哇巴因对人血管内皮细胞死亡和钠泵α1、β1,亚单位表达的影响

目的：研究钠泵抑制剂哇巴因（ouabain）对人血管内皮细胞死亡的影响及其作用机制。方法：以脐静脉内皮细胞系ECV304为靶细胞,应用MTT实验检测哇巴因对细胞生长的作用 采用Hoechst33342/PI双荧光染色、透射电镜和DNA琼脂糖凝胶电泳等分析细胞死亡特征,半定量RT-PCR法检测钠泵α1和β1亚单位mRNA的表达。结果：哇巴因以浓度和作用时间依赖的方式抑制ECV304细胞生长。10μmol/L哇巴因作用24 h,引起细胞坏死 0.1μmol/L哇巴因作用24～48 h,细胞明显脱落,细胞间连接丧失,细胞出现染色质凝集、分布于核膜内缘、DNA裂解等凋亡特征。哇巴因能明显上调ECV304细胞钠泵α1亚单位mRNA的表达,下调β1亚单位mRNA表达,且两者均呈时间依赖性。结论：哇巴因能诱导人血管内皮细胞ECV304死亡,其上调钠泵α1亚单位表达、下调β1亚单位表达,可能与亚单位介导信号传递、降低细胞黏附有关。     

波动性高胰岛素对内皮细胞一氧化氮合酶信使核糖核酸的影响

目的:对比研究波动性高浓度胰岛素与恒定性高浓度胰岛素对体外培养的人脐静脉内皮细胞eNOS mRNA转录水平的影响,从而探究波动性高浓度胰岛素血症在糖尿病动脉粥样硬化形成中的致病机制.方法:采用体外培养的人脐静脉内皮细胞为对象,研究波动性高胰岛素对血管内皮细胞eNOS mRNA转录水平的影响.实验分为4组,即对照组(不含胰岛素)、正常浓度胰岛素组(含胰岛素1 nmol/L)、恒定性高胰岛素组(含胰岛素100 nmol/L)与波动性高胰岛素组(含胰岛素1 nmol/L及含胰岛素100nmol/L两种条件培养液,每8小时轮换一次),每间隔8小时更换新鲜条件培养液一次,一共作用72小时.应用应用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测内皮细胞eNOS基因mRNA转录水平.结果:经不同浓度的胰岛素作用72小时后,正常浓度组、恒定性高胰岛素组与波动性高胰岛素组内皮细胞eNOS mRNA转录水平均不同程度上调,分别为对照组的2.25倍(p<0.001)、6.00倍(p<0.001)和6.88倍(p<0.001),其中以波动性高胰岛素组上调尤为明显,且明显高于恒定性高胰岛素组(p<0.05).结论:波动性高胰岛素相对于恒定性高胰岛素能增强人脐静脉内皮细胞eNOS mRNA的转录.     

人绒毛膜癌细胞Jar卵泡抑素基因表达的调控

用逆转录-多聚酶链聚合反应(RT-PCR)方法证实, 表皮生长因子(EGF)可刺激人绒癌细胞株Jar卵泡抑素mRNA的表达, 并呈剂量依赖效应, 最大效应剂量为1.0 nmol/L, 半数有效剂量为0.3 nmol/L.GM-CSF虽然单独对人绒癌细胞株Jar卵泡抑素mRNA表达无任何影响, 但却能显著抑制EGF刺激后的人绒癌细胞株Jar卵泡抑素mRNA的表达,并有剂量依赖关系,最大效应剂量为10 nmol/L, 抑制率达62.3%, 半数有效剂量为3.0 nmol/L.提示胎盘组织卵泡抑素基因除受多种激素调控外, 还受一些生长因子内分泌和旁分泌的调控.     

波动性高胰岛素对血管内皮细胞的凋亡的影响

目的:对比研究波动性高浓度胰岛素与恒定性高浓度胰岛素对体外培养的人脐静脉内皮细胞的凋亡的影响,从而探究波动性高浓度胰岛素血症在糖尿病动脉粥样硬化形成中的致病机制.方法:采用体外培养的人脐静脉内皮细胞为对象,研究波动性高胰岛素对血管内皮细胞的凋亡的影响.实验分为4组,即对照组(不含胰岛素)、正常浓度胰岛素组(含胰岛素1 nmol/L)、恒定性高胰岛素组(含胰岛素100nmol/L)与波动性高胰岛素组(含胰岛素1 nmol/L及含胰岛素100 nmol/L两种条件培养液,每8小时轮换一次),每间隔8小时更换新鲜条件培养液一次,一共作用72小时.应用AO-EB染色法与流式细胞仪检测内皮细胞凋亡.结果:1、胰岛素对内皮细胞凋亡的影响1.1经不同浓度的胰岛素作用72小时后,AO-EB检测结果显示:正常浓度胰岛素组的内皮细胞凋亡细胞数明显下降,为对照组的81%(p<0.001),而恒定性高胰岛素组与波动性高胰岛素组的内皮细胞凋亡细胞数明显上升,分别为对照组的1.53倍(p<0.001)与1.75倍(p<0.001),正常浓度胰岛素组的1.88倍(p<0.001)与2.15倍(p<0.001);且波动性高胰岛素组内皮细胞凋亡细胞数显著高于恒定性高胰岛素组(p<0.001).1.2经不同浓度的胰岛素作用72小时后,流式细胞仪检测结果显示:正常浓度胰岛素组的内皮细胞凋亡率明显下降,为对照组的81%(p<0.001),而恒定性高胰岛素组与波动性高胰岛素组的内皮细胞凋亡率出现明显上升,分别为对照组的1.11倍(p<0.01)与1.39倍(p<0.001),正常浓度胰岛素组的1.37倍(p<0.001)与1.72倍(p<0.001);且波动性高胰岛素组内皮细胞凋亡率显著高于恒定性高胰岛素组(p<0.001).结论:1、波动性高胰岛素相对于恒定性高胰岛素更能诱导人脐静脉内皮细胞的凋亡.     

