ADP核糖基化因子的结构及其功能机制

ADP核糖基化因子(ADP-ribosylation factor,ARF)是Ras基因超家族的成员,它们是大小约20kDa的鸟嘌呤核苷酸结合蛋白。ARF最初发现作为霍乱毒素ADP-核糖转移酶的辅助因子共同作用于G蛋白α亚基,促使其ADP-核糖基化。近来人们发现ARF还参与囊泡运输、调节磷脂酶D的活性,在细胞内物质运输和信号转导过程中具有更加重要的生理功能。现就ARF的发现、分类、结构和功能、表达以及生理功能作一综述。     

麻疯树核糖体失活蛋白基因的克隆和表达

麻疯树(Jatropha curcas L.)核糖体失活蛋白(curcin)是存在于麻疯树种子中的一种毒性较强的蛋白,它与蓖麻毒蛋白和相思子毒蛋白的性质相似,属Ⅰ型核糖体失活蛋白.从麻疯树种子中分离得到一种分子量为28.2 kD的蛋白质,其对无细胞系统中蛋白质合成的抑制活性较强,IC50为(0.19±0.01)nmol/L,具有RNA N-糖苷酶活性.依据curcin的N端部分氨基酸设计简并引物,通过RT-PCR和5'-RACE技术从未成熟种子总RNA中克隆到curcin全长cDNA序列.该cDNA全长由1 173个碱基组成,包含一个编码293个氨基酸的前体蛋白,前42个氨基酸为信号肽.推测的多肽序列与测定的蛋白质N端序列相同,与多种己发表的Ⅰ型核糖体失活蛋白和Ⅱ型核糖体失活蛋白的A链有一定的同源性.将curcin的编码区与表达载体pQE-30相连后,转入大肠杆菌(Escherichia coil)M15菌株中得到了有效的表达.将表达的融合蛋白纯化后发现,它具有抑制无细胞系统蛋白质合成的能力.     

麻疯树核糖体失活蛋白基因的克隆和表达

麻疯树(Jatropha curcas L.)核糖体失活蛋白(curcin)是存在于麻疯树种子中的一种毒性较强的蛋白,它与蓖麻毒蛋白和相思子毒蛋白的性质相似,属Ⅰ型核糖体失活蛋白。从麻疯树种子中分离得到一种分子量为28.2kD的蛋白质,其对无细胞系统中蛋白质合成的抑制活性较强,IC_(50)为(0.19±0.01)nmol/L,具有RNA N-糖苷酶活性。依据curcin的N端部分氨基酸设计简并引物,通过RT-PCR和5′-RACE技术从未成熟种子总RNA中克隆到curcin全长cDNA序列。该cDNA全长由1 173个碱基组成,包含一个编码293个氨基酸的前体蛋白,前42个氨基酸为信号肽。推测的多肽序列与测定的蛋白质N端序列相同,与多种已发表的Ⅰ型核糖体失活蛋白和Ⅱ型核糖体失活蛋白的A链有一定的同源性。将curcin的编码区与表达载体pQE-30相连后,转入大肠杆菌(Escherichia coil)M15菌株中得到了有效的表达。将表达的融合蛋白纯化后发现,它具有抑制无细胞系统蛋白质合成的能力。     

麻疯树两种核糖体失活蛋白的表达模式分析

目前,麻疯树核糖体失活蛋白已发现2种:种子中的毒蛋白curcun和叶片中的逆境诱导蛋白curcin-L,其基因的表达模式均呈现出器官特异性.mRNA和蛋白质水平分析显示,curcin只在种子的胚乳中积累,且表达开始于心型胚时期,成熟时达到最高;而curcin-L在正常生理条件下并不表达,但受脱落酸、水杨酸、干旱,高低温等胁迫诱导时仅在叶片中表达.     

麻疯树的二萜成分

从麻疯树（Jatropha curcas L.)的根中分离得到3个二萜,鉴定为麻疯树酚酮A（iatropholone A)。麻疯树酚酮B（jatropholone B)和一个新的二萜,其结构推定为16－羟基麻疯树酚酮（16-hydroxyjatropholonc),定名麻疯树醇（jatrophol),同时还得到麻疯素（jatrophin),β-谷甾醇－β-D－葡萄糖甙（β－D－glucoside-β-sitosterol),tomentin,蒲公英脑（taraxerol)以及β-谷甾醇。     

麻疯树毒蛋白curcin2基因的两个原核表达载体的构建和表达

从麻疯树基因组中扩增到毒蛋白curcin2基因成熟肽编码区,成功构建了原核表达载体pET-C和pQE-C,并转化大肠杆菌获得转化子PCB和PCM。在不同温度、不同浓度IPTG和不同诱导时间下,PCB都没有curcin2重组蛋白产生,而PCM能表达出curcin2,主要以包涵体形式存在。诱导温度较低时,延长诱导时间有可溶性的curcin2产生。在文章的实验中,PCM表达curcin2的优化条件为:温度16℃,IPTG1mmol·L-1,时间16￣24h。     

