中国红豆杉细胞经重复诱导和蔗糖饲喂后云南紫杉烷C生产的相应基因表达变化

红豆杉悬浮培养细胞具有可持续生产抗癌药物紫杉醇及其他紫杉烷的潜力。在中国红豆杉悬浮培养细胞中,云南紫杉烷 C(Tc) 是主要的次生代谢产物。为促使代谢前体由生成其他紫杉烷的代谢支路转到生产紫杉醇,实验采用实时定量PCR技术 (RQ-PCR) 揭示细胞培养过程中紫杉醇及紫杉烷合成关键基因的动态变化。在细胞培养的第7天和第12天,以100 μmol/L 2,3-二羟丙基茉莉酸 (DHPJA) 进行诱导,同时在第7天饲喂20 g/L的蔗糖,在此过程中考察6个关键基因 (TASY,TDAT,T5αH,TαH,T10βH和T14βH) 的表达变化。上述联合调控手段使得Tc产量在第1次诱导8 d后达 (554.46±21.28) mg/L,第2次诱导9 d后高达 (997.72±1.51) mg/L。代谢早期基因TASY和TDAT在第1次诱导后表达量分别提高了182和98倍,在第2次诱导后表达量分别提高了208和131倍。在每次诱导后基因表达量提高约持续24 h,之后下降。其他4个基因 (T5αH、TαH、T10βH和T14βH) 的情况有所不同。基因TαH在2次诱导后表达量分别提高了3 061和1 016倍。其他3个基因T5αH、T10βH、T14βH在第1次诱导后表达量分别提高13、38、20倍,在第2次诱导后分别提高7、16、6倍。RQ-PCR结果表明基因表达和Tc积累之间存在紧密相关性：基因表达的变化与Tc产量的变化相一致,诱导可提高6个基因的表达量。基因的高表达随着培养过程逐渐衰减,再次诱导可再次促使基因的高表达。     

基于定量PCR技术探讨紫杉醇生物合成的限速步骤

次生代谢产物牛物合成受到发育和诱导的调控,本实验研究了组织分化和诱导处理对紫杉醇生物合成的影响,并采用定量PCR技术分析了紫杉醇生物合成不同阶段关键酶基因的动态表达特征。结果表明。紫杉醇主要分布在中国红豆杉（Taxus chinensis）树皮和根皮组织中,针叶内含量很少,催化紫杉醇功能官能团连接的关键酶摹因也主要定位在树皮和根皮组织巾;茉莉酸甲酯（MJ）和真菌诱导子F5分别提高了中国红豆杉悬浮培养细胞HG-1紫杉醇得率8倍和10倍,同时有效诱导紫杉醇生物合成基因的表达。发现催化紫杉醇侧链连接的基因与紫杉醇生物合成早正相关。结果表明。紫杉醇生物合成的限速步骤是催化功能官能团连接的步骤。     

过表达Bapt基因提高中国红豆杉细胞的紫杉醇产量

过表达紫杉醇合成关键酶基因是提高红豆杉细胞紫杉醇产量的有效方法.本文通过构建C-l3苯丙素侧链CoA-乙酰转移酶 (C-13 phenylpropanoid side chain CoA acetyltransferase,BAPT) 基因Bapt的表达载体p1303-SbaptN, 采用根癌农杆菌介导法转化中国红豆杉细胞,经潮霉素抗性筛选获得转基因细胞系.转基因细胞的PCR和Southern印迹分析结果表明,T-DNA及其包含的基因与宿主细胞染色体成功整合;Western印迹结果表明,转基因细胞中报告基因GusA-mgfp5正常表达;QRT PCR结果显示,转基因细胞的Bapt mRNA表达量是未转化细胞的1.26 倍;HPLC检测结果显示,转基因细胞的紫杉醇产量为37.4 μg/g,是未转化细胞的1.87倍. 本研究结果表明,过表达Bapt基因提高了中国红豆杉细胞的紫杉醇产量     

促进紫杉醇合成真菌诱导物制备方法的选择及组分的分离

红豆杉细胞培养被认为是一种解决紫杉醇药源短缺的潜在有效方法之一[1] ,但普遍存在着红豆杉属植物离体细胞的紫杉醇产量比较低的问题。诱导子是一种可引起植物细胞过敏反应的特定生化信号 ,能快速、高度专一地诱导植物特定基因的表达 ,因此 ,利用诱导子刺激以提高红豆杉细胞中紫杉醇产量是目前国内外研究热点 [2 4 ]。但这些研究主要集中有效诱导子的筛选 ,而关于诱导子的制备方法对诱导紫杉醇生物合成的活性研究则甚少。为了提高诱导子的诱导活性 ,笔者以从中国红豆杉树皮中筛选出证明有效诱导紫杉醇的真菌 F5为菌种 [2 ] ,研究不同制备…     

