麻疫霉诱抗激发蛋白的纯化及其特性

苎麻疫霉（ＰｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａｂｏｅｈｍｅｒｉａｅＳａｗ．）在Ｐｌｉｃｈ’ｓ培养液中产生的蛋白质用硫酸铵沉淀后,经ＤＥＡＥ－ＳｅｐｈａｒｏｓｅＦ．Ｆ．阴离子交换柱层析和ＨＰＬＣ层析,分离纯化出可诱发甜椒和三生烟产生过敏性坏死反应的激发蛋白（ｂｏｅｈｍｅｒｉａｅｉｎ）,经ＨＰＬＣ鉴定达到液相色谱纯,其分子量约为１０．６ｋＤ,ｐＩ为４．３２,氨基酸组成和Ｎ－末端２０个氨基酸序列与已报道的ｅｌｉｃｉｔｉｎ蛋白具有广泛的同源性。诱导抗病性测定表明,ｂｏｅｈｍｅｒｉａｅｉｎ可诱导非寄主三生烟和茄门甜椒产生过敏性坏死反应,并可诱导辣椒对疫病的抗性,其效果为３０～４０％。     

赤霉烯酮的微生物还原

用Rhodtorula sp.Saccharomyces sp.Arthorbacter sp.和Candida sp．四属20株菌对由Fusarium graminearum 产生的类雌激素——赤霉烯酮(Zearalenone)的还原转化进行了研究。实验结果证明,Rhodotorula sp和 Arthrobacter sp．的还原产物主要是α-赤霉烯醇(α-Zearalenol,经HPLC鉴定含量分别为96％和84％)。Saccharomyces sp．和Candidasp.的主要还原产物是β-赤霉烯醇(β-Zearalenol,经HPLC鉴定含量分别为91％和92％)。产物均经HPLC、13C—NMR和MS鉴定确证。     

F1-V重组亚单位疫苗对鼠疫耶尔森氏菌141强毒株皮下攻毒保护性的研究

在此实验中, 设计了一种包含2种成分的重组融合蛋白作为疫苗成分来防护鼠疫耶尔森氏菌(Yersinia)可能产生的生物威胁. 重组F1-V蛋白与铝佐剂结合, 分别以10, 20, 50 mg剂量免疫BALB/C小鼠, 周期为2个月. 检测小鼠血清抗体水平和T辅助细胞的亚型. 免疫后小鼠以25~600 LD₅₀剂量的鼠疫耶尔森氏菌141强毒株进行皮下攻毒实验. 结果证明, F1-V重组蛋白在 小鼠体内诱导产生足够保护的免疫应答. 血清IgG水平是产生最终保护力的一个重要因素. 20 μg的免疫剂量可以诱导血清抗体效价高达51200, 使小鼠对400 LD50的鼠疫耶尔森氏菌产生100%的保护. F1-V重组蛋白引发的抗体亚型主要为IgG1类, 说明抗体反应趋向Th2型反应. 流式细胞分析表明, 铝佐剂主要帮助F1-V重组融合蛋白诱导强烈的体液免疫而不是CTL细胞免疫应答.表明F1-V重组亚单位疫苗株有希望成为一种新型的鼠疫疫苗候选株.     

烟草曲叶双生病毒的研究 I．广西分离物的生物学特性和血清学反应

烟草曲叶病已在广西九个产烟县(市)发生危害,一般为零星发生,局部地区平均发病率高达50％以上,造成严重经济损失。试验结果表明,此病仅可通过嫁接和烟粉虱(Bemisiatabaci)传染,而汁液摩擦、种子和中国菟丝子((Cuscuta chinesis)不传病。除普通烟(Nicotianatabacum)外,还可侵染枯斑三生烟(N.tabacum var.xanthi N)、番茄(Lycopersicon esculentum)和蔓陀罗(Datura stramonium)等鉴别寄主,产生典型的曲叶症状。ELISA检测结果表明,病烟叶提取液与非洲木薯花叶病毒(ACMV)的两个单抗(SCR 18和SCR 23)呈阳性反应,而与另外两个单抗(ACMV SCR 11和ICMV(印度木薯花叶病毒)SCR 52)呈阴性反应,用ACMV单抗SCR 18免疫吸附法制片,在电镜下观察到球状成对或单个的病毒颗粒,单颗粒直径为18nm,成对颗粒大小为15—18x 25—30nm。     

