马蔺根系响应Cd胁迫的miRNA高通量测序分析

为了解Cd胁迫下马蔺﹝Iris lactea var. chinensis ( Fisch.) Koidz.〕根系miRNA的表达模式,采用高通量测序法对100μmol·L-1 Cd胁迫0(CK)和24 h(Cd)后马蔺根系的sRNA文库(分别为CK和Cd文库)进行分析,筛选出显著差异表达的miRNA,并对这些miRNA的靶基因功能进行预测;在此基础上,采用qRT-PCR技术对部分miRNA及其靶基因的表达模式进行验证。结果表明：在CK和Cd文库中,未注释的sRNA序列较多,分别占各自sRNA特异序列总数的86.4%和80.5%;在已注释的sRNA序列中,miRNA所占比例最低(分别为0.3%和0.5%),而rRNA所占比例最高(分别为9.4%和11.8%);2个文库中的sRNA长度主要为21~24 nt,且均以21 nt为最多。从Cd胁迫下马蔺根系sRNA中共筛选出32个显著差异表达的miRNA,其中20个miRNA表达量下调(分别属于miR165、miR166、miR167、miR168、miR390和miR396家族),12个miRNA表达量上调。功能预测结果表明：这些miRNA靶基因的功能主要集中在生物学过程、细胞组分和分子功能3个方面;而从KEGG通路富集分析看,富集在核糖体、氨基酸生物合成和碳代谢3个通路上的差异表达miRNA的靶基因数分别为122、88和82个。 qRT-PCR验证结果表明：在CK和Cd文库间,11个差异表达miRNA及8个靶基因的相对表达量均有显著差异(P<0.05);其中,11个miRNA相对表达量的上调和下调趋势与上述筛选结果一致,并且miRNA相对表达量上调时,其靶基因的相对表达量下调,反之亦然,说明Cd胁迫条件下马蔺根系的miRNA负调控其靶基因的表达,并且这些靶基因主要参与编码转录因子、HD-ZIP蛋白和信号蛋白等过程。     

家蚕5龄幼虫精巢和卵巢microRNA芯片及转录组比较分析

【目的】本研究旨在通过对家蚕Bombyx mori 5龄幼虫精巢和卵巢组织微小RNA (microRNA, miRNA)基因芯片及转录组进行分析,找到参与家蚕性腺发育相关的miRNA分子及可能的靶基因。【方法】采用新一代高通量测序平台对家蚕5龄幼虫精巢和卵巢(分别定义为Test和Control)进行miRNA基因芯片检测及转录组测序分析,根据P＜0.05且log₂(fold change, FC)≥2的标准,通过比较筛选出Test vs Control的差异表达miRNA;根据q≤0.05且|log₂(fold change)|≥1的标准,通过比较筛选出Test vs Control的差异表达基因 (differentially expressed genes, DEGs);随机选取8个上调和12个下调差异表达miRNA,对其表达及其预测的5个靶基因进行qRT-PCR验证;对DEGs以及差异表达miRNA的靶基因进行KEGG通路富集分析。【结果】从精巢和卵巢样本中(Test vs Control)分别鉴定出68个差异表达miRNA和3 991个DEGs,其中上调和下调miRNA分别为36和32个,上调和下调DEGs分别为2 033和1 958个。差异表达miRNA的qRT PCR验证结果均与芯片数据一致。KEGG通路富集分析结果显示DEGs在新陈代谢及核糖体的信号通路显著富集。对差异表达miRNA在DEGs中的可能靶基因进行预测,结果找到了4组表达趋势相反的miRNA与靶基因：分别是bmo-miR-2774a与LOC101745556;bmo-miR-92b与LOC101735954以及bmo-miR-3266与LOC733130和LOC778467;1组表达趋势一致的miRNA与靶基因：bmo-miR-3321与LOC101744895。5个靶基因的qRT-PCR验证结果与转录组测序结果一致。【结论】本研究获得了家蚕5龄幼虫精巢和卵巢转录组及miRNA芯片数据,筛选并验证了4组差异表达和1组一致表达miRNA及潜在靶基因,为探究家蚕精巢和卵巢发育差异奠定了基础。     

