刚毛柽柳腺苷甲硫氨酸脱羧酶（ThSAMDC）基因的克隆与胁迫下的表达分析

S-腺苷甲硫氨酸脱羧酶（S-adenosyl-L-methionine decarboxylase,SAMDC）是一种通过参与多胺的代谢途径来调节植物生理生化过程的限速酶。通过分析刚毛柽柳（Tamarix hispida）的转录组数据,获得并克隆了SAMDC基因的cDNA序列,将其命名为ThSAMDC。该cDNA序列全长2085bp,包含tiny ORF（tORF）、upstream ORF（uORF）和main ORF（mORF）3个植物SAMDC基因特征ORF。主开放读码框（mORF）长1107bp,编码369个氨基酸多肽,相对分子质量为40.34kD,理论等电点（PI）为4.72。ThSAMDC编码蛋白具有多个较强的亲水性区域,无明显跨膜区。通过与其他多个物种的氨基酸多序列比对结果表明,ThSAMDC具有两个典型的高度保守的结构域：酶原剪切位点（LSESSLF）与蛋白快速降解有关的PEST（TIHVTPEDGFSYAS）结构域。系统发育树结果表明ThSAMDC与菠菜（SoSAMDC）氨基酸序列一致性最高,为77%。实时荧光定量RT-PCR分析显示,ThSAMDC在NaCl、PEG、ABA、CdCl₂诱导表达均上调,预示着ThSAMDC可能在刚毛柽柳非生物胁迫应答过程中发挥重要作用。     

S-腺苷甲硫氨酸合成酶在大肠杆菌中的克隆与表达

目的:克隆与表达大肠杆菌S-腺苷甲硫氨酸合成酶的基因。方法:应用PCR技术从E.coliBL21(DE3)的总DNA中扩增出1.1kb的S-腺苷甲硫氨酸合成酶基因,将其连接到PGEMT载体上,测序证明正确后再将目的基因插入大肠杆菌高表达载体PET28a中,含有目的基因的重组质粒在大肠杆菌中进行表达与分析。结果:SAM合成酶在E.coliBL21(DE3)中的表达量达到23.6%,酶活达到4.17μmol/h.ml。结论:大肠杆菌表达出了具有生物活性的S-腺苷甲硫氨酸合成酶。     

S-腺苷甲硫氨酸合成酶反应条件的优化

优化了重组毕赤酵母表达的S-腺苷甲硫氨酸合成酶催化L-甲硫氨酸(Met)和ATP合成 S-腺苷甲硫氨酸的条件,确定了该酶的最适酶活力检测条件为20mmol/L的L -Met,26mmol/ L的ATP,52mmol/L的MgCl2,300mmol/L的KCl,8mmol/L的还原型谷胱甘肽,100mmol/ L的Tris,反应液pH 8.5,35°C反应 1h,比活力达到23.84U/mg.该酶还可以催化以DL-Met代替L-Met为底物的S-腺苷甲硫氨酸合成反应,以降低生产成本.     

烟草中一条新的S-腺苷甲硫氨酸合成酶基因的克隆及表达分析

利用差异显示技术从烟草中分离到一个受乙烯利诱导表达的cDNA片段,结合RACE扩增技术获得该基因的全长序列。该全长cDNA共含1350个碱基,编码区有1170 bp,通过GenBank同源性比较发现它与一条已知的烟草S-腺苷甲硫氨酸合成酶(SAMS1,EC2．5．1．6)的基因编码区存在90％的同源性,编码的氨基酸顺序96％同源,而在cDNA的5’及3’非编码区同源性很低,且有一些短片段的缺失。设计合适的引物分别对这两个SAMS基因进行RT-PCR分析表明,SAMS1基因受高温诱导表达增强,但不受甲基紫晶诱导的氧化胁迫及盐胁迫影响,而新分离到的这个基因(SAMS2)的表达同时受高温、甲基紫晶及高盐3种胁迫的诱导。     

微生物转化生产S-腺苷甲硫氨酸

S-腺苷甲硫氨酸(S-adenosyl-L-methionine,SAM)是具有广阔市场前景的活性氨基酸,微生物转化法是近年来报道较多的SAM生产方法.综合近年来SAM生产菌株的基因改造和发酵优化方面的进展,从提高SAM合成酶表达和酶活、优化甲醇和甘油的流加方式、改善ATP的生成和L-甲硫氨酸的补料、阻断下游代谢路径等方面,综述了促进SAM合成及其积累的多重策略及机制.最后结合笔者多年研究实践,讨论了微生物转化生产SAM的未来研究方向.     

