携带人二氢叶酸还原酶基因慢病毒表达载体构建及鉴定

目的:构建携带人二氢叶酸还原酶(DHFR)基因的慢病毒表达载体pWPI。方法:采用PCR方法扩增二氢叶酸还原酶cDNA全长,与EZ-T克隆载体连接,HindIII及BamHI-HF限制性内切酶双酶切回收的PCR片段并补平其缺口。慢病毒系统载体使用pWPI系统,采用PmeI酶切载体后回收片段,将其磷酸化,T4酶连接载体与目的基因。表达载体鉴定均采用核苷酸序列测定,重组质粒采用脂质体转染293T包装细胞后获得包装的病毒颗粒。结果:成功扩增二氢叶酸还原酶全长并连接入pWPI载体构建成重组表达载体DHFR-pWPI,重组质粒测序结果显与DHFR基因的同源性达100%,按标准生产程序转染293T后有DHFR基因的表达。结论:成功采用慢病毒载体系统构建了二氢叶酸还原酶重组慢病毒转基因,为探讨DHFR在肿瘤多药耐药过程中的分子机理奠定基础。     

新型甲氧苄啶耐药二氢叶酸还原酶DfrB7的生化分析与宿主菌耐药机制研究

【目的】分析新型甲氧苄啶获得性耐药蛋白DfrB7的生化性质,探究其与B家族代表性的二氢叶酸还原酶(DHFR)对甲氧苄啶获得性耐药的生化基础。【方法】构建系统进化树分析B家族DHFRs与新型DfrB7的进化关系。将dfr基因分别构建到pACYC184和pET15b(+)载体并转化到相应大肠杆菌中。使用微量肉汤稀释法确定克隆菌株对甲氧苄啶的耐药性。测定DHFRs使用NADPH作为质子供体催化二氢叶酸还原的酶活反应参数。通过等温滴定量热法测定甲氧苄啶的解离常数。【结果】克隆到大肠杆菌中的新型dfrB7基因表现出对甲氧苄啶的高耐药表型。系统进化树确定了dfrB7编码B家族的DHFRs。检测并比较DfrB7和代表性DHFRs的酶活性质、抑制剂的亲和力,与染色体上DHFR相比,DfrB7与DfrB1均表现出显著降低的催化活性,通过生化实验证实B家族二氢叶酸还原酶对甲氧苄啶结合力极差。【结论】新型dfrB7基因编码的DfrB7具有B家族二氢叶酸还原酶的普遍特征。B家族二氢叶酸还原酶赋予宿主菌对甲氧苄啶的获得性耐药与该酶对甲氧苄啶的低亲和力有关。     

新载体pET-DB对带有His-tag的仓鼠二氢叶酸还原酶的高效表达与纯化

报道了带有His-tag的仓鼠二氢叶酸还原酶基因的克隆和在DB序列增强下T7启动子调控该基因在大肠杆菌中的可溶性高效表达,SDS-PAGE分析表明,带有His-tag的仓鼠二氢叶酸还原酶的含量可占大肠杆菌细胞总蛋白质含量的46%.该酶的纯化可用常规的金属络合树脂一步纯化至SDS-PAGE一条带,经凝血酶切去His-tag的仓鼠二氢叶酸还原酶与用等电聚焦法获得的无His-tag的酶有相同的酶活性.     

鸡肝二氢叶酸还原酶在盐酸胍溶液中构象的序变与激活

用蛋白质内源荧光、疏水荧光探针TNS及蛋白酶K限制性酶解等方法研究了二氢叶酸还原酶在盐酸胍变性过程中的构象变化及动力学,并与活力变化进行了比较.TNS可以监测到与激活同步的构象变化;盐酸胍浓度大于0.75mol/L时,二氢叶酸还原酶被蛋白酶K水解速度增大;当盐酸胍浓度大于1.2mol/L时,才能监测到酶分子整体构象的变化.以上结果表明二氢叶酸还原酶在盐酸胍溶液中的变性并不符合标准的二态模型,而是先经历构象逐步松散的序变过程,然后发生协同的构象伸展.二氢叶酸还原酶在低浓度盐酸胍溶液中的激活是由于酶活性部位构象的微小变化引起的.酶活性部位构象的变化虽然降低了酶与废物的结合能力,但加快了酶促反应限速步骤,即底物解离速度而使酶活力升高.     