凡纳滨对虾低温差异表达miRNA的分析鉴定及靶基因的验证

为了解析miRNA及靶基因在凡纳滨对虾低温适应过程中的分子调控机制, 研究开展了凡纳滨对虾常温(28℃)及低温锻炼(16℃, 6d)下肝胰腺小RNA文库的测序和分析。从常温对虾的小RNA文库测序获得18—32 nt的高质量序列10690259条, 鉴定出已知的成熟miRNAs 57条; 而从低温锻炼对虾的小RNA文库获得18—32 nt的高质量序列序列8587144条, 鉴定出已知的成熟miRNAs 48条。分析获得25个在低温锻炼下呈显著差异表达的miRNAs。运用qRT-PCR验证了3条低温下差异极显著的miRNAs的表达模式。结果显示, 3条miRNAs的表达模式与高通量测序结果基本一致。预测低温差异表达miRNAs的靶基因, 并与转录组分析获得的低温显著差异表达基因进行比对, 从二者重合的基因集中挑选出4个基因, 即nuclear export mediator factor Nemf-lik、synapse-associated protein、seleno proteins 以及DEAD-box RNA helicase Variant 1, 运用qRT-PCR验证其在不同条件低温锻炼凡纳滨对虾肝胰腺中的表达规律, 为解析miRNAs及其靶基因在对虾低温适应过程中的分子调控机制提供了基础数据。     

基于RNA-seq的无量山乌骨鸡(Gallus gallus)肝脏脂代谢相关miRNAs的筛选

为研究无量山乌骨鸡(Gallus gallus)肝组织脂代谢相关miRNA (microRNA)在不同发育阶段的表达特征,本研究采集出壳当日(D1)和168日龄(D168)母鸡肝组织样品作为试验材料,利用DNBSEQ平台进行测序,采用DEGseq筛选差异表达的miRNA及其靶基因,随机选取9个差异表达miRNA进行RT-qPCR验证,KEGG通路分类筛选出脂代谢相关miRNA并进行聚类分析,预测脂代谢相关miRNA靶基因并进行GO和KEGG通路功能富集,构建脂代谢相关miRNA和靶基因关联网络。分析结果表明,筛选出106个差异表达miRNAs,包括54个上调miRNA和52个下调miRNA;聚类得到41个脂代谢相关的miRNAs;预测到38个靶基因,对靶基因的功能注释确定主要富集于甘油磷脂代谢、脂肪酸代谢和鞘脂代谢等脂质代谢相关通路,novel-gga-miR2311-5p-DGKZ、 novel-gga-miR2047-3p-ACACA、 novel-gga-miR866-3p-DGKH是脂代谢相关候选miRNA-mRNA关系对。研究提示无量山乌骨鸡肝组织miRNA在不同发育阶段的表...     

三阴性乳腺癌相关miRNA筛选及其靶基因的生物信息学分析

应用生物信息学方法筛选并分析三阴性乳腺癌（triple-negative breast cancer,TNBC）相关miRNA及其靶基因,为TNBC的研究提供潜在的分子靶点。采用GEO2R分析TNBC相关miRNA芯片数据集,筛选差异表达倍数最大的5个上调和5个下调miRNA。miRWalk、TargetScan和miRDB预测靶基因并进行Veen分析取交集。利用DAVID对靶基因进行GO富集分析和KEGG通路分析。利用STRING数据库构建蛋白互作网络,并结合Cytoscape构建miRNA-靶基因调控网络,从而筛选出关键的miRNA及其关键靶基因。利用GEPIA2数据库对靶基因进行生存分析。GEO2R筛选出486个差异miRNA,上调和下调的miRNA分别有298个和188个。对差异倍数最大的5个上调和5个下调miRNA的靶基因进行富集分析显示,靶基因主要参与ErbB信号通路、癌症中转录调控紊乱和cGMP-PKG信号通路等。miRNA-靶基因调控网络显示,表达上调的关键miRNA为miR-611,其关键靶基因为CDC27、UBE2D2、UBR1、SPSB1、HERC2和RLIM;表达下调的关键miRNA为miR-1205,其关键靶基因为WSB1、FBXL8、UBE2W、PTPN11、ARF6、DNAJC6和COPS2。生存分析表明,UBR1（P=0.007 2）和PTPN11（P=0.029）表达上调可显著降低TNBC患者的整体生存率。经筛选获得的关键miRNA及其关键靶基因可作为潜在分子标记物用于TNBC的早期诊断、治疗靶点选择和预后判断,并为后续的研究提供参考依据。     