甜瓜S-腺苷甲硫氨酸脱羧酶基因的克隆及白粉病诱导表达分析

为探讨S-腺苷甲硫氨酸脱羧酶(S-adenosylmethionine decarboxylase,SAMDC)基因在甜瓜抵御白粉病菌中的作用,根据已知EST序列和甜瓜基因组数据库,在甜瓜抗白粉病品种‘Yuntian930’中克隆获得该基因的全长编码序列,命名为CmSAMDC(GenBank登录号为KF151861)。生物信息学分析表明,CmSAMDC的主开放阅读框(mORF)长1 095 bp,编码364个氨基酸,预测分子量为40 kDa。聚类分析表明,CmSAMDC预测蛋白与黄瓜和四季橘中该蛋白的同源关系最近,并与其他双子叶植物聚为一类。原核表达分析表明,CmSAMDC以融合蛋白形式表达,相对分子量约为40 kDa,与预测一致。实时定量表达分析表明,CmSAMDC基因受白粉病诱导表达,在接种后48 h表达量达到峰值,为接种前的7倍,并且在甜瓜的根、茎、叶、卷须中均有表达。结果提示该基因可能参与了甜瓜的抗白粉病反应。     

S-腺苷甲硫氨酸代谢途径相关基因在小麦水分胁迫中的表达

以小麦品种‘晋麦47’为材料,利用半定量RT-PCR方法,对S-腺苷甲硫氨酸代谢途径中的S-腺苷甲硫氨酸合成酶(SAMS)基因、S-腺苷甲硫氨酸脱羧酶(SAMDC)基因和γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶(-γECS)基因在正常供水、PEG-6000模拟水分胁迫和复水过程中小麦叶片的表达模式进行了分析。结果表明,3个基因在正常生长情况下有一定量的表达,SAMS和SAMDC基因在水分胁迫早期(PEG-6000胁迫6、12、244、8 h)上调表达,水分胁迫后期(PEG-6000胁迫75 h)表达量下降;复水后3~6 h上调表达,复水9 h后表达量下调至对照水平。-γECS基因在水分胁迫阶段呈上调表达,复水后表达量下调至对照水平。可见,小麦SAMS、SAMDC和-γECS基因的表达都受水分胁迫诱导,同时,SAMS与SAMDC基因还参与水分胁迫后的复水调节,说明S-腺苷甲硫氨酸代谢途径在小麦抗旱节水中具有重要作用。     

过表达S-腺苷甲硫氨酸合成酶及优化碳源高产洛蒙真菌素

洛蒙真菌素是由洛蒙德链霉菌S015合成的天然吩嗪类化合物,该化合物具有广谱抑菌活性及抗肿瘤活性,但因其在野生菌株中的产量较低而限制了应用.为了提高洛蒙真菌素产量,探究相关基因功能及S015菌株发酵条件,本研究首先建立系统进化树分析内源S-腺苷甲硫氨酸合成酶MetK,其次在野生型S015中过表达metK基因,最后通过动态发酵实验进行碳源优化.研究结果表明,过表达metK基因的菌株洛蒙真菌素产量达到(27.4±2.8)mg/L,是野生株的2.3倍;通过发酵优化,以20 g/L的木糖为碳源时洛蒙真菌素产量最高,为(130.6±8.0)mg/L,是优化前的4.8倍.本研究成功采用上游基因工程改造结合下游发酵优化的生物工程手段,有效地提高了菌株S015中洛蒙真菌素的产量.     