二氢叶酸还原酶天然状态可能存在两种构象

鸡肝二氢叶酸还原酶（ＤＨＦＲ）平衡态的去折叠曲线符合二态模型,但在４．０ｍｏｌ／Ｌ脲中的去折叠动力学为两相。该酶的ＡｒｒｅｈｉｕｓＰｌｏｔ有一个拐点,但在低浓度变性剂存在下,拐点消失。用二氢叶酸还原酶的天然状态存在两种构象可以很好地解释上述现象。二氢叶酸还原酶去折叠过程中没有稳定存在的中间体,动力学过程中的两相可能是两种天然构象态的去折叠速度常数不同造成的。ＡｒｒｅｈｉｕｓＰｌｏｔ的拐点是由于在不同的温度条件下,两种天然构象的含量不同造成的,低浓度变性剂对两种构象的影响不同,使拐点消失。ＫＣｌ可以改变两种构象的平衡     

叶酰多聚谷氨酸合成酶与肿瘤耐药

叶酰多聚谷氨酸合成酶(folyl-polyglutamate synthetase,FPGS)是近几年来研究比较多的肿瘤耐药靶酶之一。随着人们对其在基因组学和蛋白组学研究的逐渐深入,涉及FPGS(分胞浆型cFPGS和线粒体型mFPGS两种异构体)与肿瘤耐药的研究也越来越多。本文就FPGS结构、功能、生化特点及其与肿瘤耐药关系作一综述,并探讨其在临床的应用前景和意义。     

人尿中一种抗菌物质三甲氧苄二氨基嘧啶的分离、纯化和鉴定

三甲氧苄二氨基嘧啶 (trimethoprim)作为一种二氢叶酸还原酶的抑制剂[1,2 ] ,它对E .coli二氢叶酸还原酶的抑制率是对人的 10 0 0 0倍[3 ,4] ,是一种常见的用于治疗细菌感染的化学药物 .它抑制细菌的主要机理是通过阻止四氢叶酸的合成从而达到抑菌作用 ,如果与磺胺类药物 (sulf     

多靶点CRISPR表达载体系统的设计和构建

CRISPR/Cas9核酸酶系统能实现多基因的高效靶向编辑,但是多靶点CRISPR表达载体的构建比较复杂。本研究以细菌的DNA旋转酶和二氢叶酸还原酶为靶基因,选择多个打靶位点,合成携带靶序列和多克隆位点的寡聚核苷酸引物,直接退火延伸合成靶序列DNA,利用同尾酶产生相同粘性末端的特点,将靶序列克隆至骨架载体,然后依次加入更多靶序列,实现多靶点的串联。最后测序验证,单靶点、双靶点和三靶点成功插入CRISPR表达载体,同时保留了多克隆位点,实现多靶点串联。本研究设计的多靶点CRISPR表达载体系统操作简单、成本低、成功率高,为后续细菌多基因编辑提供技术支撑,同时可拓展应用于其他生物多基因打靶研究。     

二氢叶酸还原酶结合底物的去除

分析了应用氨甲蝶呤（MTX-Agarose）亲和层析法提纯的鸡肝二氢叶酸还原酶的组成和性质.建立了用平面粒度胶等电聚焦法去除与酶紧密结合底物的方法．讨论了结合底物对酶构象研究的影响,并指出,用未完全去除结合底物的酶研究酶在变性过程构象变化会得到错误的结论．     