玉米赤霉烯酮产生菌在我国的分布及其特性*

从全国29个省、自治区和直辖市分离到的镰刀菌中,随机抽取335株分别接种到大米培养基上,进行变温培养。用薄层扫描法定量检测培养物在不同温度阶段的玉米赤霉烯酮含 量。检测结果表明,50.7％的受检菌株具有产生玉米赤霉烯酮的能力,分布广泛,产量范围为0.3—5143.8mg/kg大米．玉米赤霉烯酮产置与低温无必然相关性。 125株菌株(占产生菌的73.5％)在常温下即可产生玉米赤霉烯酮。经低温处理后,它们之中仅有41.6％的菌株显著增加了产量。产生菌分属7个种：禾谷镰刀菌(F．Grammearum)大刀镰刀菌(F．Culmorum),燕麦镰刀菌(F．Avenaceum),半裸镰刀菌(F．Semitectum),木贼镰刀菌(F. equiseti),紧密 镰刀菌(F．Compactum)和克地镰刀菌(F. crookwellense)。其中,禾谷镰刀菌占85.3％。     

透明颤菌血红蛋白在肉桂地链霉菌中的表达对其细胞生长及抗生素合成的影响

肉桂地链霉菌(S.cinnamonensis)是莫能菌素(Monensin)的产生菌。大肠杆菌链霉菌穿梭表达载体pHZ1252中的透明颤菌血红蛋白基因(vhb)位于硫链丝菌素诱导启动子P_tipA之下,它在肉桂地链霉菌中的结构不稳定,发生了重组缺失,缺失的片段包括大肠杆菌质粒部分和vhb基因。但来自阿维链霉菌(S.avermitilis)中缺失了大肠杆菌质粒部分却保留了完整的vhb基因及tipA启动子的pHZ1252,可在肉桂地链霉菌中稳定复制,不再发生缺失,经硫链丝菌素诱导表达出了有生物活性的VHb蛋白。摇瓶发酵实验证明,VHb蛋白在氧限条件下可明显促进肉桂地链霉菌的菌体生长和抗生素合成。     

三角酵母D-氨基酸氧化酶基因的克隆、测序及表达*

利用跨越内含子的PCR技术,三角酵母(Trigonopsos variabilis)变种FA1-10中扩增得到D-氨基酸氧化酶基因(daao),并通过TA克隆的方法将其克隆至pGEM—T载体。序列测定结果表明,所得daao基因的5’端内含子已被删除,基因总长度为1071bp,它与Trigonopsis variabilis D-氨基酸氧化酶同源性达98.3％,与Fusarium solanii和Rhodotoru-la gracilis的同源性分别是38.9％和30.8％。为提高表达水平,又将此基因转移至高表达载体pET-28b上．在大肠杆菌BL-2l(DE3)中进行诱导表达。经IPTG诱导,目的蛋白的产生量可占菌体总蛋白量的46％,分子量约为38kD。D-氨基酸氧化酶的活力可达802u／L。     

热休克反应与哺乳动物高海拔(缺氧)适应

利用免疫学和分子生物学手段研究哺乳动物的高海拔(缺氧)适应, 通过哺乳动物热休克反应, 了解热休克蛋白在生物体高海拔(缺氧)适应中的意义. 用Western blot和常规RT-PCR及实时荧光定量PCR(real-time PCR detection)测定不同海拔哺乳动物(牦牛)心肌组织热休克蛋白70(Hsp70)的表达差异和脑组织中Hsp70基因的自然表达. 将低海拔哺乳动物(家兔)直接送达不同高海拔地区(海拔2300, 3300, 5000 m)喂养3周后宰杀, 再用RT-PCR测定其脑组织中Hsp70基因的诱导表达. 结果显示: 不同海拔哺乳动物都具有热休克反应基因, 应激时高海拔哺乳动物Hsp70表达快速升高; Hsp70可被高海拔(缺氧)诱导产生. 热休克反应中Hsp70的快速合成有利于维持应激时细胞的正常生理功能, Hsp70的表达存在着阈值, 海拔5000 m是热休克反应最佳的条件, 超过海拔6000 m时热休克反应减弱; Hsp70生成量与细胞的耐缺氧能力成正比.     

