颗粒酶B和胱天蛋白酶-3对肌动蛋白水解作用的体外研究(英)

已知凋亡过程的基本变化之一是细胞骨架的异常,后者在某种程度上决定凋亡细胞的形态学特征.为揭示凋亡相关蛋白酶——颗粒酶B和胱天蛋白酶-3对胞浆型肌动蛋白的水解作用,采用成年猕猴脑组织粗提物作为无细胞体系,以外源性颗粒酶B触发凋亡途径的终末反应. 经一系列免疫印迹分析发现: 孵育12 h方见β-肌动蛋白被剪切,产生41 ku和15 ku水解片段,并证明该水解反应为颗粒酶B依赖;颗粒酶B活化的内源性胱天蛋白酶-3和重组胱天蛋白酶-3均不能水解脑提取物中的β-肌动蛋白,尽管胱天蛋白酶-3可作用于纯化的肌动蛋白,产生15 ku片段. 以上结果提示,内源性β-肌动蛋白对凋亡相关蛋白酶,尤其胱天蛋白酶-3不敏感,这可能与该蛋白质的空间结构特征或脑组织中存在的某种蛋白酶抑制因子有关.     

颗粒酶B和胱天蛋白酶-3对肌动蛋白水解作用的体外研究

已知凋亡过程的基本变化之一是细胞骨架的异常,后者在某种程度上决定凋亡细胞的形态学特征.为揭示凋亡相关蛋白酶--颗粒酶B和胱天蛋白酶-3对胞浆型肌动蛋白的水解作用,采用成年猕猴脑组织粗提物作为无细胞体系,以外源性颗粒酶B触发凋亡途径的终末反应.经一系列免疫印迹分析发现:孵育12 h方见β-肌动蛋白被剪切,产生41 ku和15 ku水解片段,并证明该水解反应为颗粒酶B依赖;颗粒酶B活化的内源性胱天蛋白酶-3和重组胱天蛋白酶-3均不能水解脑提取物中的β-肌动蛋白,尽管胱天蛋白酶-3可作用于纯化的肌动蛋白,产生15 ku片段.以上结果提示,内源性β-肌动蛋白对凋亡相关蛋白酶,尤其胱天蛋白酶-3不敏感,这可能与该蛋白质的空间结构特征或脑组织中存在的某种蛋白酶抑制因子有关.     

胱天蛋白酶与中枢神经系统疾病

机体的器官为了完成其功能 ,就必须有一套调节控制系统来决定细胞生存与死亡的时间[1] 。在生命进程中 ,例如发育和免疫 ,进化保守机制也发挥着重要的作用[2 ] 。由生理和病理因子介导凋亡的初级信号机制是不同的 ,每一种因子都有特定的底物。这些底物在细胞间进行信号转导 ,最终引起凋亡。然而 ,在哺乳动物细胞中 ,其引起凋亡的最终通路是共同的 ,即胱天蛋白酶 (ｃａｓ ｐａｓｅ)的激活。1 .胱天蛋白酶促凋亡信号通路与调节胱天蛋白酶是一种特异性的在天门冬氨酸残基后裂解靶蛋白 ,保守的半胱氨酸蛋白酶 ,在细胞凋亡中起关键性的作用。迄今…     

胱天蛋白酶-9

在哺乳动物细胞凋亡的过程中 ,需要一系列的半胱氨酰天冬氨酸特异性蛋白酶 (ｃｙｓ ｔｅｉｎｙｌａｓｐａｒｔａｔｅｓｐｅｃｉｆｉｃｐｒｏｔｅａｓｅ) ,简称胱天蛋白酶 (ｃａｓｐａｓｅ)。目前胱天蛋白酶家族中已有1 3个成员 ,根据其氨基端前域的不同 ,分为启动酶和执行酶。启动酶能通过其前域与信号分子结合 ,引起执行酶的活化 ,导致凋亡。胱天蛋白酶的激活途径 ,目前认为有两条 :其一是由细胞表面Ｆａｓ和ＴＮＦ等介导胱天蛋白酶 8活化 ,并依次活化下游分子胱天蛋白酶 3、6、7等 ;其二是由Ｃｙｔ ｃ/Ａｐａｆ 1 /胱天蛋白酶 9/胱天蛋白…     

