嗜酸乳杆菌表层蛋白提取方法及影响因素的研究

对嗜酸乳杆菌S层蛋白的提取方法进行了改进．用酸性5mol／L LiCl法,中性5mol／L LiCl法和8mol／L尿素法提取嗜酸乳杆菌的表层蛋白,考马斯亮兰法测蛋白浓度,进行常规SDS-PAGE,用Gel—Pro软件进行数据分析,得出其中酸性5mol／L LiCl法提取表层蛋白百分含量最多．分析影响提取条件的因素,设置0、4、室温（25℃）3个温度梯度和10、15、20、25、30min 5个时间梯度,进行常规SDS-PAGE,检测提取表层蛋白的效果．Sephadex G-100柱分离中性5mol／L LiCl法和8mol／L尿素法提取嗜酸乳杆菌的表层蛋白获得SA蛋白．酸性5mol／L LiCl法可用于分析各种表层蛋白;中性5mol／L LiCl法和8mol／L尿素法用于提取43kDa的SA蛋白．25℃处理15min得到最大量的表层蛋白．     

非洲山毛豆叶片蛋白组双向电泳样品制备方法的建立

以非洲山毛豆叶片为材料,对非洲山毛豆总蛋白质3种提取方法(TCA/丙酮沉淀法、尿素/硫脲法和酚-甲醇/醋酸铵沉淀法)以及3种蛋白裂解液进行比较分析。结果表明,采用酚-甲醇/醋酸铵沉淀法提取非洲山毛豆叶片总蛋白,用蛋白裂解液(7mol/L尿素,2mol/L硫脲,4%CHAPS,40mmol/LTris-base,1%Bio-LytepH3.5-10,65mmol/LDTT)裂解蛋白1h,2-DE图谱分离到的蛋白点效果最好。此方法适合于色素、多酚及黄酮类次生代谢物含量较多的非洲山毛豆叶片总蛋白制备方法。     

蚜虫全蛋白提取方法的比较研究

为建立适于SDS-PAGE分析的蚜虫蛋白质样品制备平台,以便为蚜虫蛋白质的双向电泳分析奠定基础,本研究比较了TCA/丙酮沉淀、PEG提取、饱和酚抽提和直接裂解4种蛋白质提取方法.结果表明:不同样品制备方法的蛋白提取率有显著的差异,其中直接裂解法的提取率最高,为17.43 mg/g;其次是饱和酚抽提法,提取率为12.30 mg/g;而PEG制备法提取率最低,只有7.96 mg/g.利用SDS-PAGE电泳对不同的蛋白质样品进行了分析,发现在凝胶图谱上显现的条带也有明显的差异,其中饱和酚抽提法显现的条带数最多,为36条,且从14.4 kDa～116.0 kDa范围有广泛分布,条带清晰;PEG提取法条带数为30条,一些蛋白条带丢失或不明显;TCA/丙酮沉淀法的蛋白条带集中分布在25.0 kDa～67.0 kDa区域;直接裂解法条带数仅为24条,且小分子量的条带可辩率很低.通过以上结果可以得出,饱和酚抽提法最适用于蚜虫全蛋白样品的制备.     

牛奶子果实中蛋白质的提取和双向电泳分析方法的改良

比较2种提取牛奶子果实中总蛋白的方法以及用SDS-PAGE分析的结果表明,用酚法提取蛋白时,适当延长第2次平衡时间,并及时更换平衡缓冲液Ⅱ,可获得高分辨率的总蛋白图谱。这种改良了的方法解决了牛奶子果实中富含的色素和多酚等化合物对双向电泳（2-DE）的干扰问题,重复性好,适用于果实中蛋白的2-DE分析和尔后的技术操作。     

双裂解法提取血清HBV DNA技术的建立

为进行ＰＣＲ实验建立了一种两步裂解血清ＨＢＶ提取其ＤＮＡ的方法。该法首先用ＳＤＳ及蛋白酶消化裂解病毒,随后再进行碱裂解,操作较酚提取法大为简化,而ＰＣＲ实验进行的两法的灵敏性比较,说明双裂解法至少不低于酚法。     