中国链格孢属的分类研究IV.生于夹竹桃科和番木瓜科植物上的新种和新变种

报道生于夹竹桃科(Apocynaceae)植物上的链格孢新种2个、新变种2个,即络石链格孢(Alternaria trachelospermi T. Y. Zhang,X. F. Lin et W．Q．Chen)、细极链格孢络石生变种[A.Tenuissima (Nees ex Fr.) Wiltshire var．Trachelospermicola T. Y. Zhang,X. F. Lin et W. Q.Chen]、细极链格孢长春花变种[A. tenuissima (Nees ex Fr．) Wiltshim var catharanthi T. Y. Zhanget X. F. Lin]和长春花生链格孢(A. catharanthicola T．Y Zhang),及生于番木瓜科(Caricaccae)植物上的番术瓜链格孢(A. caricae T. Y. Zhang,W．Q Chen et X. F. Lin)。新种和新变种均有拉丁文特征描述,并附绘图。新分类单位的模式标本分别存放在西北农业大学真菌标本室(HMUABO)和山东农业大学植物病理标本室(HSAUP)．     

肠杆菌膦酸酯代谢途径中phnF基因的研究

大肠杆菌的phn操纵子与膦酸酯(Pn)的利用密切相关。实验利用PCR扩增、TA克隆等方法．获得了大肠杆菌phn操纵子中phnE、phnF和phnG基因的亚克隆,并进行了序列测定。通过P1噬菌体转导,构建了phnF的TnphoA’-9转座子插入突变体JW19,该突变仅对大肠杆菌的AEPn同化有微弱的影响,而利用phnE和phnG序列与染色体重组构建的phnF全缺失突变株JW67,则几乎不能在．AEPn培养基上生长。通过phnF基因的诱导高表达,用亲和柱层析分离纯化了PhnF。蛋白,达到电泳纯。并且用凝胶延滞的方法观察到,PhnF蛋白与加phn操纵子DNA片段相互作用后,可使凝胶图谱类型发生改变。     

柑桔碎叶病毒研究

用汁液摩擦接种方法对柑桔碎叶病毒(Citrus tatter leaf virus,CTLV)进行了进一步的生物学鉴定.结果表明,该病毒除在豇豆上引起枯斑外,还侵染克里芙兰烟(Nicotianaclevilandii)产生系统斑驳和轻花叶,侵染昆诺藜(Chenopodium quinoa)和苋色藜(C.amaranticolor)引起系统坏死和花叶,侵染鸡冠花(Celosia cristata)引起局部环斑.这些草本寄主均可作为CTLV的指示植物.在发病的柑桔叶汁液中,测得CTLV的稀释限点为10~(-5).经汁液摩擦接种,可以将CTLV从克里芙兰烟传播到木本指示植物柑桔和枳橙上.感病植物材料的组织超微结构观察结果表明:CTLV感染柑桔、枳橙、克里芙兰烟和昆诺藜均使其叶肉薄壁细胞的叶绿体出现淀粉沉积、叶绿体片层结构解体和消失;病毒在受感染的植株叶脉韧皮部细胞中紧密聚集,形成病毒结晶体;这种结构也出现在叶肉薄壁细胞中.这是关于该病毒组织病变的首次报道.用直接负染方法从感染CTLV的柑桔(枳橙)、克里芙兰烟和昆诺藜病叶中均能检查到线状病毒粒子,用改良的Deriick’s免疫电镜方法和琼脂双扩散方法测定均显示该病毒…     

嗜水气单胞菌外膜蛋白基因ompTS的高效表达及其免疫原性

根据嗜水气单胞菌外膜蛋白基因ompTS的核苷酸序列设计引物,运用聚合酶链式反应（PCR）扩增出与预期大小相符的基因片段。将此基因片段克隆至质粒pRSET A的BamHI和EcoRI位点,构建重组质粒,转化大肠杆菌BL21（DE3）,经IPTG诱导获得高效表达,SDS-PAGE蛋白电泳表明在39.9kD处出现超强特异带,占总蛋白的51％。以 Ni-NTA-Conjugate抗体进行Western blot分析证明该399kD的蛋白为所表达的融合蛋白。纯化融合蛋白注射雄性新西兰大白兔可诱导产生特异抗体。ELISA和Western blot检测结果显示,该抗体与表达的融合蛋白和从嗜水气单胞菌中提取的36.9 kD外膜蛋白均呈阳性反应,表明所表达的融合蛋白仍保持原有外膜蛋白的免疫原性,为此融合蛋白作为疫苗的候选成份提供理论基础。     

