珍贵树种火力楠转录组SSR特征分析

为了全面了解珍贵乡土树种火力楠转录组SSR位点的分布及序列特征,为火力楠遗传资源的保存和合理开发利用提供遗传学资料,为同属植物及近缘种SSR标记的开发及遗传研究提供便利。利用Illumina Hiseq2000高通量测序平台对火力楠进行转录组测序,再通过MISA软件对测序所得Unigenes进行SSR位点的发掘和分析。分析的结果显示发现含SSR的序列21 218条,共得到27 379个SSR,出现频率为28.08%,平均约每3 kb出现1个SSR。单碱基和二碱基重复为火力楠SSR主要重复单元类型,分别占SSR总数的42.18%和35.66%,所有重复基元共85种,其中(A/T) n所占比例最高41.65%,然后是(AG/CT)n(29.47%)、(AAG/CTT)n (6.83%)和(AC/GT)n (4.11%)。在SSR和CDS的交集基因中,共发现24 668个SSR位点,其中3 805个位于编码区,出现频率为0.099 SSR/kb,而非编码区为0.287 SSR/kb,在基因编码区中出现频率最高的是三碱基重复(2 030, 53.35%)。在SSR序列长度方面,长度变化范围最大的为单碱基重复SSR,其次是二碱基重复。火力楠转录组SSR位点的出现频率高、分布密度大、基元类型丰富、重复次数较高、长片段较多,具有较高的多态性潜能,用于遗传分析的潜力很大,能满足该物种的保护遗传学研究。     

山地虎耳草转录组SSR信息分析

利用MISA（MicroSatellite）软件对山地虎耳草转录组拼接序列进行微卫星位点信息分析,为后期SSR标记的开发和物种遗传多样性检测提供候选序列。结果发现,在拼接得到的63 763条Unigene序列中含有4 622个SSR,发生频率为7.25%,有110种重复基元,平均每10.00 kB出现一个SSR位点。山地虎耳草转录组序列的SSR主要集中在三核苷酸重复（55.50%）,其次为二核苷酸重复（30.23%）。二核苷酸重复和三核苷酸重复中的优势重复基元分别为AG/TC和AAG/TTC。二核苷酸重复基元的重复次数类型最多,跨度最大,具有更高的多态性,三核苷酸次之,而四、五、六核苷酸重复类型很少。山地虎耳草转录组SSR以5~9次重复为主,且SSR数量随着重复次数的增加逐渐减少,基序长度主要集中于12~30 bp,多态性均在中等以上。     

基于转录组数据的杜仲红叶性状SSR分子标记分析

对‘华仲12号’杜仲的幼嫩叶片（绿色）和成熟叶片（红色）及‘华仲11号’杜仲成熟叶片（绿色）进行转录组测序,进行测序数据的拼接和组装,且对转录组获得的基因（Unigenes）进行SSR分析。研究得到54 517条平均长度为806.90 bp的Unigenes,其中25 993条Unigenes在Nr、Swiss-Prot、KEGG和COG蛋白数据库获得功能注释,占所有Unigenes的47.68%。参照KEGG数据库,可将注释到的6 910条Unigenes划分到122个代谢途径分支,其中花色苷代谢途径相关酶基因39个,类黄酮代谢途径38个,类胡萝卜素合成途径34个。54 517条Unigenes中共包含17 010个完整型SSR位点,占总SSR位点的96.28%。完整型SSR位点共包含67种重复基元,其中出现频率最高的重复基元类型为单核苷酸重复中的A/T （7 747个）,其次是AG/CT （5 039个）和AT/AT （850个）从花色苷代谢途径、类黄酮代谢途径及类胡萝卜素代谢途径中共找到13个SSR位点。为今后杜仲遗传多样性分析、遗传图谱构建及杜仲红叶性状分子标记开发等方面奠定了分子基础。     