线粒体凋亡途径的研究进展

线粒体凋亡途径是细胞凋亡的主要途径之一。是目前研究凋亡的热点,各种凋亡刺激信号通过BH3（Bcl-2homology domain3)-only蛋白引起Bax(Bcl-2-asslciated proteinX)蛋白移位到线粒体外膜并多聚化,形成膜通道,刺激线粒体释放细胞色素C（CytC)和Smac(second mitochondrial-derived activator of caspase),CytC通过Apaf-1因子的多聚化与胱天蛋白酶（caspases)-9形成凋亡小体,导致下游胱天蛋白酶的级联反应,而凋亡蛋白抑制因子（IAP）和Smac通过抑制和促进胱天蛋白酶的级联反应来调控细胞凋亡。     

蛋白激酶B抗细胞凋亡的信号转导机制

蛋白激酶B是抗细胞凋亡的重要调节子。蛋白激酶B的抗细胞凋亡机制主要涉及：磷酸化FoxO降低其与凋亡有关的转录活性;使凋亡抑制剂存活蛋白(survivin)的表达增加;使NF-κB活化并转位入核,启动抗凋亡基因的转录;使胱天蛋白酶-8(caspase-8)抑制剂FLIP(FADD—like ICE inhibitory protein)的表达增加;磷酸化MDM2使其转位入核进而抑制p53的促凋亡作用;使糖原合成酶激酶3失活;磷酸化Bad使其与Bcl-2或Bcl—XL解离而抗细胞凋亡;直接磷酸化胱天蛋白酶-9使其激活下游胱天蛋白酶的能力降低。     

半胱天冬酶（caspase）

半胱天冬酶是ＩＣＥ／ＣＥＤ－３蛋白酶家族的总称,在细胞凋亡中起着关键的作用,迄今已鉴定的人类半胱天冬梅共有１１种,其底物可分为４类,半胱天冬酶的激活机制已初见端倪,有非自然抑制剂和自然抑制剂,抑制半胱天冬酶活性作为神经变性疾病的治疗途径已开始探索。     

猕猴脑胱天蛋白酶-3活化及其靶蛋白的体外研究

凋亡的主要生化过程包括胱天蛋白酶的活化及其对细胞内蛋白质的选择性切割.在已知的胱天蛋白酶中,可被多种凋亡刺激信号激活的胱天蛋白酶-3备受注目.为进一步揭示灵长类动物神经组织中未知的胱天蛋白酶-3靶蛋白,采用成年猕猴脑组织粗提物作为无细胞体系,通过加入granzyme B引发凋亡途径的部分反应,如胱天蛋白酶-3的活化及随后发生的蛋白质水解.经蛋白质印迹分析发现,与granzyme B共孵育后,猕猴脑胱天蛋白酶-3以两步方式从酶原转化为活性酶.对猕猴脑组织自身蛋白质的进一步分析显示,多聚ADP-核糖聚合酶(PARP)被水解为长85 ku的片段,此片段提示胱天蛋白酶-3的特异切割活性.此外,神经元凋亡抑制蛋白(NAIP)也被切割,产生长约40 ku的小片段,但是它的出现不被胱天蛋白酶-3特异性抑制剂Ac-DEVD-CHO阻断,因此可能是granzyme B直接作用于NAIP所致.以上结果提示,凋亡相关酶切反应可在成年猕猴脑组织提取物中得到重现;NAIP可能是granzyme B而非胱天蛋白酶-3的作用靶点.     