麻疯树G蛋白γ亚基JcAGG3基因的克隆及表达分析

从麻疯树c DNA中克隆到一个与拟南芥AGG3同源的基因,命名为Jc AGG3。该基因开放阅读框为834bp,编码277个氨基酸,软件预测等电点为8.61,分子质量为30.514k Da。亚细胞定位预测显示其定位于细胞质膜上。在该基因的顺势作用元件上发现了与胚乳发育、激素调节、光响应和逆境胁迫相关的启动元件。荧光定量PCR(q PCR)检测发现,Jc AGG3在根、茎、叶和种子中均有表达,在发育中的种子中表达量最高,幼叶中的表达量显著高于老叶,在茎中只检测到极微量的表达;对麻疯树的幼苗进行黑暗处理后Jc AGG3基因表达显著下调,脱落酸(ABA)和干旱胁迫处理下Jc AGG3表达量显著增加。     

麻疯树的二萜成分

从麻疯树（Jatropha curcas L.)的根中分离得到3个二萜,鉴定为麻疯树酚酮A（iatropholone A)。麻疯树酚酮B（jatropholone B)和一个新的二萜,其结构推定为16－羟基麻疯树酚酮（16-hydroxyjatropholonc),定名麻疯树醇（jatrophol),同时还得到麻疯素（jatrophin),β-谷甾醇－β-D－葡萄糖甙（β－D－glucoside-β-sitosterol),tomentin,蒲公英脑（taraxerol)以及β-谷甾醇。     

一个麻疯树RING型锌指蛋白基因JcRFP1的克隆及表达

首次从麻疯树胚乳cDNA丈库中克隆得到一个RJNG型锌指蛋白基（GenBank登录号为JF920726）,命名为JcRFP1。该cDNA长度为728bp,包含编码JcRFP1蛋白的完整开放阅读框（516bp）。脚,基因在麻疯树各器官中均检测到表达且表达量依次为：叶〉茎〉花〉果实〉种子〉根。将克隆到的JcRFP1基因的cDNA序列连接到表达载体pET32a（＋）上,导入BL21（DE3）pLysS菌株,成功诱导表达相对分子质量为33．2kDa的可溶性融合蛋白。该融合蛋白免疫新西兰大白兔,得到效价为1：6500的抗血清。研究表明,JcRFP1蛋白具有体外泛素连接酶E3活性,在麻疯树体内可能参与油菜素甾醇信号转导途径。     

麻疯树逆境蛋白(curcin 2)基因在烟草中的表达

麻疯树（Jatropha curcas）幼苗在干旱、高低温胁迫和真菌浸染下,其叶片中诱导产生了一种新的毒蛋白curcin 2。这意味着curcin 2在其它植物中的异源表达可能会增强植物对外界胁迫的抵抗。curcin 2 cDNA的两个片断：cur2p片断（编码前成熟蛋白）和cur2m片断（编码成熟蛋白）,通过农杆菌的介导分别转化烟草并获得转基因植株。但是,只有在插入了cur2p片断的烟草中检测到了curcin 2蛋白的表达。同时,curcin 2在烟草中的表达增强了植株对烟草花叶病毒（TMV）的抗性。     

麻疯树MIPS基因启动子的分离及在烟草原生质体中瞬时表达活性分析

根据麻疯树MIPS基因序列,设计特异性的巢式引物,运用TAIL-PCR法两次步移得到MIPS基因5＇端侧翼序列,序列分析显示含有多个胁迫应答相关元件,如ABRE、HSE等。以该序列为基础,PCR扩增得到5个5＇端不同长度的缺失片段,分别插入pBI221载体置换CaMV35S启动子,构建的表达载体在PEG介导下转入烟草叶片原生质体进行瞬时表达,检测GUS报告基因的活性。经GUS活性荧光定量检测发现,分离到的MIPS基因侧翼序列5＇端不同缺失片段都能启动GUS报告基因表达,启动活性最高的是WQ1区（-565bp）,核心区位于-565～-449bp。在100μmol·L-1ABA诱导下启动活性增强,但不同区段的增长幅度不同。WQ1区增长幅度最大,比未处理时提高41.4%。     