基于高通量测序的怒江红山茶微卫星位点特征分析

以怒江红山茶叶片为材料,采用Illumina Hiseq 2000平台测序,共获得140 996条无冗余的序列,进行SSR位点搜索后,得到32 696个SSR位点,出现频率为23.2%。所搜索的SSR以二核苷酸重复类型最多,三核苷酸和单核苷酸次之,四、五、六核苷酸重复类型较少（<1%）。单核苷酸重复类型中以A/T基元较丰富（10.92%）;二核苷酸中AG/CT基元出现频率最大,达到49.72%,AT/AT基元和AC/GT基元所占比例相差不多,而CG/CG基元所占比例最少,为0.07%;三核苷酸重复类型中AAG/CTT最多,ACC/GGT、ATC/ATG和AGG/CCT基元次之,CCG/GGC、ACT/AGT和ACG/CGT基元较低,都小于1%;四、五、六核苷酸类型中各重复基元均较少。在怒江红山茶转录组中,微卫星的数量随着对应的重复类型、重复次数的增加而降低,也随重复区段碱基长度的增加而降低。     

基于枇杷转录组序列的SSR分子标记引物开发

为获得更多的枇杷SSR引物,对枇杷转录组测序得到的1 kb以上的11 798条Unigenes进行SSR位点搜索。结果在3515 条Unigenes（6.77%）中共获得4438个SSR位点,其中主要重复类型为双碱基重复和三碱基重复,二者占SSR总数的68.27%,而四、五、六碱基重复类型较少,仅占1.42%。对选出的SSR标记采用Primer3进行引物设计,得到7911 对SSR位点特异引物,可用于枇杷遗传多样性分析、分子标记辅助育种、育种群体的建立等研究。     

中间锦鸡儿转录组EST-SSR标记系统性识别与引物筛选

旨在对中间锦鸡儿转录组数据库EST信息进行SSR系统性识别和初步验证,为进一步SSR分子标记开发提供依据。对Hi Seq2000测序技术获得的中间锦鸡儿转录组Unigenes进行SSR位点搜索,共获得45 706个SSR位点,出现频率为10.38%,平均4.30kb出现一个SSR位点。SSR重复类型以单核苷酸重复序列基元为主,所占比例为56.47%;二核苷酸、三核苷酸重复序列基元的数量所占比例分别是20.56%和21.04%;其他数量的基元所占比例仅为1.9%。多核苷酸重复类型中最多的为2核苷酸重复AG/CT;其次为3核苷酸重复AAG/CTT。针对EST-SSR位点随机挑选了150对引物,通过琼脂糖凝胶电泳进行PCR验证,其中有79对能获得扩增条带,21对引物扩增出单一条带,比例为14.0%。     

星天牛转录组SSR位点特征分析

【目的】为了获得星天牛Anoplophora chinensis的SSR位点信息并开发其SSR分子标记技术,进一步为其遗传多样性以及综合治理提供理论依据。【方法】利用MISA软件,对星天牛转录组数据进行简单重复序列(SSR)位点筛选与分析;使用Primer3软件设计引物,采用PCR扩增以及电泳检测,筛选SSR引物,开发星天牛SSR分子标记技术。【结果】在9 325条unigene序列中共挖掘到2 360个SSR位点,出现频率为25.31%,涉及SSR位点序列1 758条,发生频率为18.85%。星天牛转录组中SSR的主要重复类型为单碱基重复,其次是三碱基重复,分别占总数的79.03%、12.54%。在核苷酸重复类型中,A/T基元种类数目最多,所占比例高达99.30%。SSR长度为10-11 bp的占比最高,为56.10%;重复次数为10次的数量最多,SSR位点数为1 188(50.34%)。重复次数和长度的分析结果对SSR位点的多态性获得了初步验证。在随机挑选序列设计的60对引物中,53对扩增产物达到预期大小,候选引物可用率高达88%,可在今后的研究中利用。【结论】本文对星天牛SSR位点的信息分析以及引物的设计与验证将有助于星天牛基因挖掘、种群遗传结构、遗传多样性、进化关系和综合治理的研究。     