利用双向电泳技术分离大豆矮秆突变体相关蛋白

矮秆是大豆育种的重要目标性状之一。本实验以大豆野生型东农42和矮秆突变体东泽11为材料,利用近年来发展起来的双向电泳技术,在蛋白质水平对两个材料的差异蛋白质进行筛选,目的是鉴定与矮秆突变体相关的蛋白,为基因克隆提供依据。通过对酚(Phenol)法与TCA／丙酮沉淀法二种提取方法、100μg和200μg两种加样量、考马斯亮蓝染色和银染两种染色方法的比较,发现用丙酮沉淀法提取叶片可溶性总蛋白、加样量为200μg进行电泳,用考马斯亮蓝染色的效果较好,从而建立了大豆叶片总蛋白双向电泳技术优化体系。用该体系对野生型与突变体叶片全蛋白的差异分析,鉴定出９个蛋白差异点,其中６个上调表达,３个下调表达。     

西花蓟马蛋白的提取及双向电泳体系的建立

【目的】蛋白样品的制备是获得良好双向凝胶电泳(2-DE)图谱的前提,建立合理的西花蓟马蛋白的双向电泳体系,获得分辨率较高、重复性较好的图谱,能够为后续的研究提供有力支撑。【方法】实验以西花蓟马成虫为实验材料,对比了饱和酚法、TCA/丙酮法和直接裂解法3种蛋白提取方法,从中选出最适宜双向电泳分析的一种蛋白提取方法。【结果】3种方法蛋白提取率差异显著,直接裂解法蛋白提取率最高,饱和酚法的蛋白提取率最低;3种方法的SDS-PAGE条带数差异不明显;TCA/丙酮法的双向凝胶图谱效果最好,蛋白点最多。【结论】TCA/丙酮法能够有效去除西花蓟马蛋白中的干扰物质,是最适合西花蓟马双向凝胶电泳的蛋白提取方法,为后续西花蓟马在蛋白组学方面的研究奠定了基础。     

枸杞花药蛋白质组双向电泳体系的建立及应用

采用改良TCA丙酮沉淀结合Tris-HCl法提取枸杞花药蛋白质,对蛋白质裂解液成分、IPG胶条的pH范围、上样量及染色方法进行了探索.结果表明:(1)采用17 cm胶条、400 μg的上样量、含有2 mol/L硫脲的裂解液,硝酸银染色,可得到重复性好、质量高的枸杞花药蛋白2-DE图谱,枸杞花药蛋白主要集中在pH 4～7范围.(2)采用该体系分析了‘宁杞1号’和‘宁杞5号’四分体时期花药蛋白,并利用PDQuest 8.0软件在pH 4～7的2DE图谱上检测到500多个蛋白点,其中差异表达量大于2倍的蛋白有25个.     

三种提取冬虫夏草菌丝体基因组DNA方法的比较

采用改良氯化苄法、CTAB法、蛋白酶K裂解法这三种方法,对冬虫夏草菌丝体基因组DNA进行提取,将提取的基因组DNA经过紫外分光光度计检测纯度和计算浓度、琼脂糖凝胶电泳分析及PCR扩增,结果表明,3种方法均能提取到符合分子生物学的DNA,其中蛋白酶K裂解法纯度最高,含蛋白质少,改良氯化苄法、CTAB法次之。而浓度则是改良氯化苄法最高,CTAB法、蛋白酶K裂解法次之。3种方法所提取的DNA均能扩增出理想条带。     