红豆杉细胞培养生产紫杉醇产量稳定性的探讨

通过磷酸盐双饥饿和秋水仙碱这两种经典的同步化方法处理悬浮培养的红豆杉细胞 ,以实现培养物的均一性 ,并比较了同步化与非同步化细胞及不同同步化方法处理的细胞紫杉醇产量。结果表明 ,不同同步化方法处理的细胞紫杉醇产量有差异 :秋水仙碱同步处理处于中期的细胞紫杉醇产量高于非同步化细胞 ,而磷酸盐双饥饿同步处理处于间期的细胞紫杉醇产量则相反。这表明紫杉醇产量与培养物的均一性有关 ,且与细胞同步的周期时相有关 ,采用同步化方法来选择合适的细胞周期时相有利于紫杉醇产量的稳定 ,通过比较不同同步化方法处理对细胞生物量和 POD活性的影响进一步探讨紫杉醇产量产生差异的原因     

曼地亚红豆杉细胞系的建立与评价

红豆杉(Taxus)细胞内紫杉醇的含量低且不稳定,限制了利用细胞培养大规模生产紫杉醇的产业化进程。以紫杉醇含量较高的曼地亚红豆杉(Taxus m edia)为试材,诱导得到了曼地亚红豆杉愈伤组织,在添加抗坏血酸(VC)、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、活性炭(activated carbon)的改良B5培养基上,15次反复继代培养后获得了高产紫杉醇的细胞系。对新建立的曼地亚红豆杉细胞系(MC)与同期诱导的东北红豆杉细胞系(NC)及实验室继代多年的中国红豆杉细胞系(SC)在细胞生长周期、紫杉醇含量和细胞死亡率等方面进行了分析比较。结果表明,SC的生长量达5.9倍,高于MC和NC的3.6和4.2倍。在初始接种量相近的情况下,MC的悬浮培养细胞在一个周期内紫杉醇产量可达9.5 mg/L,经过茉莉酸甲酯(M J)诱导后可达到41 mg/L。     

Clomazone对中国红豆杉细胞培养的影响

以中国红豆杉（Taxus chinensis）悬浮细胞为材料,研究了Clomazone（广灭灵）对培养细胞生长及紫杉醇和糊胡萝卜素合成的影响。探讨紫杉醇生物合成途径人工调控的方法。结果表明在细胞培养第20d加终浓度为20mg/L的Clomazone,对细胞生长影响较小,紫杉醇含量最高,达4263μg/L,约为对照的3倍。Clomazone可以抑制红豆杉细胞类胡萝卜素的合成,其对紫杉醇产量的提高可能与其抑制类胡萝卜素的合成有关。Clomazone与Methyl jasmorale (MJ)及Chloroholine chloride（CCC）对紫杉醇含量的提高有协同作用。     

茉莉酸甲酯对紫杉醇生物合成的诱导作用

本文采用分裂素自养型中国红豆杉细胞株 ,研究了在细胞悬浮培养过程中茉莉酸甲酯 ( MJ)对紫杉醇生物合成的诱导作用。结果表明 ,以乙醇为 MJ助溶剂时 ,MJ的诱导作用以剂量为 2 0 0 μmol/L于继代培养开始时加入为最佳 ,此时紫杉醇产量较对照组提高 71.2 %。以吐温为 MJ助溶剂时 ,MJ的诱导作用以剂量为 10μmol/L于继代培养 d2 0加入为最佳 ,此时紫杉醇产量较对照组提高 2 80 .7%。此外 ,本文对 MJ的诱导作用机理进行了探讨。     

诱导子对红豆杉培养细胞紫杉醇产量的影响

利用红豆杉细胞培养技术生产紫杉醇是目前紫杉醇生产的研究热点之一,并已取得了较大进展,其中如何提高紫杉醇的产量是研究的关键。目前通过促进紫杉醇代谢来提高产量最常用、最重要的方法之一是添加诱导子。这是来源于病原微生物的一类化学物质,具有诱导植物细胞中防卫基因表达诱发植物过敏反应和促进植物细胞中特定次生代谢产物的合成等多种功能。就近年来在红豆杉细胞培养生产紫杉醇方面的研究进展进行简要论述,着重介绍了添加诱导子在促进紫杉醇生物合成中的应用。     

