番茄叶片胞壁转化酶cDNA克隆及反义沉默表达分析

参考GenBank登录的植物胞壁转化酶基因序列,设计1对PCR引物,以番茄(‘中蔬四号’)叶片总RNA的反转录产物为模板,扩增出长为416bp的cDNA片段,Blast结果表明,其为番茄胞壁转化酶基因LIN6片段;将其反向插入双元载体pBinAR的CaMV 35S启动子和OCS终止子间,构建反义植物表达载体pBinAR-aLIN6。通过农杆菌EHA105介导转化番茄MicroTom,PCR和Southern斑点杂交检测表明,共获得5株转基因番茄;生化检测表明,5个转化植株叶片胞壁转化酶活性分别比未转化植株下降67.9%、13.4%、73.5%、85.6%和58.0%。     

马铃薯转化酶抑制子St-inh cDNA克隆及在大肠杆菌中的表达和功能测定

用RT-PCR结合5’RACE方法从马铃薯(Solarium tuberosum L．)栽培种JH块茎中克隆了转化酶抑制子St-inh全长cDNA。序列分析表明,St-inh基因编码区全长663bp,编码221个氨基酸。将含St-inh基因cDNA的DNA片段克隆到pET28a( )上,转化大肠杆菌BL21(DE3)后成功实现了表达。基因表达产物与马铃薯栽培品种(系)E1、JH试管块茎以及番茄果实的转化酶提取物共孵育结果显示,转化酶活性分别下降了34．3％、21％和33．8％,说明St-inh的翻译产物具有转化酶抑制子功能。BLAST基因序列分析表明,St-inh与Kunitz-type C类基因序列同源性达95％以上,T-COFFEE氨基酸序列对比分析显示,该基因编码的蛋白质具有典型的Kunitz-type结构域[L,I,V,M]-X-D-X-[E,D,N,T,Y]-[D,G]-[R,K,H,D,E,N,Q]-X-[L,I,V,M]-X(5)-Y-X-[L,I,V,M],因此,St-inh基因可能为Kunitz-type家族成员。     

马铃薯转化酶抑制子St-inh cDNA克隆及在大肠杆菌中的表达和功能测定

用RT-PCR结合5’RACE方法从马铃薯(Solanum tuberosum L.)栽培种JH块茎中克隆了转化酶抑制子St-inh 全长cDNA。序列分析表明,St-inh 基因编码区全长663bp,编码221个氨基酸。将含St-inh 基因cDNA 的DNA 片段克隆到pET28a(+)上,转化大肠杆菌BL21(DE3)后成功实现了表达。基因表达产物与马铃薯栽培品种(系)E1、JH 试管块茎以及番茄果实的转化酶提取物共孵育结果显示,转化酶活性分别下降了34.3%、21%和33.8%,说明St-inh 的翻译产物具有转化酶抑制子功能。BLAST 基因序列分析表明,St-inh 与Kunitz-type C 类基因序列同源性达95%以上,T-COF-FEE 氨基酸序列对比分析显示,该基因编码的蛋白质具有典型的Kunitz-type 结构域[L,I,V,M]-X-D-X-[E,D,N,T,Y]-[D,G]-[R,K,H,D,E,N,Q]-X-[L,I,V,M]-X(5)-Y-X-[L,I,V,M],因此,Sit-inh 基因可能为Kunitz-type 家族成员。     

番茄叶片糖与转化酶的日变化研究

为探讨转化酶在叶片糖分含量和光合作用日变化中的作用,测定了番茄(Lycopersicon esculentumL.)叶片光合速率、转化酶活性、淀粉、蔗糖、葡萄糖和果糖含量,并分别分析了12:00前后它们间的相关关系.结果表明:番茄日间叶片净光合速率在10:00和16:00出现一大一小两个高峰;6:00~18:00叶片中淀粉和果糖呈现持续升高,而蔗糖和葡萄糖为先升后降趋势;光合速率同叶片蔗糖含量和胞质转化酶活性存在高度正相关,淀粉和果糖含量同光合速率未表现出显著相关性.由此可知,胞质转化酶在蔗糖代谢方面有明显的作用;果糖可能是通过抑制胞壁转化酶活性,促进了蔗糖外运.     