结核分枝杆菌菌体蛋白双向电泳技术的优化

目的：提取结核分枝杆菌菌体蛋白并建立一种利用双向电泳分离结核分枝杆菌蛋白质组的方法。方法：分离提取结核分枝杆菌菌体蛋白。样品采用不同pH梯度的鹏胶条进行第一向等电聚焦,12％SDS—PAGE凝胶进行二向电泳。银染后双向电泳图谱用Molecular Image Fx激光图像扫描仪扫描,PDQuest6．0软件完成配比分析。结果：优化了结核分枝杆菌菌体蛋白的提取方法,用裂解液8mol／L尿素结合2mol／L硫脲,140mmol／LDTT,0．5％biolyte,4％CHAPs,400mg／m1lOG处理,成功提取了蛋白,并通过结核分枝杆菌双向电泳技术体系的优化,建立了结核分枝杆菌菌体蛋白的分解图谱。pH4—7及pH7—10两胶面上共1387个点,占所检测到的蛋白总数的86％,绝大部分（1194个）蛋白位于pH4—7范围内。结论：为进一步开展结核分枝杆菌的比较蛋白质组学研究提供了方法学参考。     

用荧光染色技术标记生活花粉管的研究

在金鱼草和(或)烟草上试验了三种荧光染料对花粉管进行荧光活体染色与标记的效果。花粉管在异硫氰酸荧光素(FITC,12.5μg/ml)中染色5—6小时,原生质呈绿黄色荧光;换入无染料的培养基后可继续生长并保持荧光标记,但后期生长受抑。罗丹明B(RB,10μg/nl)染色的效果与上相近,花粉管呈红色荧光;换入无染料培养基后生长正常,唯后期荧光减弱。荧光素二醋酸酯(FDA,10μg/ml)染花粉粒40分钟,换入无染料培养基后正常萌发与生长,花粉管原生质呈明亮的绿色荧光。FDA方法具有染色时间短,荧光明亮,兼有活染与生活力鉴定双重功效等优点。     

乙醇保存的动物标本基因组DNA提取方法的比较

为提高从乙醇长期保存的动物标本中提取大分子DNA的质量,用5种不同方法对动物组织进行预处理实验,然后采用SDS／蛋白酶K裂解,酚一氯仿抽提和乙醇沉淀提取总DNA,通过0．8％琼脂糖凝胶对模板进行电泳和PCR产物作鉴定,经比较,用0．9％NaCL法、PBS法和混合液法进行预处理,消除乙醇对Taq酶的影响以及蛋白质和核酸交联问题,为提取动物基因组DNA的3种更理想方法。     

NLS-RARα蛋白在重组腺病毒Ad-NE感染的NB4中定位的验证

该实验主要验证重组腺病毒Ad．NE感染NB4细胞后,NLS-RARa蛋白的表达及其定位。用重组腺病毒Ad-NE感染NB4细胞,检测感染效率,分别用RT-PCR和Westernblot法在mRNA水平和蛋白水平验证转染成功：提取转染成功的NB4细胞的核蛋白,Westernblot法检测细胞核中NLS—RARα蛋白的表达;FITC—AnnexinV／DAPI双染色免疫荧光法检测转染成功的NB4细胞NLS-RARα的表达及定位;FITC—AnnexinV／PI双染色激光共聚焦法检测转染成功的NB4细胞中PNLS-RARα的表达及定位。结果显示,重组腺病毒Ad—NE和阴性对照腺病毒Ad-KZ对NB4细胞的感染效率可达70％～80％。RT-PCR和Westernblot结果显示,感染了重组腺病毒Ad—NLS-RAR的NB4细胞成功表龇基因和NE蛋白,且有NLS．RARa的蛋白表达。用细胞免疫荧光法、激光共聚焦法检测出已感染的NB4细胞中NLS—RARer蛋白的表达,并推测其主要定位于胞核。综上所述,该文成功用重组腺病毒Ad-NE感染NB4细胞,并用Westernblot法、免疫荧光法、激光共聚焦法验证了NLS-RARα蛋白的存在并推测其定位,为进一步研究急性早幼粒细胞白血病的早期诊断及复发监测提供了新的思路。     