阻断消耗途径提高毕赤酵母工程菌S-腺苷甲硫氨酸产量

【背景】S-腺苷甲硫氨酸(S-adenosyl-L-methionine, SAM)作为所有生物体内的重要中间代谢物,不仅可作为膳食补充剂,还具有良好的临床应用价值。【目的】将毕赤酵母重组菌GS115/DS16的SAM消耗途径阻断,进一步提高SAM的产量。【方法】分别敲除毕赤酵母重组菌GS115/DS16的S-腺苷同型半胱氨酸水解酶基因sah1、S-腺苷甲硫氨酸脱羧酶基因spe2和L-甲硫氨酰tRNA合酶基因msm1,构建工程菌G/Dsah、G/Dspe和G/Dmsm。检测3个工程菌的生长和SAM产量,以及L-Met添加量对SAM积累的影响。【结果】与出发菌GS115/DS16相比,工程菌G/Dsah、G/Dspe和G/Dmsm的单位菌体SAM产量分别提高了29.3%、55.6%和24.8%,其生长无显著差异。L-Met添加量优化后(0.06%),G/Dsah和G/Dmsm单位菌体的SAM产量分别提高了26.4%和28.9%。【结论】构建的毕赤酵母工程菌可用于SAM的工业化生产,该代谢工程策略可用于改进其他化学品的生产。     

S-腺苷甲硫氨酸合成酶对埃博霉素生物合成的影响

【目的】研究S-腺苷甲硫氨酸合成酶(SAMs)对埃博霉素生物合成的影响。【方法】通过向发酵培养基中添加抑制剂和促进剂,比较分析纤维堆囊菌中SAMs的活性变化以及埃博霉素的产量变化。【结果】在埃博霉素的合成期,SAMs的活性较高。加入抑制剂吲哚乙酸(IAA)之后,SAMs的活性和埃博霉素的产量都不同程度的降低,而加入促进剂对甲苯磺酸钠(p-TSA-Na)之后,SAMs的活性和埃博霉素的产量在不同程度上都有提高。在纤维堆囊菌的次级代谢中,SAMs活性与埃博霉素的生物合成量呈正相关。【结论】S-腺苷甲硫氨酸合成酶在纤维堆囊菌的埃博霉素生物合成过程中发挥了重要的作用。     

刚毛柽柳ThPP2C基因的克隆和表达分析

蛋白磷酸酶2C（PP2C）是一类丝氨酸/苏氨酸蛋白磷酸酶,在体内以单体形式存在,由它催化的可逆磷酸化反应是细胞信号转导的重要组成部分,这一过程几乎参与所有的生理和病理过程。本研究从柽柳中克隆获得一条PP2C基因,命名为ThPP2C。该基因开放读码框（ORF）长849 bp,编码282氨基酸,推测蛋白质分子量为30.54 kDa,理论等电点为7.13。qRT-PCR结果显示,0.4 mol·L^-1 NaCl、20%（w/v） PEG₆₀₀₀、150 μmol·L^-1 ABA和100 μmol·L^-1 JA胁迫处理后,ThPP2C基因在刚毛柽柳根和叶中的表达均发生了明显改变,但时空表达模式不完全相同。NaCl、ABA和JA处理后ThPP2C基因在叶中都表现为下调表达。而根中,NaCl和JA胁迫后主要表现为上调表达。ABA处理早期表达下调,随后表达量逐渐增加。与其他3种胁迫不同的是,PEG₆₀₀₀处理后ThPP2C基因在根中明显下调,而在叶中胁迫早期表现不明显,48 h后被高度诱导。表明ThPP2C基因可能参与了刚毛柽柳高盐、干旱以及激素处理的适应过程,但其功能还有待进一步验证。     

刚毛柽柳ThDREB基因在酵母中的表达及抗逆能力分析

DREB蛋白能特异地与DRE（dehydration responsive element）顺式作用元件结合,从而调控下游多个与逆境相关基因的表达,在植物对多种逆境胁迫的应答反应中起重要调节作用。为了研究刚毛柽柳ThDREB基因是否具有抗逆功能,将ThDREB基因插入到酵母表达载体pYES2中构建成重组载体,转入酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）中获得重组型酵母。分别比较转ThDREB基因酵母和转空载体对照酵母在山梨醇、H₂O₂、CdCl₂、NaCl、Na₂CO₃、MgCl₂、-20℃胁迫处理之后的存活能力。结果显示,ThDREB基因能有效提高转基因酵母的抗干旱、盐、碱、氧化、重金属及低温胁迫的能力,表明ThDREB基因可能参与了柽柳多种抗逆调控过程。     