人内皮生长抑制素基因克隆表达及其抑瘤作用

内皮生长抑制素（ｅｎｄｏｓｔａｔｉｎ是最近报道具有抑制肿瘤生长和铁蛋白质,为此,从正常人肝细胞株Ｌ０２中抽提总ＲＮＡ,以ＲＴ－ＰＣＲ法获得了人内皮生长抑制素编码序列,序列分析表明,内皮生长抑制素ＣＤＮＡ开放阅读框架全长５５５ｂｐ,此基因（ＧｅｎＢａｎｋ登录号为Ａ地８４０６０）,共编码１、８４个氨基酸残序列为５个碱基与文献报道不同,蛋白质序列中有３个氨基酸残基与文献报道不同,说明存在人种间差异。将人     

液泡转化酶反义基因对番茄的遗传转化

以'中蔬4号'番茄的子叶为试材,通过农杆菌介导法遗传转化,将液泡转化酶反义基因导入再生植株,经PCR和Southern斑点杂交检测证明,5株转化植株基因组中整合有目的基因.遗传转化最佳条件为:在附加1.5 mg/L 6-BA和0.1 mg/L IAA的MS培养基上再生培养,外植体预培养2 d,菌液浓度OD600=0.5,侵染时间5 min,共培养2 d.遗传转化后,对整合有目的基因的再生番茄叶片液泡转化酶活性测定,表明液泡转化酶活性明显受到抑制.获得的转基因植株为进一步研究液泡转化酶基因的功能奠定了基础.     

食品蛋白质中血管紧张素转化酶抑制肽的研究

血管紧张素转化酶Ⅰ (angiotensinIconvertingenzyme ,简称ACE)在人体血压调节过程中起重要的生理作用。源于食品蛋白质中的血管紧张素转化酶抑制肽 (angiotensinIconvertingenzymeinhibitorypeptides ,简称ACEIP)有明显的降血压作用 ,这些肽是通过抑制ACE的活性起降血压作用。文章中综述了来源于各种食品蛋白质的ACEIP的最新研究进展以及两种主要制备方法和评价方法 ,并对食品蛋白质中ACEIP的应用前景进行了展望     

无芒隐子草CsPEAMT基因克隆及表达特性分析

以无芒隐子草(Cleistogenes songorica)干旱胁迫下的cDNA文库中磷酸乙醇胺N-甲基转移酶(phosphoethanolamine N-methyltransferase,PEAMT)基因的EST序列为基础,采用RACE方法克隆该基因编码区序列,该序列全长为2 104bp,开放读码框1 506bp,编码501个氨基酸。无芒隐子草PEAMT蛋白编码的氨基酸序列与多种植物的PEAMT氨基酸序列有较高相似性,其中与高粱SbPEAMT、玉米ZmPEAMT的蛋白序列相似性最高(93%),说明PEAMT基因在植物进化中非常保守。采用实时定量RT-PCR分析无芒隐子草幼苗在干旱过程中CsPEAMT基因的表达结果显示,干旱胁迫诱导CsPEAMT基因在根和叶中大量表达,且在干旱第8天时CsPEAMT基因在叶和根中表达量分别是未干旱对照的43.35倍和13.25倍,复水后CsPEAMT基因的表达量开始下调。研究表明CsPEAMT基因可能是无芒隐子草抗旱性相关的基因。     

植物酸性转化酶基因及其表达调控

酸性转化酶是蔗糖代谢的关键酶,在植物体中具有重要的生理作用.近十几年来,许多植物酸性转化酶基因已经克隆,其基因表达调控的研究也取得了很大的进展.本文综述了植物酸性转化酶基因及其蛋白结构、基因表达的器官和发育特异性以及糖、受伤、病原、胁迫和激素对基因表达的调节和蛋白抑制因子对酶活性的影响,并讨论了当前在该研究领域存在的问题.     

植物酸性转化酶基因及其表达调控

酸性转化酶是蔗糖代谢的关键酶,在植物体中具有重要的生理作用。近十几年来,许多植物酸性转化酶基因已经克隆,其基因表达调控的研究也取得了很大的进展。本文综述了植物酸性转化酶﹑ 基因及其蛋白结构、基因表达的器官和发育特异性以及糖、受伤、病原胁迫和激素对基因表达的调节和蛋白抑制因子对酶活性的影响,并讨论了当前在该研究领域存在的问题。     

病毒基因沉默抑制子及其作用机制

基因沉默或RNA 沉默是植物、真菌以及无脊椎动物抵御病毒侵染的重要机制, 为了应对这种机制, 病毒编码RNA 沉默抑制子抑制宿主的基因沉默, 抵抗由基因沉默介导的宿主对病毒的抗性. 病毒编码的RNA 沉默抑制子, 又被称为病毒基因沉默抑制子, 广泛存在于各种植物RNA 病毒和DNA 病毒以及部分动物病毒中. 近年来, 针对病毒基因沉默抑制子作用机制的研究表明, 病毒基因沉默抑制子通过与宿主基因沉默通路中的RNA 或者关键蛋白分子相互作用, 发挥抑制宿主对病毒的抗性以及干扰宿主正常的基因表达调控的功能. 由于植物基因沉默通路的复杂性, 病毒基因沉默抑制子的作用机制也是复杂而多样的.     