miR-29b对TNF—α诱导的人脐静脉内皮细胞增殖与凋亡的影响

目的探索过表达miR-29b对TNF-α 诱导的人脐静脉内皮细胞（HUVECs）增殖与凋亡的影响及初步作用机制。方法MTT 法筛选TNF—α诱导HUVECs的最佳浓度和时间,建立细胞凋亡模型;MTY法筛选miR-29bmimic转染HUVECs的最佳转染时间和浓度：MTr法检测过表达miR-29b对TNF-α诱导HUVECs增殖活力的影响;Hoechst33342荧光染色检测过表达miR-29b对TNF—α诱导HUVECs凋亡的影响：Western印迹技术检测过表达miR-29b对Akt磷酸化水平、Bcl-2蛋白表达的影响。结果TNF—α诱导的HUVECs凋亡的最佳浓度为10ng／ml,最佳时间是48h;miR-29bmimics转染HUVECs的最佳浓度为50nmol/L,最佳作用时间是48h;过表达miR-29b能显著降低TNF-α诱导的HUVECs的增殖活力（P〈0．001）;Heochst33342荧光染色结果显示。miR-29b过表达能促进TNF-α诱导的HUVECs的凋亡（P〈0．05）;过表达miR-29b能显著下调Akt磷酸化（p-Akt）与Bcl-2蛋白的表达（P〈0．001）。结论过表达miR-29b可降低TNF-α诱导的HUVECs的增殖活力并促进其凋亡,其机制可能与下调Akt磷酸化、Bd-2蛋白的表达相关。     

棉花纤维蛋白质3种提取及二维电泳方法的比较

高质量的蛋白样品制备是进行二维电泳的先决条件.棉花纤维中含有纤维素、多酚、多糖等严重干扰二维电泳的物质, 增加了蛋白提取和二维电泳的难度.分别采用3种提取植物组织蛋白的方法(水法、酚法和尿素法), 提取棉纤维总蛋白, 进而进行了二维电泳分析.在蛋白产量、蛋白纯度和电泳图谱等方面对3种方法进行了比较, 结果采用酚法提取的样品取得了较好的电泳图谱, 有望成为从棉纤维样品中提取总蛋白的可选方法.     

小麦幼穗蛋白质双向电泳条件的优化

本研究以温光敏小麦为试材,用TCA/丙酮和酚提取法提取小麦幼穗蛋白样品,进行了双向电泳优化分析,并对双向电泳过程中出现的问题进行了讨论。结果表明,用TCA/丙酮法提取小麦幼穗蛋白质其产率(浓度)高于酚提取法。SDS-PAGE电泳显示,用TCA/丙酮提取法提取的蛋白质能获得较清晰条带,分辨率较高,而酚提取法提取的蛋白质其条带模糊,分辨率低。对蛋白质纯化除盐可以提高分辨率,减少横竖纹,获得背景清晰的圆形蛋白点。通过ImageMasterTM 2D Platinum5.0软件分析凝胶图谱,结果显示纯化后可降低噪点,纯化后蛋白点数可从未纯化蛋白点数的216增加到583。显然,采用TCA/丙酮法可获得高浓度高质量的蛋白质,而进一步纯化、除盐离子可进一步获得背景清晰可高重复性的电泳图谱。在双向电泳实验过程中,观察到一些异常缺陷胶的出现,如双向电泳图谱中蛋白点扩散,蛋白聚集形成斑点串,没有点或点很少,出现纵纹横纹及图谱扭曲等影响图谱质量的严重问题,本研究对这些问题做了分析并提出了解决方案。     