猕猴脑胱天蛋白酶-3活化及其靶蛋白的体外研究(英)

凋亡的主要生化过程包括胱天蛋白酶的活化及其对细胞内蛋白质的选择性切割.在已知的胱天蛋白酶中,可被多种凋亡刺激信号激活的胱天蛋白酶-3备受注目.为进一步揭示灵长类动物神经组织中未知的胱天蛋白酶-3靶蛋白,采用成年猕猴脑组织粗提物作为无细胞体系,通过加入granzyme B引发凋亡途径的部分反应,如胱天蛋白酶-3的活化及随后发生的蛋白质水解.经蛋白质印迹分析发现,与granzyme B共孵育后,猕猴脑胱天蛋白酶-3以两步方式从酶原转化为活性酶.对猕猴脑组织自身蛋白质的进一步分析显示,多聚ADP-核糖聚合酶（PARP）被水解为长85 ku的片段,此片段提示胱天蛋白酶-3的特异切割活性.此外,神经元凋亡抑制蛋白（NAIP）也被切割,产生长约40 ku的小片段,但是它的出现不被胱天蛋白酶-3特异性抑制剂Ac-DEVD-CHO阻断,因此可能是granzyme B直接作用于NAIP所致.以上结果提示,凋亡相关酶切反应可在成年猕猴脑组织提取物中得到重现;NAIP可能是granzyme B而非胱天蛋白酶-3的作用靶点.     

Procaspase-8失调与肿瘤细胞对TRAIL的耐受

肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(TRAIL)可激活胱天蛋白酶（caspase）家族蛋白系列级联反应,最终诱导细胞凋亡. TRAIL选择性地诱导肿瘤细胞凋亡而不损伤正常细胞,使其成为治疗癌症的潜在药物靶点. 目前已知,细胞型FADD样白介素-1-β转换酶抑制蛋白(c FLIP)和凋亡抑制蛋白(IAPs)是肿瘤细胞对TRAIL耐受的主要原因.胱天蛋白酶原-8（procaspase-8）是TRAIL凋亡信号途径中的凋亡起始蛋白. 然而近年发现,在某些肿瘤细胞中procaspase-8功能失调常会阻碍凋亡信号传导,使肿瘤细胞对TRAIL诱导的凋亡产生耐受. 本文就其机制进行概述.     

X连锁凋亡抑制蛋白抑制剂:肿瘤治疗的新靶点

该文介绍凋亡抑制蛋白（inhibitor of apoptosis protein,IAP）家族成员之一,X连锁凋亡抑制蛋白（X-linked inhibitor-of-apoptosis protein,XIAP）的结构特点;与胱天蛋白酶（caspase）家族成员结合的机制,及其XIAP的负调节因子,尤其是有望作为抗肿瘤药物应用前景小分子抑制剂的研究现况.     

JNK信号转导与细胞凋亡

JNK是一类MAPK蛋白,介导细胞的信号转导,通过启动细胞中的胱天蛋白酶家族蛋白激酶,诱导细胞凋亡。本文主要就JNK信号转导在细胞凋亡中的作用及其机制进行阐述。     

青少年型神经元蜡样脂褐质沉积病(JNCL)的发病机制

神经元蜡样脂褐质沉积病(Neuronal ceroid lipofuscinosis, NCLs)是一组儿科神经退行性变疾病, 青少年型神经元蜡样脂褐质沉积病(Juvenile neuronal ceroid lipofuscinosis, JNCL)是其中一型。其临床表现包括视网膜退化进而失明、癫痫以及进行性的认知和运动能力的减退。本文综述了其发病机制, 包括凋亡、自噬、质膜相关的功能障碍、氧化应激与NO转导通路受阻、线粒体和溶酶体功能障碍、胞内pH失衡等。其中研究最为清楚的是细胞凋亡和自噬两种方式。在凋亡中, CLN3基因正常功能的缺陷导致神经酰胺的积累, 导致线粒体膜通透性增加(MMP), 并最终引发依赖胱酰蛋白酶(Caspase)以及非依赖胱酰蛋白酶的凋亡。自噬既有发生又有被破坏, 其破坏的主要原因是自噬小泡的不成熟导致自噬不能有效循环。本文对发病机制, 尤其是其细胞死亡的途径的阐述, 将有助于对JNCL等神经退行性病变一类疾病的认识。     