烟草黑胫病胁迫相关miRNA鉴定及功能分析

MicroRNAs是一类非编码RNA分子,通过RNA沉默在转录后水平调控基因表达,在响应非生物和生物胁迫中扮演重要角色。本研究为了阐明烟草黑胫病抗病分子机制,构建了抗病品种云87接菌前0 h和接菌后12 h、24 h、48 h和72 h茎部组织的5个小RNA文库。运用solexa高通量测序技术鉴定出565个已知miRNAs(代表63个miRNA家族)和187个新miRNAs。在黑胫病菌胁迫下,总共有156个miRNA差异表达,大部分差异表达miRNA聚类到profile 18、profile 15和profile 9等3种显著性动态表达模式,并用qRT-PCR方法验证部分差异表达miRNA表达模式。靶基因预测和功能分析表明,差异表达miRNA主要参与调控防御响应、转录因子或信号级联途径和不同生理过程相关基因表达。本研究初步揭示了烟草与黑胫病非亲和互作间在转录后水平上的调控机制,为培育抗黑胫病烟草品种提供miRNA水平的理论依据。     

中华蜜蜂幼虫肠道响应球囊菌胁迫的microRNA应答分析

【目的】蜜蜂球囊菌(Ascosphaera apis,简称球囊菌)是一种能够侵染中华蜜蜂(Apis cerana cerana,简称中蜂)幼虫的致死性真菌病原。微小RNA(microRNA,miRNA)可通过在转录后水平靶向抑制或降解mRNA而参与宿主与病原互作过程。本研究旨在对球囊菌胁迫的中蜂6日龄幼虫肠道的差异表达miRNA(DEmiRNA)及其靶基因进行深入分析,进而揭示DEmiRNA在中蜂响应球囊菌胁迫应答过程中的作用。【方法】利用Illumina MiSeq平台对正常及球囊菌胁迫的中蜂6日龄幼虫肠道(AcCK和AcT)进行测序,通过相关生物信息学软件预测DEmiRNA及其靶基因。通过Blast将靶基因注释到GO和KEGG数据库。利用Cytoscape软件构建DEmiRNA与其靶mRNA的调控网络。通过Stem-loop RT-PCR和qPCR验证测序数据的可靠性。【结果】本研究共预测出537个miRNA,其长度分布介于16–35 nt之间,且不同长度的miRNA首位碱基偏向性差异明显。通过Stem-loop RT-PCR证实了10个novel miRNA的表达。AcCK vs AcT比较组共有54个DEmiRNA,包含31个上调和23个下调miRNA,可分别靶向结合6170和8199个靶基因。GO分类结果显示上调和下调miRNA的靶基因分别涉及47和47个条目,富集基因数最多的皆为结合细胞进程和催化活性。KEGG代谢通路(pathway)富集分析结果表明上调和下调miRNA的靶基因分别富集在134和126条pathway,富集基因数最多的均为内吞作用和内质网中的蛋白质加工。调控网络分析结果表明,DEmiRNA及其靶mRNA形成十分复杂的调控关系;31个DEmiRNA可靶向结合51个与泛素介导的蛋白水解相关的mRNA,18个DEmiRNA可靶向结合14个与Jak-STAT信号通路相关的mRNA;miR-1277-x、miR-26-x、miR-27-y、miR-30-x、miR-6052-x等16个miRNA共同参与了上述两条免疫通路的调控。最后,随机挑选3个DEmiRNA进行qPCR验证,结果证明了测序数据的可靠性。【结论】本研究提供了中蜂幼虫肠道在球囊菌胁迫后期的miRNA的表达谱和差异表达信息,揭示了球囊菌与宿主之间在miRNA组学水平存在复杂的互作。miR-6052-x和miR-1277-x作为调控网络的核心可能通过影响细胞凋亡参与宿主的免疫防御,miR-26-x和miR-30-x可能通过调控Jak-STAT信号通路参与宿主的胁迫应答。本研究筛选出的关键DEmiRNA有望作为治疗白垩病的分子靶标。     

无瓣海桑microRNA的鉴定及功能初步分析

探索红树植物无瓣海桑(Sonneratia apetala Buch.-Ham.)microRNA(miRNA)功能,寻找具有生长适应性调控潜能的关键miRNA,为后期功能验证实验及优良品质遗传育种奠定分子基础。本研究以三年生无瓣海桑幼苗为材料,在三代全长转录本基因集的基础上联合二代小RNA(small RNA, sRNA)测序技术及生物信息学分析方法对其进行miRNA挖掘、靶基因预测及功能解析,共鉴定出121个miRNA,包含105个已知miRNA和16个新miRNA,且miRNA表达量分布在7～394 345。通过对miRNA的靶基因进行预测分析,共获得653个miRNA-靶基因关系对,对应108个miRNA和412个靶基因。功能注释分析显示这些靶基因参与各类蛋白合成、转录活性调节、MAPK信号通路和信号转导等生物活动,其中高表达量miRNA对应的靶基因显示出与生长发育、胁迫信号转导、离子转运以及胁迫响应等相关的生物学功能。miR159b-3p＿1、novel＿mir27和novel＿mir29与其靶基因构成的调控网络分别与逆境胁迫、酶活性调节和光合作用密切相关。此外,本研究鉴定出...     