外源性双链RNA对小鼠卵母细胞basonuclin基因表达的影响

在植物及低等动物线虫中, 引入外源性双链RNA(dsRNA)会导致细胞中同源mRNA降解, 从而干扰其内源基因的表达, 这可能是有机体防范病毒或转座子诱导DNA突变的一种生理机制, 称为RNA干涉(RNA interference, RNAi). 利用RNAi研究basonuclin基因在卵母细胞发生过程中的功能. 将basonuclin特异的dsRNA导入小鼠生发泡期卵母细胞, 可有效降低其mRNA的丰度, 这种降解作用与dsRNA的浓度及作用时间成正比, 但不影响非同源基因的表达, 证明basonuclin dsRNA能特异识别、降解其内源基因的转录产物. 免疫组化实验显示, dsRNA能降低卵母细胞中basonuclin蛋白的水平, 但其效率不如RNAi对tPA及cMos基因活性的抑制, 这可能是由于basonuclin蛋白的半衰期较长, 而生发泡期卵母细胞在体外存活时间较短. 结果表明, dsRNA能阻抑卵母细胞中同源基因的表达, 其作用相当于基因敲除. 质粒表达的发夹环型dsRNA也可以有效降解basonuclin转录产物, 这为研究basonuclin在卵母细胞发育早期的功能提供了新的手段.     

链霉菌来源的UDP_葡萄糖_4_差向异构酶基因的克隆表达及酶性质研究

经同源性比较,链霉菌139（Streptomyces sp.139）产生胞外多糖依博素的生物合成基因簇中ste19 基因编码的蛋白Ste19与UDP_葡萄糖_4_差向异构酶有较高同源性。将ste19 基因克隆至质粒pET30a,在大肠杆菌BL21(DE3)中进行了异源表达。产生的可溶性Ste19重组蛋白,占细胞总蛋白的26%,说明该基因高GC含量（73.8%）及第三位碱基偏向使用GC(96.2%)并未影响其高效表达。SDS_PAGE结果显示重组蛋白的分子量约37kD,与理论推测值基本相同。经亲和层析纯化后得到了较高纯度的重组蛋白,经HPLC分析纯度为92.9%。酶活性分析表明：Ste19蛋白可将UDP_葡萄糖转化为UDP_半乳糖,因此,Ste19蛋白是UDP_葡萄糖_4_差向异构酶,它可能参与了依博素的生物合成。     

四环素-绿色荧光蛋白融合蛋白的构建及其活性测定

将来源于水母的绿色荧光蛋白基因 (gfp)和来源于E .coli转座子Tn10的四环素阻遏蛋白基因 (tetR)共同构建到E .coli表达载体pET_30a +上 ,获得TetRC_端与GFPN_端融合蛋白。对经诱导表达并纯化后的融合蛋白 (TR∷GFP)进行荧光发射光谱分析表明 ,该融合蛋白保留了GFP的荧光特性 ,即在 395nm激发下 ,可在 5 10nm附近有特征发射峰。在加入四环素后 ,融合蛋白在 395nm激发下 ,在400nm～700nm范围内的发射光谱发生明显变化 ,荧光强度普遍增加 ,且以 510nm处最大发射峰增幅最大 ,由原来 1132增至 2214 ,而四环素对相同浓度的GFP与TetR荧光影响不大 ,结果表明该融合蛋白 ,能感受外界四环素 ,并产生一定的荧光变化。     

苏云金芽孢杆菌δ－内毒素crylA?基因在大肠杆菌和变铅青链霉菌中表达

利用合成的寡聚核苷酸片段,从质粒pOS1000中分离出具有适合克隆位点的苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis )δ－内毒索crylA?全长基因。将该基因与大肠杆菌表达载体pKK223-3重组,并引入大肠杆菌JMl09中,经IPTG诱导．获得了超量表达的CryIA?蛋白。将crylA?全长基因插入链霉菌表达载体pHZl272中,得到重组质粒pHZl256,将该质粒引入变铅青链霉菌(Streptomyces　lividans)JT46中,经硫链丝菌素诱导．通过Westerablotting测定表明,重组变铅青链霉菌JT46(pHZl256)已表达出相应的CrylA?蛋白。杀虫试验表明,大肠杆菌和链霉菌所表达出的δ－内毒索crylA?对小菜蛾均有毒杀作用,其致死率分别为93％和57％。     