植物转录抑制子的结构特征及其作用机理

转录因子依转录调控能力可分为激活子和抑制子。植物 转录抑制蛋白的分类依据很多, 从作用方式上可分为主动抑制子和被动抑制子两大类; 根据与DNA结合的方式则可分为锌指类、MYB类、AP2/EREBP类、bHLH类和bZIP类等。植物主 动抑制子通过其含有的抑制域对转录直接起抑制作用。抑制域又可分很多类, 但多数为含有类似EAR基序的保守性基序, 其上具有几个保守性亮氨酸残基。植物转录抑制子主要通过对激活子或基本转录复合物产生作用及改变染色体结构3种方式来抑制目标基因的转录。有关植物转录抑制子的研究虽很欠缺, 但以拟南芥SUPERMAN等抑制子的EAR基序为代表的研究表明, 抑制域是阐明植物转录抑制子功能和下游基因表达调控机理的核心对象, 而融合抑制子沉默技术(CRES-T)也为人为调控基因沉默带来了新的技术手段。     

植物转录抑制子的结构特征及其作用机理

转录因子依转录调控能力可分为激活子和抑制子。植物转录抑制蛋白的分类依据很多,从作用方式上可分为主动抑制子和被动抑制子两大类：根据与DNA结合的方式则可分为锌指类、MYB类、AP2／EREBP类、bHLH类和bZlP类等。植物主动抑制子通过其含有的抑制域对转录直接起抑制作用。抑制域又可分很多类,但多数为含有类似EAR基序的保守性基序,其上具有几个保守性亮氨酸残基。植物转录抑制子主要通过对激活子或基本转录复合物产生作用及改变染色体结构3种方式来抑制目标基因的转录。有关植物转录抑制子的研究虽很欠缺,但以拟南芥SUPERMAN等抑制子的EAR基序为代表的研究表明,抑制域是阐明植物转录抑制子功能和下游基因表达调控机理的核心对象,而融合抑制子沉默技术（CRES-T）也为人为调控基因沉默带来了新的技术手段。     

番茄COBRA基因克隆、表达模式及生物信息学分析

COBRA作为一种重要的胞外糖基磷脂酰肌醇(GP-I)锚定蛋白,影响植物细胞壁中纤维素含量及细胞的定向伸长。目前已有多个拟南芥、玉米及水稻的COBRA基因的突变体被研究。而有关番茄COBRA基因克隆的研究尚未见报道。本研究利用RT-PCR技术克隆了一个假定编码番茄COBRA蛋白的SlCOBRA基因,并在GenBank注册(JN398667)。序列测定和分析表明,该序列由6个外显子组成,编码444个氨基酸残基;氨基酸序列中存在COBRA蛋白的CCVS保守基序,N端的跨膜信号肽及C-末端的疏水性尾部和GPI锚定ω-位点。系统进化分析表明番茄SlCOBRA与拟南芥AtCOB具有80%氨基酸序列同源性,聚在一个分支上。Real-time PCR分析番茄各个组织中COBRA基因的表达结果表明番茄COBRA为组成型表达,在营养器官(根、茎、叶)中的表达量高于花和果实,尤其在成熟的果实中(从转色期到红熟期)表达量明显减少。     

RNA 沉默的病毒抑制子

RNA 沉默是一种在真核生物体内普遍保守的、通过核酸序列特异性的相互作用来抑制基因表达的调控机制 . RNA 沉默的一种重要生物学效应是防御病毒的侵染,而针对寄主的这种防御机制,许多植物病毒已演化通过编码 RNA 沉默的抑制子来克服这种防御反应 . 目前,已从植物、动物和人类病毒中鉴定了 20 多种 RNA 沉默的抑制子,围绕抑制子的鉴定和作用机理研究已成为病毒学研究的一个热点 . 对 RNA 沉默抑制子的发现、鉴定方法、作用机理及与病毒病症状形成的关系、动物病毒的沉默抑制子等方面的最新进展做了综述,并对沉默抑制子的应用和存在的问题进行了讨论 .     