刚毛柽柳ThGRF2基因的克隆和渗透胁迫应答分析

14-3-3蛋白通常也称为通用调节因子（general regulatory factors,GRF）,是一类丝氨酸和苏氨酸磷酸化结合蛋白,通过与其他转录因子或信号蛋白相互作用参与调节细胞内基础代谢、信号传导、参与植物生长发育以及环境胁迫应答等一系列生理过程。本研究从刚毛柽柳干旱转录组中克隆获得一条干旱胁迫差异表达的ThGRF2基因。ThGRF2基因CDS片段全长为786 bp,编码261个氨基酸。相对分子质量为29.40 kDa,理论等电点（pI）为4.76。将ThGRF2基因构建到pROK2过表达载体上,瞬时转化刚毛柽柳,渗透胁迫前后生理指标结果显示,渗透胁迫后ThGRF2过表达提高了转基因柽柳的叶绿素含量、SOD和POD活性,降低了丙二醛（MDA）含量、电导率（EL）和失水率,表明ThGRF2基因在刚毛柽柳渗透胁迫应答中起重要作用。为进一步探究刚毛柽柳ThGRF2基因的非生物胁迫耐受性功能奠定基础。     

美国有机农业发展及对我国的启示

美国有机农业起步较早、发展迅速,已经成为全球有机农产品第一大消费市场,分析美国有机农业起源、发展、标识管理和财政支持对发展我国有机农业、提高我国农产品质量安全具有重要借鉴意义。     

柽柳金属硫蛋白基因的克隆及序列分析

用木麻黄(Casuarina glauca)的金属硫蛋白基因(metallothionein 1)氨基酸序列对柽柳ESTs序列本地数据库进行tBlastn检索,获得了柽柳金属硫蛋白基因全长cDNA序列,去除polyA后该基因全长366 bp,其中5′非翻译区97 bp,3′非翻译区59 bp,开放读码框(ORF)长210 bp,编码70 个氨基酸组成的多肽,蛋白分子量为6.793 kD,理论等电点为4.99,含10个Cys,集中分布在肽链的N端和C端。BlastP同源性分析表明该基因与花生同源性最高,与小豆同源性最低。该基因的EST序列在GenBank登录(登录号：CV792539)。     

刚毛柽柳天然居群遗传多样性初探

柽柳是荒漠地区主要的灌木资源树种。以刚毛柽柳为代表,运用RAPD技术分析了广布于新疆境内9个刚毛柽柳(Tamarix hispida L．)天然居群的遗传多样性及居群间的遗传分化。10条随机引物检测到157个可重复的位点,其中多态位点155个,占总位点数的98．7％。由Shannon表型多样性指数和Nei基因多样性指数估计居群间遗传分化百分比分别为62．5％和55．30％,表明刚毛柽柳种内的遗传变异主要存在于居群间。根据以上结果,我们认为新疆境内刚毛柽柳天然居群的遗传多样性很丰富,居群间分化程度较高;繁育系统属于一种自交和不完全异交混合的交配类型;形成并维持其分布格局的主要因素是基因流的隔离。     

刚毛柽柳基因组DNA提取和RAPD反应条件探索

沙漠植物由于含有多糖、多酚、单宁等次生物质,要提取出质量高、纯度好的DNA比较困难。本研究以刚毛柽柳（Tamarix hispida）为材料,用高盐低pH法成功地提取出了基因组DNA,所得到的DNA片段均大于23kb ,DNA得率为225μg/g干重,A260／A280的比值在1．7－1．9之间,说明高盐低pH法对于含多糖、酚类、单要等化学物质较多的沙漠是行之有效的,研究了RAPD（随机扩增DNA多态性）技术的影响因素,摸索出适合刚毛柽柳的反应体系与扩增条件,可用于刚毛柽柳居群内、居群间遗传多样性及柽柳科其它属种分子生物学的研究。     

柽柳(Tamarix androssowii)Tadir基因的克隆及分析

在柽柳cDNA文库测序中获得了Tadir基因的全长cDNA序列,去除PolyA后,该基因全长724bp。其中5′非翻译区26bp,3′非翻译区143bp,开放阅读框(ORF)长555bp,编码184个氨基酸。基因编码蛋白的分子量为19.69kD,理论等电点为6.96。疏水性分析表明,蛋白的前41个氨基酸为亲水性的。该基因的Genbank登录号为DQ462418(基因),ABE73781(蛋白)。实时荧光定量PCR分析结果表明,0.4mol·L-1NaCl和NaHCO3胁迫后该基因表达量发生变化,其可能与柽柳的耐盐性有关。