麻疯树脂酶全长基因克隆、表达及其蛋白质结构预测

脂酶(Lipase,EC3.1.1.3)是普遍应用于皮革、饲料及生物柴油工业的工业酶制剂,具有广泛的应用价值。目前对植物来源的脂酶研究较少。本研究用在生物柴油中具有应用前景的油料植物——麻疯树(Jatrophacurcas)作为研究对象,克隆了该物种的脂酶基因(JcLIP)。通过多序列比对并结合物种的亲缘关系设计了具有较高特异性的简并引物,通过使用RT-PCR和RACE技术,最终获得了麻疯树脂酶基因的全长序列并成功地在大肠杆菌中表达,酶活测定结果表明,麻疯树脂酶在大肠杆菌中表达在包涵体中,但是能产生具有活力的蛋白质,酶活约为0.8U.mL-1。结构预测和比较表明,JcLIP蛋白质具有脂酶的结构核心和催化活性中心,而在非核心区具有较毛霉脂酶更多的插入和随机卷曲,这可能是决定二者之间酶活差异的重要原因。     

麻疯树乳汁管的解剖学研究

麻疯树(JatrophacurcasL.)的乳汁管能分泌含有多种药用成分的乳汁。采用石蜡切片、冰冻切片和半薄切片技术,在光学显微镜下观察麻疯树乳汁管的类型、分布和大小。结果表明,麻疯树中存在有节连接和非连接乳汁管、无节分枝和不分枝乳汁管;乳汁管普遍分布在皮层和韧皮部,茎和叶脉的木质部存在少量的乳汁管,茎、叶柄、花梗和果柄的髓部有少量分布;靠近维管组织的皮层中的乳汁管直径较大,而靠近表皮的皮层中的乳汁管直径较小,如茎中靠近维管组织的乳汁管直径为40-60μm,而靠近表皮的乳汁管直径为5-18μm。     

小桐子非特异性脂质转移蛋白A的基因克隆及其表达和功能分析

基于我们最近获得的小桐子低温驯化转录组和数字基因表达谱数据,本工作研究了低温驯化条件下差异表达变化较大的非特异性脂质转移蛋白A基因JcnsLTPA。克隆到该基因的cDNA序列全长833 bp,开放阅读框长度513 bp,编码170个氨基酸,存在ATT_LTSS典型保守功能基序。其启动子区域中鉴定到了TATA框、CAAT框、CATA框、W框等顺式作用元件以及CRT/DRE低温响应元件。半定量RT-PCR分析表明,该基因在茎、根、叶中都有表达,以茎中表达量最高、且受低温诱导最显著。同时,酵母表达JcnsLTPA也提高了重组酵母菌的抗低温能力。这些结果充分说明了小桐子JcnsLTPA是与抗冷性密切相关的基因,可以用于小桐子的抗冷性遗传改良。     

麻疯树皮的化学成分研究

从麻疯树(Jatrophac curcus L.)的树皮中分离得到12个化合物,经理化常数和波谱鉴定(IR,1H NMR,13C NMR,EI-MS)分别为二十六酸甲酯(1),β-谷甾醇(2),蒲公英萜醇(3),蒲公英甾醇(4),伪蒲公英甾醇(5),curcusones A(6),curcusones B(7),jatropholone A(8),jatropholone B(9),3,3′,4-三甲氧基鞣花酸(10),胡萝卜甙(11),蔗糖(12)。其中化合物1,4,5,10,12为首次从该植物中分离得到。     

生物柴油植物黑皂树开发利用研究

能源短缺和环境污染是当前人类社会所面临的巨大挑战,生物柴油的推广和应用是现阶段解决替代燃油的重要途径之一。黑皂树种子油是很好的生物柴油原料,目前在许多热带地区大力种植黑皂树。我国华南、西南地区的一些干旱荒地可以种植黑皂树。我们对黑皂树油在柴油机上的应用研究证明:黑皂树油在气温35℃条件下,可以直接在各种柴油机上起动和应用;黑皂树油中掺入20%的轻柴油,其黏度大大降低,冷机起动性能和热效率等均与轻柴油相当。因此,黑皂树油的应用比目前国外使用的生物柴油更经济,是一种很有发展前途的能源植物。     

麻疯树苯丙氨酸解氨酶启动子的克隆和表达载体的构建

苯丙氨酸解氨酶（phenylalanine ammonia lyase, PAL）是苯丙烷类代谢途径的关键酶,催化苯丙氨酸转化为肉桂酸,促进黄酮、香豆素等次生代谢物的生成。本文根据已克隆的麻疯树苯丙氨酸解氨酶基因JcPAL的序列设计引物,通过DNA步移技术,克隆出长度为1 334 bp的JcPAL基因起始密码子上游序列。序列分析显示其不仅具备CAAT、TATA盒这些保守元件,而且包含多种胁迫诱导元件,特别是在序列中发现一些苯丙氨酸解氨酶特有的元件。为了鉴定JcPAL基因的启动子元件,分别将长度不同的5′端侧翼区缺失体定向插入载体pBI121中, 取代原有的CaMV35S启动子,构建了4个驱动报告基因GUS的植物表达载体。