基于转录组数据的黑腹胃蝇微卫星位点信息分析

黑腹胃蝇是中国新疆荒漠地区马科动物马胃蝇蛆病最主要的病原体。本研究基于已获得的黑腹胃蝇的转录组数据,利用MISA软件(1. 0版)对黑腹胃蝇转录组中1 kb以上的Unigene进行SSR位点分析。在黑腹胃蝇转录组25 847条Unigenes中筛选得到SSR总数为12 187个,存在于8 037条Unigenes当中,出现频率为31. 09%。微卫星的序列中单碱基(38. 39%)和三碱基(33. 45%)为优势重复类型。研究共发现103种重复基元,出现最多的为A/T (37. 52%),其次是AC/GT (13. 10%)。由三碱基构成的SSR基元占比较多,分别为15 bp (20. 94%),12 bp (14. 48%)和18 bp (14. 01%)。本研究是黑腹胃蝇开发EST-SSR的基础研究,为黑腹胃蝇的遗传多样性分析、变异水平分析和功能基因发掘奠定基础。     

基于转录组数据的荔枝蒂蛀虫SSR位点信息分析

荔枝蒂蛀虫Conopomorpha sinensis Bradley是专一性危害我国荔枝和龙眼的重要害虫。简单重复序列标记(Simple sequence repeat,SSR)为短串联重复序列或微卫星标记,其在荔枝蒂蛀虫偏嗜选择寄主的遗传进化机制研究和荔枝蒂蛀虫综合治理中具有重要意义。本研究基于高通量测序获得的荔枝蒂蛀虫转录组数据,利用MISA软件从68996条转录组unigenes结果中发掘出10521个SSR位点,出现频率为15.25%。荔枝蒂蛀虫转录组中SSR的主要重复类型为单碱基重复,占SSR总数的66.22%。其次是三碱基重复,占SSR总数的24.94%。在发现的33种重复基元中共筛选获得8种优势重复基元,其中A/T在单碱基重复基元中所占的比例达98.55%。基于筛选的SSR设计的9对引物中,有4对引物得到扩增预期大小的条带。荔枝蒂蛀虫SSR位点的信息分析将为探究荔枝蒂蛀虫种群遗传结构、遗传多样性和进化关系、害虫综合治理等研究提供重要科学依据。     

基于转录组的沙棘木蠹蛾简单重复序列特征分析

为开发沙棘木蠹蛾微卫星信息,利用已获得的转录组数据,对其EST-SSR位点进行发掘,进而分析其特征。结果发现含SSR的序列5126条,识别的SSR总数为7499个,SSR出现频率为51.41%。微卫星序列主要以单碱基重复为主,发生频率为39.52%。研究共发现77种碱基重复基元,所占比例最高的为(A/T)n(73.74%),其次是(AT/AT)n(3.37%)。微卫星多为重复次数为10且长度为10 bp的短序列。研究结果为沙棘木蠹蛾的SSR分子标记研究,遗传多样性分析,种群遗传结构以及关键性状基因的发掘等研究奠定基础。     