miR-133b靶向抑制SGTB对oxLDL诱导的血管内皮细胞损伤的影响*

目的:探讨微小RNA-133b(miR-133b)靶向抑制富含谷氨酰胺三十四肽重复序列的小蛋白质分子(SGTB)对氧化低密度脂蛋白(oxLDL)诱导的血管内皮细胞损伤的影响。方法:采用100 μg/ml的oxLDL诱导人脐静脉血管内皮细胞(EVC-304)24 h构建血管内皮细胞损伤模型。将EVC-304细胞分为对照组、oxLDL组(oxLDL处理)、oxLDL+miR-NC组(转染20 nmol/L miR-NC+oxLDL处理)、oxLDL+miR-133b组(转染20 nmol/L miR-133b mimics+oxLDL处理)、oxLDL+si-NC组(转染20 nmol/L si-NC+oxLDL处理)、oxLDL+si-SGTB组(转染20 nmol/L si-SGTB+oxLDL处理)、oxLDL+miR-133b+pcDNA组(转染20 nmol/L si-SGTB和pcDNA+oxLDL处理)、oxLDL+miR-133b+pcDNA-SGTB组(转染20 nmol/L si-SGTB和pcDNA-SGTB处理)。实时荧光定量PCR(qRT-PCR)和蛋白质印记(Western blot)检测miR-133b和SGTB的表达水平;流式细胞术检测细胞凋亡;试剂盒检测丙二醛(MDA)含量、超氧化物歧化酶(SOD)和谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)的活性;Western blot检测B细胞淋巴瘤/白血病-2(Bcl-2)和Bcl-2相关X蛋白(Bax)的表达水平。双荧光素酶报告基因实验和Western blot验证miR-133b对SGTB的靶向调控关系。结果:与对照组比较,oxLDL诱导后EVC-304细胞miR-133b、Bcl-2的表达水平显著降低(P＜0.05),SGTB、Bax的表达水平显著升高(P＜0.05),MDA含量和细胞凋亡率显著增加(P＜0.05),SOD和GSH-Px活性显著降低(P＜0.05)。过表达miR-133b或干扰SGTB均可抑制oxLDL诱导的EVC-304细胞凋亡和氧化应激损伤(P＜ 0.05)。miR-133b与SGTB直接结合,过表达miR-133b显著下调SGTB表达(P＜0.05),抑制miR-133b显著上调SGTB表达(P＜0.05)。过表达SGTB可逆转过表达miR-133b对oxLDL诱导的血管内皮细胞损伤的影响(P＜0.05)。结论:miR-133b通过靶向抑制SGTB的表达,可减轻oxLDL诱导的血管内皮细胞氧化应激损伤和细胞凋亡。     

大鼠钠泵α2亚单位M1～M2膜外区多肽体外活性鉴定

本文旨在研究含大鼠钠泵α2亚单位M1～M2膜外区的多肽片段(peptide contmning rat sodium pump α2 subunit M1-M21extramembrane fragment,RES2衍生物)是否具有与内源性钠泵抑制因子结合以及改善钠泵α亚单位活性的作用.采用Fmoc固相合成法合成多肽(Leu-Ala-Ala-Met-Glu-Asp-Glu-Pro-Ser-Asn-Asp-Asn-Gly-Gly-Gly-Ser),产物经高效液相色谱技术纯化,并进行质谱分析.采用放射性配体.受体结合法检测其与哇巴因的结合能力,进而采用人红细胞86Rb摄取实验检测其生物学活性.结果显示,RES2衍生物与3H-哇巴因具有一定的结合能力,其平衡解离常数(Kd)为38.46 nmol/L,IC50为6.353nmol/L.RES2衍生物可以阻断哇巴因对红细胞膜Na ,K -ATPase的抑制作用,使红细胞86Rb摄取率从38.53%上升到83.69%左右,并呈一定的剂量依赖关系.因此,RES2衍生物不仅具有体外结合活性,而且具有改善钠泵活性的生物学效应,为其成为有效的抗高血压药物提供科学依据.     