缺铁逆境胁迫下水稻叶片蛋白的双向电泳及其蛋白质组图谱分析

水稻幼苗经缺铁胁迫诱导分别处理1、3、5天后,用酚法和TCA/丙酮法提取叶片中的可溶性蛋白进行双向电泳分析,从而研究在缺铁条件下叶片中蛋白表达的动态变化规律.结果显示1.不同pH IPG胶条分离蛋白的效果不同.用pH3-10的IPG胶条进行双向电泳,经考马斯亮蓝染色后,可在胶面上检测到大约450个蛋白点,其中约有89%的蛋白是酸性蛋白.如果用pH4-7的IPG胶条进行双向电泳,则可检测到大约600个蛋白点,其中有29个蛋白是上调表达,1个蛋白是下调表达,5个蛋白是诱导特异表达.2.不同方法提取的可溶性蛋白质量不同.TCA法简单易操作,似乎对于碱性蛋白的抽提效果更好,在2-DE图像上,减性端显示的蛋白点多;但此方法所得蛋白的再溶性差.酚法提取的蛋白再溶性好,所抽提的蛋白量较大,纯度较高.     

何首乌总RNA提取方法的比较及改进

目的：探讨不同提取方法对提取何首乌总RNA的质量影响,寻找适于何首乌成熟叶组织RNA的提取方法。方法：以何首乌成熟叶组织为材料,采用SDS／酸酚法、常规CTAB法及改良的TRIzol试剂法分别进行实验,并对所提取RNA的质量进行验证。结果：采用3种方法都能提取出RNA,但质量差异较大。其中改良的TRIzol试剂法能有效抑制次生物质的影响,提取的RNA产量可达70-110μg／g,纯度高于其他2种方法,D260nm／D280nm值为1．85～1．97。结论：改良的TRIzol试剂法操作简便,提取的RNA完整性和纯度较高,可以满足下一步实验的要求。     

狗獾粪便DNA提取方法的初步探讨

在京杭大运河扬州段堤坝上采集狗獾的新鲜粪便,采用预处理-酚/氯仿抽提法、NaCl改良法、异硫氰酸胍裂解法、淀粉吸附法及QIAamp试剂盒法5种方法对粪便样品中狗獾DNA进行提取,探讨狗獾粪便样品中DNA提取方法和优化条件。结果表明,在5种提取方法中,淀粉吸附法的效果明显优于其它4种方法。采用粪便裂解液快速裂解细胞后,加入淀粉去除其中的大量PCR抑制物,然后用蛋白酶K裂解、酚/氯仿/异戊醇抽提,最后使用UNIQ-10柱纯化粪便DNA,对线粒体控制区和微卫星位点的PCR扩增反应及测序结果证实该方法的可行性。以上结果表明,通过该方法获得的粪便DNA能够用于更深入的分子遗传学等学科的研究。     

人肝癌细胞系的糖蛋白质组学研究

糖基化是最重要的蛋白质翻译后形式之一,糖基化蛋白的糖链部分影响着蛋白质的折叠和稳定性以及其生物学功能.许多恶性肿瘤组织与正常组织相比已显示出蛋白质糖基化的差异.采用蛋白质组学分析方法结合先进的糖蛋白荧光染色技术,研究了正常人肝细胞系(ChangLiver)和人肝癌细胞系(Hep3B)糖蛋白糖基化的差异.首先用细胞裂解法提取细胞总蛋白质,进行双向电泳(2-DE),然后用pro-QEmerald488糖蛋白荧光染料进行糖蛋白染色,得到两种细胞系糖基化蛋白表达谱,经2-DE分析软件Dymension分析2-DE图像,比较糖蛋白的糖基化程度,并对糖基化蛋白进行质谱鉴定.结果显示正常人肝细胞表达(74±2)个(n=3),而人肝癌细胞系表达(78±3)个糖蛋白(n=3).两者匹配的糖蛋白质点31个,Hep3B表达而ChangLiver不表达的糖蛋白质点47个,ChangLiver表达而Hep3B不表达的糖蛋白质点43个.两种细胞系糖基化程度存在明显差异,与正常人肝细胞相比,肝癌细胞发生糖基化改变的糖蛋白有25个,其中糖基化水平上调的有10个,下调的有15个,质谱鉴定出12个发生糖基化改变的糖蛋白.这些结果显示蛋白质糖基化改变可能在肝癌的发生和发展中起一定作用.