联合调控对中国红豆杉细胞关键酶基因表达的影响

红豆杉悬浮培养细胞可以持续提供抗癌药物紫杉醇及一些紫杉烷类。在中国红豆杉悬浮培养细胞中,云南紫杉烷C(Tc)是主要的紫杉烷。为了更理性地调控紫杉醇或有用紫杉烷的生产,有必要深入了解其生物合成过程。采用实时定量PCR(Real-time Quantitative PCR,即RQPCR)技术考察经调控后紫杉醇及紫杉烷代谢中关键酶基因—TASY,T5αH,TDAT,T10βH,TαH,T14βH表达水平的变化。在细胞培养的第7天和12天,分别以100μmol/L2,3-二羟丙基茉莉酸(DHPJA)诱导,同时在细胞培养第7天进行20g/L蔗糖饲喂、100g/LXAD-7HP的原位吸附。该联合调控处理使得细胞培养第30天时,Tc产量高达1517±37mg/L,是对照处理的11.1倍,是DHPJA重复诱导联合蔗糖饲喂处理的1.7倍。RQ-PCR结果显示:DHPJA的加入可使6个基因表达水平显著提高,但在12小时后快速下降,需补充DHPJA以再次提高基因表达水平。吸附剂同时引入会延缓基因表达水平的提高速度,但却能维持基因表达处于一个较高的水平,表现为在细胞培养中后期,基因表达水平将显著高于无吸附剂的调控体系。与13α-羟化相对应的TαH基因有所不同,吸附剂的存在更显著地抑制其表达,但仍有维持表达的功能。     

茉莉酸甲酯与真菌诱导物、水杨酸组合对红豆杉细胞中紫杉醇含量的影响

比较了茉莉酸甲酯与真菌诱导物、水杨酸组合对红豆杉细胞几个抗病相关指标（POD、CAT活力、H2O2含量）及紫杉醇含量的影响,3种信号分子的组合对POD、CAT、H2O2及紫杉醇含量的影响是不一致的,MJ单独添加,MJ与SA联合作用以及MJ与F5联合作用都可使POD活力增加,且12h后H2O2含量均升高,约在48h达到高峰,为对照的2倍左右,但72h后,MJ单独添加和MJ与SA联合作用组中H2O2含量变化不大,F5与MJ联合作用则使H2O2含量持续比对照高。MJ单独添加使CAT酶活在144h后才较对照低,F5、SA的加入都可使CAT酶活下降,SA的作用更显著。说明三者的诱导途径并不完全一样,以SA和MJ联合添加对紫杉醇合成的促进作用最大,含量达到细胞干重的0．04％。     

Induction of survivin expression by taxol (paclitaxel) is an early event, which is independent of taxol-mediated G2/M arrest

Survivin is a novel anti-apoptotic protein that is highly expressed in cancer but is undetectable in most normal adult tissues. It was reported that taxol-mediated mitotic arrest of cancer cells is associated with survivin induction, which preserves a survival pathway and results in resistance to taxol. In this study, we provide new evidence that induction of survivin by taxol is an early event and is independent of taxol-mediated G(2)/M arrest. Taxol treatment of MCF-7 cells rapidly up-regulated survivin expression (3.5-15-fold) within 4 h without G(2)/M arrest. Lengthening the treatment of cells (48 h) with taxol resulted in decreased survivin expression in comparison with early times following taxol treatment, although G(2)/M cells were significantly increased at later times. Interestingly, 3 nm taxol induces survivin as effectively as 300 nm and more effectively than 3000 nm. As a result, 3 nm taxol is ineffective at inducing cell death. However, inhibition of taxol-mediated survivin induction by small interfering RNA significantly increased taxol-mediated cell death. Taxol rapidly activated the phosphatidylinositol 3-kinase/Akt and MAPK pathways. Inhibition of these pathways diminished survivin induction and sensitized cells to taxol-mediated cell death. A cis-acting DNA element upstream of -1430 in the survivin pLuc-2840 construct is at least partially responsible for taxol-mediated survivin induction. Together, these data show, for the first time, that taxol-mediated induction of survivin is an early event and independent of taxol-mediated G(2)/M arrest. This appears to be a new mechanism for cancer cells to evade taxol-induced apoptosis. Targeting this survival pathway may result in novel approaches for cancer therapeutics.     