基于表达谱芯片和下一代测序技术筛选先天性心脏病胎儿心肌组织差异表达的miRNA

目的 联合采用表达谱芯片和下一代测序技术同时高通量筛选先天性心脏病胎儿心肌组织表达差异的miRNA.方法 实验组为孕中期先天性畸形胎儿,对照组为同胎龄无心脏畸形的难免流产的胎儿,取胎儿心室心肌组织,联合采用Agilent Human 2.0 microRNAs表达谱芯片和SOLiD下一代测序技术同时观察心肌组织microRNA的表达变化,数据采用生物信息学方法进行分析,并用实时PCR方法验证芯片结果.结果 通过差异miRNA筛选,发现先天性心脏畸形组在表达谱芯片和下一代测序中共同差异的24个miRNA,生物信息学预测到1 606个靶基因,靶基因Gene Ontology分析表明其中与细胞进程、代谢过程、生物调控相关的靶基因为主,Pathway显著性分析表明,部分靶基因为生物信号通路中的关键因子;随机挑选共同表达差异的4个miRNA进行验证,结果表明定量PCR检测结果与芯片与下一代测序共同筛选结果基本相符.结论 这些在先天性心脏病中异常表达的miRNA为研究先天性心脏病分子水平上的发病机制提供了重要的线索,将有可能为心脏相关疾病的诊断和治疗提供新的靶点和研发新的药物.     

基于转录组测序技术进行静原鸡差异miRNA与mRNA的关联分析

为探究静原鸡肌肉组织肌苷酸沉积过程的分子调控机制,本研究以静原鸡胸肌和腿肌组织作为试验材料,通过转录组测序技术,利用生物信息学分析方法筛选出差异表达miRNA及其靶基因.分析结果表明,静原鸡胸肌和腿肌组织的比较组合中有39个差异表达miRNAs(19个显著上调,20个显著下调).通过miRNA-mRNA互作网络分析可知...     

植物冷害机理及冷驯化的生理与分子学基础

介绍了近几年来植物冷害机理、冷驯化提高植物抗冷性的生理与分子生物学基础及冷信号转导的最新研究进展.     

植物冷激蛋白的研究进展

冷激蛋白是存在于细菌、植物与动物中的一类高度保守的核酸结合蛋白,其通过RNA分子伴侣活性参与转录、翻译及生长发育和逆境胁迫应答等细胞生理活动。本文主要从植物冷激蛋白的结构、表达模式、生物学功能以及应用前景等几个方面介绍了植物冷激蛋白的研究进展。     

Cold tolerance and cold hardening strategy of the Japanese pine sawyer Monochamus alternatus (Coleoptera: Cerambycidae)

The Japanese pine sawyer, Monochamus alternatus , is an important pine forest pest and vector transmitting the pine wilt nematode that causes pine wilt disease. Low temperatures in autumn, winter and spring often differentially affect mortality of M. alternatus larvae. In this paper, we mainly compared the differences of mortality and cold hardening of larvae from different seasons, based on supercooling point (SCP) and cumulative probability of individuals freezing (CPIF). The cold hardening of the larvae from autumn, winter and spring seasons were largely different. Correlations between mortality and CPIF of autumn and spring larvae were highest on day 1/4, and gradually decreased with prolonged exposure duration. This beetle's death mainly resulted from freezing in short exposure duration. However, the correlation between mortality and CPIF of winter larvae increased gradually with the prolonged exposure duration. Death did not mainly result from freezing in long exposure duration. Autumn larvae are more susceptible and adaptable than winter and spring larvae. Winter larvae have a slight freeze-tolerance trend. Our research showed that M. alternatus came into complex cold-hardening strategies under natural selection. Freeze avoidance is the primary strategy; with prolonged exposure duration to above SCP or < 0 °C, chill tolerance is more important; this is followed by freeze tolerance during harsh winters.     