凋亡相关的斑点样蛋白ASC

与凋亡相关的斑点样蛋白ASC是一种含胱天蛋白酶募集域和热蛋白样结构域的蛋白质,它与NF-кB、胱天蛋白酶-1(caspase-1)和热蛋白(pyrin)等多种分子有关,在炎症、细胞凋亡和肿瘤等方面发挥重要作用。     

原虫凋亡中相关酶类研究进展

近年鉴定到Metacaspase、组织蛋白酶B、组织蛋白酶D、核酸酶(Endo G、Tatd、Fen-1)等分子参与了原虫的凋亡,但不清楚这些分子在凋亡信号途径中的位置及相互关系。实验结果显示,Metacaspase可能具有调节原虫凋亡与细胞周期等功能,但是Metacaspase与Caspase的活化方式及作用底物不同,提示原虫存在与多细胞动物不同的凋亡途径;在疟原虫及利什曼原虫中发现其线粒体及溶酶体参与了其凋亡,提示原虫可能具有类似哺乳动物的溶酶体-线粒体凋亡途径;在利什曼原虫和锥虫中发现存在通过核酸酶而不依赖Caspase的凋亡途径。阐明原虫的凋亡机制有助于通过设计新药物诱导原虫凋亡来达到治疗疾病的目的。     

核转录因子TR3的转位与细胞凋亡

在诸多凋亡路径中 ,线粒体膜的渗透性改变是导致多种凋亡关键分子从线粒体膜内腔释放出来的主要原因。这些分子包括胱天蛋白酶原 (ｐｒｏ ｃａｓｐａｓｅ)、细胞色素ｃ(胱天蛋白酶的激活剂 )、Ｓｍａｃ/Ｄｉａｂｌｏ(胱天蛋白酶的协同激活剂 ) [1] 等。Ｌｉ等[2 ] 新近发现了一种凋亡前期转录因子ＴＲ3,又称作Ｎｕｒ77或ＮＧ ＦＩＢ ,通常它存在于细胞核中 ,某种情况下也能转移到线粒体中 ,并引起线粒体膜的渗透性变化 ,最终导致细胞凋亡。ＴＲ3是一种类固醇 甲状腺激素 类维生素Ａ类转录因子 ,它有一个中央锌指状ＤＮＡ结合结构域 ,在其两…     

胱冬肽酶非依赖性的细胞程序性死亡

在多细胞有机体的组织内稳态维持和正常发育过程中,细胞程序性死亡发挥着重要的作用。细胞程序性死亡有多种形式(如细胞凋亡、类细胞凋亡和类坏死等),其中了解较清楚的是细胞凋亡。一直以来,胱冬肽酶(caspase)被认为是细胞凋亡发生中关键的一种蛋白酶。但是最近的研究表明,包括细胞凋亡在内的一些细胞程序性死亡可以以一种不依赖胱冬肽酶的方式发生。细胞程序性死亡与胱冬肽酶之间存在非依赖性关系。     

凋亡诱导因子(AIF)对细胞凋亡的调控

凋亡诱导因子（apoptosis-inducing factor,AIF）是一种具有凋亡诱导活性的蛋白质,定位于线粒体的膜间隙.细胞受到凋亡刺激时,AIF分子从线粒体释放到胞质,然后再易位到核,与染色体DNA结合,使染色体核周边凝集和DNA断裂成约50kb的大片段.AIF具有凋亡诱导活性和氧化还原酶活性,但二者的作用是脱偶联的.AIF是第一个被鉴定出可以不依赖于胱天蛋白酶（caspase）信号通路而直接介导细胞发生凋亡的分子,但后来也有的报道认为AIF的凋亡活性需依赖于胱天蛋白酶.     