李白盾蚧转录组分析及SSR位点开发

李白盾蚧Pseudaulacaspis prunicola (Maskell)寄主范围广泛,是一种重要的入侵害虫。本研究利用高通量测序平台（Illumina NovaSeq 6000）对李白盾蚧进行转录组测序、de novo从头组装及功能注释,在此基础上筛选其微卫星（SSR）位点,并挖掘微卫星引物。研究共获得李白盾蚧转录组60 296条转录本,24 967条单基因（unigenes）序列。通过GO数据库注释,将所有unigenes的功能分为生物学进程、细胞组分和分子功能三大类41个亚类功能区。KOG数据库注释结果显示,5 085条unigenes归到25个基因家族,注释到一般功能预测的数目最多。KEGG代谢通路富集分析显示6 668条unigenes注释到280个代谢通路,其中注释到内质网中蛋白质加工的数目最多。利用MISA软件共搜索到微卫星位点18 193个,分布在9 043条unigenes中,占总unigenes数量的36.22%,平均每2.29 kb出现一个SSR位点。其中主要重复类型为单核苷酸重复,占SSR位点总数的72.03%,其次为三核苷酸重复（15.90%）和二核苷酸重复（8.48%）。单核苷酸重复主要为A/T（71.16%）,二核苷酸重复主要为AG/CT（5.20%）。基于Primer Primer 3软件设计出12 538对李白盾蚧SSR引物,从中随机挑选50对引物进行PCR验证,共29对引物可以稳定扩增出目的片段。本研究成功组装了李白盾蚧转录组数据,并基于转录组数据成功筛选出其微卫星位点,为未来该虫的种群遗传学以及入侵生物学研究提供了数据支撑。     

SSR allelic variation in almond (Prunus dulcis Mill.)

Sixteen SSR markers including eight EST-SSR and eight genomic SSRs were used for genetic diversity analysis of 23 Chinese and 15 international almond cultivars. EST- and genomic SSR markers previously reported in species of Prunus, mainly peach, proved to be useful for almond genetic analysis. DNA sequences of 117 alleles of six of the 16 SSR loci were analysed to reveal sequence variation among the 38 almond accessions. For the four SSR loci with AG/CT repeats, no insertions or deletions were observed in the flanking regions of the 98 alleles sequenced. Allelic size variation of these loci resulted exclusively from differences in the structures of repeat motifs, which involved interruptions or occurrences of new motif repeats in addition to varying number of AG/CT repeats. Some alleles had a high number of uninterrupted repeat motifs, indicating that SSR mutational patterns differ among alleles at a given SSR locus within the almond species. Allelic homoplasy was observed in the SSR loci because of base substitutions, interruptions or compound repeat motifs. Substitutions in the repeat regions were found at two SSR loci, suggesting that point mutations operate on SSRs and hinder the further SSR expansion by introducing repeat interruptions to stabilize SSR loci. Furthermore, it was shown that some potential point mutations in the flanking regions are linked with new SSR repeat motif variation in almond and peach. Electronic Supplementary Material Supplementary material is available for this article at and is accessible for authorized users.     

基于陆地棉茎尖转录组序列的genic-SSR标记的开发与评价

利用软件MISA和SSR Locator 对陆地棉（Gossypium hirsutum L.）Coker312茎尖转录组测序得到的73515条Unigene序列进行分析,查找到4507个SSR位点,分布于4039条转录本序列中,SSR出现频率为5.5%,非编码区的SSR位点要显著高于编码区（2853/1654）。SSR重复基元中,三核苷酸重复基元占主导地位（51.03%）,且AAG/CTT （20.08%）类型最多;其次是二核苷酸重复基元（28.76%）,主要为AG/CT（55.47%）。利用引物批量设计软件共开发1569对SSR引物,在陆地棉TM-1、海岛棉3-79 (G. barbadense L.)、阿非利加棉(G. herbaceum L.)、雷蒙德氏棉(G. raimondii Ulbrich.)四个棉种中进行初步评价,其中1117对引物能在四个棉种间扩增出稳定的条带,扩增率为71.2%。选择650对能稳定扩增出条带的引物,在涉及5个棉种（增加了亚洲棉（G. arboreum L.））的13份材料中进一步筛选,83对引物能在13份材料中扩增出特异性条带, PIC变幅在0.121～0.648之间,平均值为0.422,其中80对引物能在7份陆地棉材料中扩增出特异性条带,平均PIC值为0.336;挑选5对在本实验室作图亲本鲁棉研22和鲁原343间有明显多态的引物进行连锁分析,其中4对成功连锁到本实验室构建的遗传图谱上。本研究丰富了棉属genic-SSR的数量,为棉属遗传作图、性状关联分析提供了更多引物选择。     