番茄两个盐胁迫响应基因的cDNA克隆及其表达分析

根据前期耐盐芯片研究提供的两条EST序列设计引物,利用RACE技术从番茄耐盐品种Edkawi中克隆了其5’和3’片段,并拼接成全长cDNA,分别命名为SISRGl和SISRG2。两个基因序列在GenBank中的登录号为EU670751和EU670752,其大小分别为1300bp和1810bp,编码蛋白分别为309和499个氨基酸。半定量RT,PCR表明SISRGl在番茄茎、叶、花中表达较强,在所检测的其它组织中表达很弱,SISRG2在叶和花中表达量最高,其次为茎和根,在果实中表达微弱。盐胁迫表达谱结果显示SISRGl在盐处理的Edkawi中缓慢增强,SISRG2则在盐胁迫后表达迅速增强,在未进行盐胁迫的对照中,两个基因的表达趋势均为减弱。本研究为番茄抗逆研究提供了新的候选基因资源。     

螺旋藻源血管紧张素转化酶抑制肽的纯化和鉴定

血管紧张素转化酶(ACE)抑制剂通过影响肾素-血管紧张素系统,对减缓和抑制高血压具有重要的作用.该研究通过超滤、凝胶过滤色谱、反相高效液相色谱等方法,从钝顶螺旋藻的木瓜蛋白酶水解液中分离、纯化得到一种血管紧张素转化酶(ACE)抑制肽,并利用基质辅助激光解吸电离-飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)和氨基酸测序对纯化肽进行鉴定.此外,对其抑制类型和体外模拟消化环境稳定性也进行了研究.结果表明,分子质量范围为0～3000ku的酶解液ACE抑制活性最高,IC50值为(1.03±0.04)g/L.该部分酶解液通过纯化获得ACE抑制肽,IC50值为(0.0094±0.0002)g/L,相当于(27.36±0.14)μmol/L,序列经鉴定为Val-Glu-Pro.Lineweaver-Burk图和Dixon图表明该ACE抑制肽为非竞争性抑制剂,Ki值为(23.59±0.54)μmol/L.体外稳定性实验显示,该抑制肽在胃蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、胰蛋白酶等胃肠蛋白酶的消化下能够保持良好的抑制活性,表明螺旋藻源ACE抑制肽可以用于降血压功能食品和药剂方面,具有很好的发展前景.     

番茄茎腺毛差异表达序列分离与分析

腺毛是参与植物防御性反应与次生代谢挥发物合成的特异化器官,了解腺毛专一性表达序列标签将有助于我们进一步认识植物腺毛的特异性功能.本文应用磁珠介导的抑制消减杂交方法(SSH),以番茄茎腺毛为检测子(tester),去除腺毛的番茄茎为驱动子(driver),构建番茄茎腺毛差异表达cDNA文库,分离腺毛差异表达基因.随机挑选了108个差异ESTs进行测序,测序结果使用Blast2go程序进行blastx比对、功能注释和KEGG代谢路径分析.结果表明,绝大部分ESTs功能与胁迫响应、物质代谢、生物及非生物刺激反应相关,具有结合、催化功能.这些分离的差异ESTs为进一步研究番茄腺毛的植物防御性机制奠定了基础.     

生长抑制激素基因在大肠杆菌中的表达

从pSom5中提纯生长抑制激素基因片段,在体外与大肠杆菌pBD_2质粒DNA重组连接,转化受体细胞D_2A_1,获得7株工程菌,在IPTG诱导下进行表达。采用β-半乳糖苷酶底物亲和层析法纯化,得到一纯净的分子量为50000道尔顿左右的蛋白质。对此蛋白质及其经CNBr化学裂解的产物进行放射免疫分析,证实化学合成的生长抑制激素基因已在大肠杆菌D_2,A_1中成功地表达,每升培养基中获得生长抑制激素41.69mg,占菌体总蛋白质的0.71%。     

番茄交替氧化酶基因的克隆和表达

利用简并PCR扩增产物做探针筛选番茄cDNA基因文库获得一个全长交替氧化酶cDNA基因LeAoxlau.经序列分析得出,该基因全长1 418bp,编码区序列长1 077 bp,编码约40 kD的前体蛋白.该蛋白在转运到线粒体时被加工成32kD的成熟蛋白.Southern印迹杂交分析结果显示该基因以单拷贝形式存在于番茄的基因组中RT-PCR显示,该基因在在番茄植株的根、茎、叶和子叶中表达.重组表达实验表明该基因能在大肠杆菌中表达.