电泳法检测类病毒

描述了改进的快速灵敏诊断类病毒的方法,通过对马铃薯纺锤块类病毒(PSTV)、菊花矮化类病毒(CSV)和苹果锈果类病毒(ASSV)的检测表明,该方法快速灵敏、经济、可靠。     

病毒是进化的还是退化的产物?

答:自然界中被发现的病毒已逾千种(估计占总种数的1％)。关于它们是进化还是退化产物的问题,在70年代前一直争论不休。直到1972年,Diener发现类病毒之后,学者们才基本上统一了看法。普遍认为:非生命物质首先进化成只含核酸的类病毒;类病毒再进化成有蛋白质外壳包围着核酸的病毒;由只含一种类型核酸的病毒,进化成同时含DNA和RNA的衣原体、立克次体、