鼠伤寒沙门氏菌对三甲氧苄二氨嘧啶耐药机制的研究

对临床分离的鼠伤寒沙门氏菌进行了三甲氧苄二氨嘧啶(TMP)耐药机制的研究。结果表明,50株鼠伤寒沙门氏菌对TMP的耐药率为76％,其中7株菌对TMP高度耐药。7株耐药菌中有4株含有不同的质粒,TMP耐药质粒可以在种内和种间转移,而且8％的。SDS可以有效地消除R质粒。比较不同TMP耐药菌和对照菌的二氢叶酸还原酶(DHFR)活力和特性得出,鼠伤寒沙门氏菌TMP耐药机制为：无质粒菌的TMP耐药是由于染色体编码的DHFR过量产生所致,TMP对该酶的产生起诱导作用含质粒菌是由于R质粒编码产生了Ia型抗TMP的DHFR和R质粒编码产生了另一种新型的抗TMP的DHFR,后者目前尚无报道。此研究结果为临床合理用药及控制致病菌的耐药性发展和传播提供了理论依据。     

L615细胞染色体上二氢叶酸还原酶扩增基因的定位

在L615细胞株的细胞中发现有双微体(DM)。同样,这种细胞株的细胞中也有均质染色质区(HSR)的染色体。这条染色体为中度长短,HSR位于这条染色体的中部靠近顶端着丝点处。DM和HSR都是二氢叶酸还原酶(DHFR)基因的顺序,它们是DHFR基因的扩增。由于DHFR基因的扩增,细胞超量产生二氢叶酸还原酶,所以L615细胞对叶酸的同系物药物——氨甲喋呤(MTX)是抗性的。     

运用蛋白质组学技术研究与氨甲蝶呤耐药性相关的蛋白质

氨甲蝶呤（MTX）是一种重要的常用化疗药物,然而由于肿瘤细胞对其耐药性的增强而经常导致其疗效大大降低。为了寻找并鉴定与MTX耐药性相关的蛋白质从而为进一步闸明MTX的耐药机制提供线索,培养来源于小鼠NIH3T3的小鼠胚胎成纤维细胞系3T3R500与其耐300μmol／L MTX的细胞系MTX300,提取上述两种细胞系的总蛋白质,双向凝胶电泳分离蛋白质组成分,扫描并通过软件分析考马斯亮蓝染色的2-DE凝胶,选取表达差异最显著的点,胶内酶切后MALDI-TOF-MS进行肽指纹图谱（PMF）鉴定。图像分析显示,实验组和对照组的蛋白质组图谱之间,一些蛋白质点的表达有明显的变化。通过MALDI-TOF-MS和数据库查询,成功鉴定了耐药后表达变化最显著的蛋白质点为二氢叶酸还原酶（DHFR）,并通过Western blot验证了该结果,提示DHFR在MTX耐药机制中发挥重要作用。     

异源物代谢核受体PXR与肿瘤多药耐药相关性的研究进展

肿瘤的多药耐药性是临床化疗中迫切需要解决的问题.孕烷X受体(pregnane X receptor,PXR)为配体活化的转录因子,其下游靶基因均为主司异源性药物/毒物生物转化功能的I相、II相代谢酶及III相转运蛋白,可对药物代谢动力学过程产生重要的影响,故有可能成为逆转肿瘤多药耐药的新的药物作用靶点.本文总结了PXR在肿瘤多药耐药中的作用及机制、新型PXR配体类药物研发等方面的研究进展.     

Nrf2/ARE信号通路与胃癌耐药关系的研究进展

胃癌是癌症死亡的第二大原因。化疗是胃癌治疗的主要方法之一,胃癌化疗失败的主要原因是对化疗药物的耐受。Nrf2/ARE信号通路与肿瘤耐药的关系是当前的研究热点。转录因子Nrf2作为抗氧化反应中的关键转录因子,可以与抗氧化反应元件ARE结合,正向调节II相解毒酶、抗氧化酶及某些药物转运泵基因等靶基因的表达,诱导胃癌耐药性的产生。该综述整理归纳了Nrf2/ARE信号通路与胃癌耐药之间的关系。     