采收成熟度对油桃贮藏品质的影响

以‘秦光2号＇油桃为材料,研究了5个采收成熟度油桃果实在冷藏过程中呼吸速率、硬度、可溶性固形物含量（SSC）、可滴定酸含量（TA）的变化.结果表明：（1）冷藏过程中,完熟果实（第V成熟度）在贮藏15 d后最先到达呼吸高峰,未成熟果实（第Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ成熟度）则成熟度越低呼吸高峰出现的越早,且峰值越高.（2）冷藏过程中,果实硬度和TA逐渐下降,不同成熟度果实硬度变化除第Ⅲ成熟度和第Ⅳ成熟度之间差异不显著外,其余成熟度间均有显著差异（P＜0.05）;不同成熟度果实在贮藏前期TA差异显著,但后期差异不显著;SSC在贮藏过程中表现出先升高后下降趋势.（3）在冷藏条件下,成熟度越低的果实对低温的敏感性越高,越易发生冷害.（4）第Ⅳ成熟度果实（果实底色呈乳白色,SSC 11.4%,硬度7.3 kg·cm^-2）在冷藏期间呼吸高峰出现时间晚,能保持相对较高的果实硬度和可溶性固形物含量,贮藏后货架期好果率高,贮藏效果佳,为最适宜的采收成熟度.     

Characterization and localization of fluorescent Pseudomonas cold shock protein(s) by monospecific polyclonal antibodies

Cold shock protein (CSP) from Pseudomonas fluorescens MTCC 103 and cold resistant protein (CRP) from its mutant CRPF8 of 14 and 35 kd, respectively were purified to homogeneity by HPLC. Polyclonal antibodies were raised against these proteins and the expression level was checked at different temperatures, i.e., 4, 10, 20, 30 and 37 C. Furthermore, morphological changes in P. fluorescens MTCC 103 and its mutant (CRPF8) were analyzed by transmission electron microscopy (TEM). Localization of CSP and CRP documented with immunoelectron microscopy, using colloidal gold particles conjugated with secondary antibodies being the probe were used. Nevertheless, the results of cytosolic localization of CSP and CRP were evident. Furthermore, the expression of CSP and CRP increased with decrease in temperature and the cell wall thickness of the mutant exhibited 2-fold increase, thus facilitating low temperature survival.     

低温锻炼对水稻幼苗叶片中Rubisco的影响

低温锻炼能提高水稻幼苗的抗冷力,低温锻炼虽不能明显提高Rubisoc活性,却提高了冷胁条件下Rubisoc的稳定性和增强了胁迫后正常生长条件下其活性的恢复能力。分别用火箭免疫电泳分析Rubisoc蛋白和SDS-PAGE分析大、小亚基量表明：低温锻炼未提高Rubisoc蛋白的合成能力,但增加了大、小亚基的合成量。经锻炼、冷胁迫以及恢复后Lsu／Ssu比值的变化主要是由于小亚基对温度变化更敏感所致。Rubisco酶特性分析表明,低温锻炼有减少水稻幼苗Rubisoc表面的SH数,并提高Rubisco蛋白在高、低温下的稳定性。     

RAPID COLD HARDENING PROVIDING HIGHER COLD TOLERANCE THAN COLD ACCLIMATION IN THE PINE NEEDLE GALL MIDGE THECODIPLOSIS JAPO‐NENSIS LARVAE*

Abstract The responses of overwintering larvae of the pine needle gall midge Thecodiplosis japonensis Uchida et Inouye to rapid cold hardening and cold acclimation were studied. A rapid cold hardening response is found in the 3rd instar larvae of T. japonensis. When overwintering larvae are transferred directly from 27°C to ‐ 15°C for 3 h, there is only 17.9% survival, whereas exposure to 4°C for 2 h prior to transfer to ‐ 15°C increases survival to 40.0%. The acquired cold tolerance is transient and is rapidly lost (after 15 min at 27°C). Rapid cold hardening is more effective in maintaining larval survival than cold acclimation. Different mechanisms are suggested to regulate the insect's cold hardiness under rapid cold hardening and cold acclimation.     

线虫耐寒性研究进展

对于分布在温带和寒带的线虫,它们只有战胜冬季寒冷的挑战,才能有利于种群的存在与发展。因此,耐寒性是线虫生物学研究中不可忽视的内容。综述了关于线虫在低温胁迫下的耐寒性测定方法、耐寒对策及耐寒机制等方面的研究进展。线虫的耐寒性和昆虫一样,可通过过冷却点和低温存活率两种指标进行评价,但在具体的实验方法上,线虫耐寒性研究有其不同之处。线虫的耐寒对策和耐寒机制具有多样化。耐寒对策主要有耐冻和避冻,二者能共同渗透于线虫的耐寒过程中。耐寒机制包括特殊发育阶段的形成、低温驯化作用、低分子量抗冻物质的聚集、以及高分子量抗冻蛋白和热休克蛋白的产生,等等。此外,还强调应从多个角度研究线虫的耐寒性,如寒冷敏感型线虫的研究、寄生线虫的耐寒对策研究以及交叉胁迫的研究。