小鼠胸膜纤维化模型中CX43蛋白的动态表达

目的研究博莱霉素诱导的小鼠胸膜纤维化模型中间隙连接蛋白CX43的动态表达变化,以阐明胸膜损伤而导致纤维化的机制。方法采用胸膜腔内注射博莱霉素和碳粉复制小鼠胸膜纤维化模型,分别于注射后第2,7,21d取肺及胸膜组织,免疫组化法测定CX43蛋白表达和Masson染色检测胸膜胶原表达情况。结果第2d胸膜开始增厚,以炎症细胞浸润为主,第7d胸膜增厚达到高峰,第21d胸膜变薄;胶原表达则从第7d开始增多,21d达高峰;CX43表达第2d增多,第7d达高峰,第21d较低,但均高于对照组（P〈0．05）。结论小鼠胸膜纤维化模型中,胸膜组织CX43的表达上调,并且与胸膜炎症反应有关。     

CDK1 siRNA干扰在Taxol诱导细胞凋亡中的作用

目的研究转染细胞周期依赖性蛋白激酶1（cyclin．dependent kinase1,CDK1）siRNA、以及转染后进行凋亡刺激对细胞周期和凋亡的影响,探讨CDK1在细胞凋亡中的确切作用,揭示细胞周期与细胞凋亡协调的分子机制。方法以人宫颈癌细胞株HeLa细胞为研究对象,脂质体转染CDK1siRNA,转染后48h加紫杉醇（Tax01）（20μg／m1）刺激凋亡,Western印迹检测CDK1和抗凋亡蛋白BCL2表达,AnnexinV／PI法检测细胞的凋亡,流式细胞仪分析DNA含量检测细胞周期。结果转染CDK1 siRNA后,CDK1蛋白的表达下降,细胞周期G2／M期比例增加,细胞凋亡率与对照相比没有明显升高。只加Taxol刺激12h后细胞凋亡率增加并伴有S期和G2／M期比例增加。转染CDKlsiRNA后再用Taxol刺激,其细胞凋亡率没有明显改变,G2／M期阻滞效应也没有叠加。BCL2蛋白只在加Taxol刺激组表达下降,与CDK1表达减少没有相关性。结论siRNA沉默导致的CDK1表达降低只导致细胞周期G2／M期阻滞,没有引起细胞凋亡;CDK1的表达降低对紫杉醇所诱导的细胞周期阻滞和细胞凋亡效应没有明显影响。     

磷甘霉素和洛伐它汀处理对中国红豆杉悬浮培养细胞生物合成紫杉醇的影响

采用非甲羟戊酸途径抑制剂磷甘霉素和甲羟戊酸途径抑制剂洛伐它汀对中国红豆杉悬浮细胞培养物进行处理.在添加和未添加茉莉酸甲酯诱导的情况下,前者使紫杉醇产量减少了2/5和1/5,后者使紫杉醇产量减少了1/6和1/10,表明两种途径对紫杉醇的生物合成都具有贡献,其中非甲羟戊酸途径贡献较大;通过定量PCR技术分别检测两条途径的关键酶5-磷酸脱氧木酮糖还原异构酶(DXR)和3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶(HMGR)mRNA水平的变化,发现两种抑制剂都能够激活hmgr和dxr的转录,表明两种代谢途径之间存在协同作用,共同为紫杉醇的生物合成提供前体.     

Taxol increases steady-state levels of lipopolysaccharide-inducible genes and protein-tyrosine phosphorylation in murine macrophages.

Taxol, a microtubule stabilizing agent, exhibits promise in the treatment of breast and ovarian tumors. Recently, this novel drug has been shown to activate murine macrophages to express TNF-alpha and to down-regulate TNF-alpha receptors, activities shared by bacterial LPS. Our study sought to determine if taxol could regulate gene expression in murine macrophages and to examine further the ability of taxol to generate an LPS-like signal. Toward this end, the ability of taxol to induce TNF-alpha mRNA and five other genes (IL-1 beta, IP-10, D3, D7, and D8) associated with LPS-activation of macrophages was examined by Northern blot analysis. Taxol alone (1-30 microM) induced murine C3H/OuJ macrophages to secrete bioactive TNF-alpha and express increased levels of each of the six genes under investigation. The magnitude and the kinetics of induction of each gene closely resembled that seen with Escherichia coli K235 LPS. Macrophages from LPS-hyporesponsive C3H/HeJ mice, however, failed to induce detectably any of the genes in response to taxol, despite being sensitive to the microtubule stabilizing effects of taxol as determined by immunofluorescence microscopy. The gene induction activity of taxol was in marked contrast to an alternative macrophage activator, heat killed Staphylococcus aureus, which induced a distinct gene profile in C3H/OuJ macrophages and which was equally active in C3H/OuJ and C3H/HeJ macrophages. These data are consistent with an ability of taxol to generate an LPS-like signal, possibly through a common signaling intermediate. As a first step toward identifying signal responses shared by taxol and LPS, we have shown that taxol, as shown previously for LPS, rapidly induces the tyrosine phosphorylation of a 41- and 42-kDa protein.