人血管内皮细胞缺氧早期基因系列表达分析文库的建立及分析

目的:建立常氧及缺氧早期人血管内皮细胞基因系列表达分析文库,对表达谱数据进行初步分析,为创伤后多器官功能障碍的防治奠定基础.方法:体外培养人脐静脉内皮细胞株(EA.hy926),分为正常对照组和缺氧3h处理组.采用长标签基因系列表达分析方法(Long SAGE)建立常氧及缺氧3h组人血管内皮细胞基因表达文库,通过与Genebank数据库比对确认基因,对所得标签进行初步分析.结果:通过Long SAGE技术构建了常氧和缺氧脐静脉内皮细胞Long SAGE文库.缺氧SAGE文库测得30756个标签,其中识别出的基因总数为13879,比例为45.13%;重复的双标签体总数为762.常氧SAGE文库测得标签数为31213,其中识别出的基因总数为13665,比例为43.78%;重复的双标签体总教为758.结论:成功建立了人脐静脉内皮细胞常氧和缺氧早期LongSAGE文库,获得涵盖上万个转录本信息的表达谱数据,为创伤后多器官功能障碍的防治奠定基础.     

NADPH氧化酶活性不影响主动脉平滑肌细胞负荷胆固醇

NADPH氧化酶产生的活性氧促进血管平滑肌细胞的增殖和迁移,与动脉粥样硬化的发生密切相关.为了观察NADPH氧化酶的亚基p47phox对血管平滑肌细胞胆固醇代谢的影响,把p47phox基因敲除小鼠的主动脉血管平滑肌细胞与10 mg/L水溶性胆固醇共孵育72 h,然后用0.3 mg/L凝血酶处理10 min,采用免疫组织化学和油红O染色、实时定量逆转录PCR、免疫蛋白印迹、细胞内胆固醇测定等方法,观察细胞内胆固醇的改变,与平滑肌细胞、巨噬细胞、炎症反应细胞内胆固醇代谢相关蛋白的表达.结果显示,与未孵育的对照组相比,水溶性胆固醇孵育过的主动脉血管平滑肌细胞内胆固醇明显增加,差别有显著性意义:细胞内中性脂滴明显增加;α-肌动蛋白的表达下降,半乳糖凝集素3表达升高,单核细胞趋化蛋白1及血管细胞黏附分子1的表达不变;ATP结合盒转运体A1、酰基辅酶A:胆固醇酰基转移酶1及脂肪分化相关蛋白的表达增加.但是,与野生型血管平滑肌细胞相比,敲除p47phox基因并不能使所测定的指标发生变化.结果提示,负荷胆固醇后,p47phox依赖的NADPH氧化酶并不能改变血管平滑肌细胞向泡沫细胞的转变.单纯敲除p47phox基因不能改变细胞内胆固醇代谢的状态.     

表达肌醇甲基转移酶基因载体的构建及转基因烟草的耐盐性研究

构建了肌醇甲基转移酶（Imt1）基因的植物表达载体pDH5, 通过农杆菌（Agrobacterium）介导,获得了转基因烟草(Nicotiana tabacum L. cv. SR1)植株,在附加1.2%～1.5% NaCl的生根培养基MSr(MSO 3 g/L蔗糖 7 g/L 葡萄糖)上可生根。 生化分析表明,不具有芒柄醇（D-ononitol）合成途径的烟草鲜叶片积累了100～654 nmol/g的芒柄醇, 新产生了一个代谢分支。Western杂交分析证明Imt1基因在烟草中的表达,从而为植物耐盐的基因工程育种提供了一条新途径。     

新型血管内皮细胞抑制因子VEGI_(151)的基因克隆表达及其活性

血管内皮细胞生长抑制因子 (vascularendothelialcellgrowthinhibitor,VEGI)是近年发现的一类肿瘤坏死因子超家族成员 ,具有抑制内皮细胞增殖的作用。从人脐静脉内皮细胞株 (ECV30 4)克隆到其基因 ,构建N端缺失 2 3个氨基酸的表达载体 ,并通过原核表达系统进行表达 (命名为VEGI151) ,表达量为 2 5 .5 % ,纯化后纯度达92 .5 %。通过生物学效应检测 ,发现VEGI151可明显抑制无血清培养基中内皮细胞的增殖 ,2 4h时VEGI151对内皮细胞的IC50 为 10mg/L ,0 .6 13mg/L时使内皮细胞在 36h内完全凋亡。通过检测体外培养肿瘤细胞 (A5 49、HepG2、Hela等 )的存活率 ,未发现明显的增殖或抑制效应。提示VEGI是一种主要作用于血管内皮细胞 ,在新生血管性疾病及肿瘤的治疗中有潜在的应用前景。