动物细胞培养及单克隆抗体

941449重组CHO细胞在其细胞周期中表达外源基因(β-半乳糖苷酶)[英]/Gu,M.B.…∥Biotechnol.Bioeng.-1993,42(9).-1113～1123[译自DBA,1993,12(25),93-14684] 用含二氢叶酸-还原酶基因(dhfr)和编码细菌β-半乳糖苷酶的LacZ基因的表达载体转染CHOβ-G72-16细胞,研究了单个该细胞中的外源蛋白     

内皮型一氧化氮合酶来源的一氧化氮通过S-亚硝基化修饰二氢叶酸还原酶抑制其降解

正内皮型一氧化氮合酶(eNOS)作为内皮细胞一氧化氮(NO)产生的主要来源,在多种心血管疾病中扮演重要角色。eNOS的功能受多种因子调控,其中四氢生物蝶呤(BH4)可通过维持eNOS偶联状态而促进其形成NO,而非解偶联状态下生成超氧阴离子,进而保护内皮生理功能。二氢叶酸还原酶(DHFR)作为生成四氢生物蝶呤(BH4)的主要蛋白酶,对内皮功能调控具有重要影响,然而eNOS对DHER是否具有调控作用及相关机制尚不清楚。     

蛋白质结晶学在蛋白质工程设计中的重要作用

本文综述了近几年来蛋白质工程的成就和进展以及蛋白质X-射线结晶学技术在蛋白质工程设计中所起的重要作用,并以酪氮酰-tRNA合成酶、二氢叶酸还原酶、T₄溶菌酶、细胞色素c、胰蛋白酶以及胰岛素原等几个实例说明如何利用蛋白质晶体结构资料进行蛋白质工程设计。     

结核分枝杆菌的耐药基因及其相关分子机制

结核分枝杆菌原发性和继发性耐药是当前控制和治疗结核病面临的重要问题,随着分子遗传学的发展,已经阐明了结核分枝杆菌耐药的分子基础是染色体的突变,影响了药靶本身或激活了药物前体的细菌酶,造成MTB的耐药。本文主要就MTB对其常用药物的耐药机制展开讨论,以便正确认识MTB对不同药物的耐药机制,建立快速检测耐药结核分枝杆菌基因型的分子生物学方法。     

结核分枝杆菌的耐药基因及其相关分子机制

结核分枝杆菌原发性和继发性耐药是当前控帝】和治疗结核病面临的重要问题,随着分子遗传学的发展,已经阐明了结核分枝杆菌耐药的分子基础是染色体的突变,影响了药靶本身或激活了药物前体的细菌酶,造成MTB的耐药。本文主要就MTB对其常用药物的耐药机制展开讨论,以便正确认识MTB对不同药物的耐药机制,建立快速检测耐药结核分枝杆菌基因型的分子生物学方法。     

中华仓鼠二氢叶酸还原酶的酶学性质研究

测定中华仓鼠二氢叶酸还原酶（ＤＨＦＲ,Ｅ．Ｃ．１．５．１．３．）催化反应的各个动力学常数,对其反应机制进行了研究。测定了不同浓度脲溶液中酶与底物的解离常数Ｋｄ和表观米氏常数Ｋｍ,结果表明酶与底物二氢叶酸（ＤＨＦ）和还原型尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（ＮＡＤＰＨ）的结合能力相差很小,都随脲浓度增加而减弱,而且一种底物的结合会削弱酶与另一底物的结合能力。研究了ＤＨＦＲ在脲变性过程中活力和构象的变化,结果表明低浓度脲可使稳态酶活力增强,此时酶的内源荧光发射光谱和ＣＤ谱变化很小;随脲浓度的增加,酶逐渐失活,同时荧光光谱的最大发射峰位红移,荧光强度和椭圆率也明显下降,说明酶活力的变化先于酶分子整体构象的变化,酶活性部位位于比酶分子整体更易受变性剂影响的有限区域,而且酶分子这种相对的和一定限度内的柔性是其表现生物活性所必需的