药用资源植物山莨菪的转录组信息分析

为了增强对资源植物山莨菪的深入了解,本研究采用高通量测序技术对山莨菪进行转录组测序分析,经过处理得到71 463个Unigenes。通过与多个数据库进行比对,对基因进行分类和分析注释,最终成功获得注释的基因有47 624条。将Unigenes比对到KOG蛋白质库中,有13 110个基因被注释,共有26个子类;比对到NR库中后有39 621个Unigenes被注释;转录本与Swissprot、Tr EMBL的比对结果得到GO功能注释信息,注释得到的29 309个Unigenes可被分为分子功能、生物学过程和细胞组分3个大类,62个子类;以KEGG数据库为参考,3 679条基因被注释,参与的代谢通路可归为4个大类,分别是代谢相关的通路、遗传信息处理、细胞过程、环境信息处理,其中与代谢相关的通路最多,约占所有代谢通路的一半。对山莨菪的药用活性成分的代谢通路及相关Unigenes数量和类型的统计结果表明,与生物碱相关的代谢通路最多,萜类和苯丙素类所对应的Unigenes数量最多。另外,结果还检测到31 382个SNP位点,6种SSR重复类型,其中单碱基重复类型所占的比例最高,每百万碱基中出现的单碱基重复的SSR个数有56. 52个,占45. 30%。该结果丰富了山莨菪的转录组信息数据,为该物种分子生物学方面的研究奠定了基础,有助于进一步开展对山莨菪的合理保护及开发利用工作。     

柔嫩艾美尔球虫EST序列中SSR的获取及分析

对柔嫩艾美尔球虫EST—SSR进行生物信息学分析,共获取Eimeria tenella EST序列34074条,总长度为16．45Mb,小于12bpSSR的ESTs达7651条,从中获得SSR序列19576条、总长度为0．35Mb,EST—SSRs的频率是48．00％,平均相隔S40bp出现一个长度不小于12bp的SSR。在E．tenella的核苷酸重复基元中,2、3、4、5、6和7bp重复序列在基因组中出现的种类分别有11种472条、49种14710条、31种525条、13种25条、21种43条和15种400条,3碱基重复序列是最丰富的重复单元,占总数的75．14％。各种SSRs中富含G、C碱基的重复单元以GCA出现频率最多（28．63％）,次为AGC（17．59％）,GCT（8．76％）,TGC（7．62％）,CTG（7．15％）。     

基于转录组数据高通量发掘扶桑绵粉蚧微卫星引物

【目的】扶桑绵粉蚧Phenacoccus solenopsis Tinsley是我国重要的检疫性害虫。简单重复序列(simple sequence repeat,SSR)研究在遗传图谱和物理图谱的构建、分子标记辅助育种、品种鉴定、基因定位、遗传多样性、动植物分类和进化等方面具有重要意义。筛选的SSR引物将为扶桑绵粉蚧遗传多样性分析、进化分析及入侵生物学等奠定基础。【方法】利用高通量搜索的方法对扶桑绵粉蚧转录组中28 120条unigenes的数据进行搜索。【结果】共找到1 781个SSR位点。扶桑绵粉蚧转录组中SSRs的主要重复类型是单核苷酸重复,占SSR总数的89.44%;其次是三核苷酸重复,占SSR总数的7.52%。单核苷酸重复里主要是A/T基序,占了总量的87.42%。基于筛选的SSRs,运用Primer 3软件进行引物的批量设计,共有481个unigenes成功设计引物,共设计出1 228对引物。【结论】研究表明利用扶桑绵粉蚧转录组数据开发SSR标记是可行的,本研究开发的引物将为扶桑绵粉蚧遗传多样性分析、进化分析及入侵生物学等奠定基础。