瞬时受体电位香草酸亚型1激活通过抑制线粒体通透性转换孔开放保护急性心肌梗死小鼠的心肌细胞抗凋亡北大核心CSCD

瞬时受体电位香草酸亚型1(TRPV1)在心肌缺血激活后可传导心绞痛信号,释放神经肽,减轻心肌梗死后的心肌细胞凋亡。目前,TRPV1激活抑制心肌梗死后细胞凋亡的具体机制尚不清楚。线粒体通透性转换孔(MPTP)的开放与心肌细胞缺血再灌注损伤密切相关,抑制其开放可保护心肌缺血后的心肌细胞抗凋亡。本研究证明,TRPV1激活通过抑制MPTP开放而减少心肌细胞凋亡。首先,本研究利用左冠状动脉前降支结扎术建立了TRPV1基因敲除(TRPV1-/-)和野生型(WT)小鼠心肌梗死模型,辅以环孢素A(CSA)预处理抑制MPTP开放,比较观察TRPV1、MPTP在心肌梗死中的作用。心肌组织切片氯化三苯基四氮唑(TTC)染色显示,心肌缺血24 h,TRPV1-/-小鼠的心肌梗死面积明显大于WT型小鼠。而经CSA预处理的TRPV1-/-小鼠比TRPV1-/-小鼠梗死面积明显减小。TUNEL检测心肌细胞凋亡指数(AI)揭示,WT型心肌梗死小鼠的AI明显低于TRPV1-/-心肌梗死小鼠,而CSA预处理明显降低TRPV1-/-小鼠心肌细胞的AI。Western印迹检测胱天蛋白酶3、胱天蛋白酶9、Bcl-2、Bax、p53和细胞色素C(Cyt-C)水平。结果证明,TRPV1的激活可抑制MPTP的开放,减少线粒体Cyt-C的外溢,降低胱天蛋白酶9和胱天蛋白酶3的表达。GENMEN光度法检测MPTP开放实验显示,激活的TRPV1明显抑制了MPTP的开放。本研究证实,急性心肌梗死后的TRPV1激活可能通过抑制MPTP开放而抵抗心肌细胞凋亡,对心肌起保护作用。     

瞬时受体电位香草酸亚型1激活通过抑制线粒体通透性转换孔开放保护急性心肌梗死小鼠的心肌细胞抗凋亡

瞬时受体电位香草酸亚型1（TRPV1）在心肌缺血激活后可传导心绞痛信号,释放神经肽,减轻心肌梗死后的心肌细胞凋亡。目前,TRPV1激活抑制心肌梗死后细胞凋亡的具体机制尚不清楚。线粒体通透性转换孔（MPTP）的开放与心肌细胞缺血再灌注损伤密切相关,抑制其开放可保护心肌缺血后的心肌细胞抗凋亡。本研究证明,TRPV1激活通过抑制MPTP开放而减少心肌细胞凋亡。首先,本研究利用左冠状动脉前降支结扎术建立了TRPV1基因敲除（TRPV1-/-）和野生型（WT）小鼠心肌梗死模型,辅以环孢素A（CSA）预处理抑制 MPTP开放,比较观察TRPV1、MPTP在心肌梗死中的作用。心肌组织切片氯化三苯基四氮唑（TTC）染色显示,心肌缺血24 h,TRPV1-/-小鼠的心肌梗死面积明显大于WT型小鼠。而经CSA预处理的TRPV1-/-小鼠比TRPV1-/-小鼠梗死面积明显减小。TUNEL检测心肌细胞凋亡指数（AI）揭示,WT型心肌梗死小鼠的AI明显低于TRPV1-/- 心肌梗死小鼠,而CSA预处理明显降低TRPV1-/-小鼠心肌细胞的AI。Western印迹检测胱天蛋白酶3、胱天蛋白酶9、Bcl-2、Bax、p53和细胞色素C（Cyt-C）水平。结果证明,TRPV1的激活可抑制MPTP的开放,减少线粒体Cyt-C的外溢,降低胱天蛋白酶9和胱天蛋白酶3的表达。GENMEN光度法检测MPTP开放实验显示,激活的TRPV1明显抑制了MPTP的开放。本研究证实,急性心肌梗死后的TRPV1激活可能通过抑制MPTP开放而抵抗心肌细胞凋亡,对心肌起保护作用。