一氧化氮和氧自由基诱导缺氧再给氧心肌细胞凋亡的bcl-2和p53信号通路研究

观察了心肌缺氧再给氧损伤的一氧化氮(nitric oxide, NO)和氧自由基机制. 新生Wistar大鼠心肌细胞置于95% N₂ /5% CO₂环境培养24 h, 然后置于95% O₂ /5% CO₂环境培养4 h造成缺氧再给氧心肌细胞损伤模型. 单纯缺氧组心肌细胞置于95% N₂/5% CO₂环境培养24 h, 但不再给氧. NO供体硝普钠(SNP, 5 mmol/L)、NO合酶抑制剂Nw-硝基-L-精氨酸甲酯(L-NAME, 100 mmol/L)和其异构体Nw-硝基-D-精氨酸甲酯(D-NAME, 100 mmol/L)以及超氧化物歧化酶/过氧化氢酶(SOD/CAT, 各100 U/mL)分别于缺氧前加入培养基. 正常对照组心肌细胞置于95% 空气/5% CO₂环境下培养. 结果显示, 缺氧24 h能增加培养介质中NO, 硫代巴比妥酸反应产物(TBARS)和乳酸脱氢酶(LDH)水平, 再给氧降低培养介质中NO和 水平, 增加TBARS和LDH水平. 缺氧上调bcl-2和p53和p21/waf1/cip1蛋白表达水平, 而再给氧下调bcl-2蛋白表达水平, 上调p53和p21/waf1/cip1蛋白表达水平. 同时, 缺氧增加心肌细胞凋亡率, 而再给氧增加心肌细胞坏死率. NO供体硝普钠(SNP)增加培养介质中 和TBARS水平, 下调bcl-2蛋白表达而上调p53和p21/waf1/cip1蛋白表达水平, 增加DNA断裂、凋亡及坏死细胞率. L-NAME和 SOD/CAT分别降低培养介质中 和TBARS水平, 它们均能上调bcl-2蛋白表达而下调p53和p21/waf1/cip1蛋白表达水平, 抑制DNA断裂、凋亡及坏死细胞率, 而D-NAME则无此作用. 以上结果表明, 在缺氧再给氧所致心肌细胞死亡过程中, NO和氧自由基参与下调bcl-2蛋白表达水平和上调p53和p21/waf1/cip1蛋白表达水平, 相应地激发细胞凋亡程序, 并提示一氧化氮及氧自由基诱导心肌细胞凋亡的机制与调节 bcl-2和p53和p21/waf1/cip1信号通路有关.     

核盘菌属一新种——人参核盘菌

本文报道了采自人参(Panax ginseng C. A．Mey (保留名nom. Coiiscry))的核盘菌属一新种——人参核盘菌(Sclerotinla．Ginseng Wang C. R.,C. F. Chen et J. Chen)。该种在形态学以及可溶性蛋白、果胶(甲)酯酶和多聚半乳糖醛酸酶谱带等方面,均不同于已知种核盘菌(S. sclerotiorum (Lib．)de Bary),小核盘菌(S. minor Jagger)车轴草核盘菌(S．Trifoliorum Erikss．)和细辛核盘菌(S．Asari Wu et C．R. Wang)。模式标本(800719)保存于沈阳农业大学植物免疫研究室。     

恶性疟裂殖子表面蛋白1合成基因在毕赤酵母中的表达

恶性疟原虫裂殖子表面蛋白1是当今疟疾疫苗主要的候选抗原。由于天然MSP1基因AT含量异常高(为74%),使得克隆全长天然基因无法实现。本文已全合成了msp1基因(4940bp),解决了该天然基因在异源系统中不稳定的问题。为制备大量msp1重组蛋白进行疫苗有效性试验,本研究建立了msp1基因在毕赤酵母中的表达,将合成的msp1基因克隆到毕赤酵母胞内表达载体pPIC3.5,构建了重组质粒pPIC3.5/msp1,用电击转化毕赤酵母得到重组转化子,经PCR证实msp1基因已整合于毕赤酵母染色体中。含有重组表达质粒的毕赤酵母菌经甲醇诱导后表达出全长msp1重组蛋白。表达产物能与识别MSP1分子二硫键依赖构象表位的特异性单抗发生很强的反应,表明msp1重组蛋白至少在该表位构象上与天然蛋白一致。从毕赤酵母中分离得到大量msp1为开展该蛋白的结构与功能,特别是测定其疟疾保护性免疫提供可能。     

异常汉逊酵母BD102金属硫蛋白的分离纯化和鉴定

从异常汉逊酵母中分离出拮抗Cu²⁺、Cd²⁺等重金属、并经铜、镉诱导产生金属硫蛋白的异常汉逊酵母 (Hansenulaanomala)BD1 0 2。无细胞抽提液经SephadexG 50、DEAESepharoseCL 6B、SephadexG 2 5三次凝胶及阴离子交换柱层析分离纯化 ,Cu²⁺诱导得到Cu MTs两个亚型 ,Cd²⁺诱导得到Cd MT一个亚型。Mr分别约为 7kD和 7 5kD ,由 60和 61个氨基酸组成 ,其中半胱氨酸含量各为 6.8%和 1.0 %。每分子金属硫蛋白 (Cu MTs或Cd MT)可结合 4个铜或镉原子