同一滴度不同方法转染AAV9-SERCA2a基因对大鼠的有效性和毒副作用评价

目的研究同一滴度不同心脏基因转染方法转染携带肌浆网钙ATP酶2a(sarcoplasmic reticulumCa2+ATPase 2a,SERCA2a)基因的9型腺相关病毒(adeno-associated virus serotype 9,AAV9)即AAV9-SERCA2a对SD大鼠心肌的有效性及对机体毒副作用的影响。方法体外成功构建AAV9-SERCA2a-EGFP病毒载体系统,90只雄性SD大鼠随机分为尾静脉注射(tail vein injection,TVI)组、心肌注射(intramyocardial injection,IMI)组、心包腔注射(intrapericardial injection,IPI)组,采用相应方法在体分别转染滴度1×1011vg/mL AAV9-SERCA2a-EGFP、AAV9-EGFP、NS各200μL。转染后30 d,荧光显微镜下观察心肝肾组织绿色荧光表达情况,Western blot检测SER-CA2a基因在大鼠各组织的相对表达量,体表12导联心电图检测心律失常发生率,HE染色观察病理学变化,心脏彩色多普勒超声评价心功能,血液生化学指标检测肝肾功能。结果三组左心室可见大量绿色荧光表达,IMI组荧光局限在注射点,三组肝肾组织均可见微弱荧光;三组心肌SERCA2a蛋白相对表达量显著高于肝肾(P<0.01),TVI组和IMI组心肌SERCA2a蛋白相对表达量明显高于IPI组(P<0.01);TVI组和IPI组心电图正常,IMI组2只大鼠发生室性早搏;三组转染AAV9-EGFP、AAV9-SERCA2a-EGFP与转染NS相比,心功能、组织病理学、血液生化学指标差异均无显著性(P>0.05)。结论三种方法转染滴度1×1011vg/mL AAV9-SERCA2a基因,TVI法和IMI法在心肌的有效性优于IPI法,TVI法和IPI法对机体的毒副作用小于IMI法,综合三种方法的有效性和毒副作用评价,TVI法优于IMI法和IPI法。     

肌浆网钙ATP酶过表达对心房颤动兔心房及L型钙通道a1c蛋白表达的影响

目的探讨心肌肌浆网钙ATP酶2a(SERCA2a)基因过表达,对兔急性心房颤动(AF)的心房肌L型电压依赖钙通道蛋白alc亚单位(LVDCCalc)表达的影响。方法 48只成年新西兰兔,随机分成为房颤组(AF组,n=12)、9-型腺相关病毒+增强型绿色荧光蛋白组+房颤组(rAAV9+EGFP+AF组,n=12)、9-型腺相关病毒+肌浆网钙ATP酶2a+增强型绿色荧光蛋白组+房颤组(rAAV9+SERCA2a+EGFP+AF组,n=12),并设假手术组作为对照(Control组,n=12)。rAAV9+EGFP+AF组和rAAV9+SERCA2a+EGFP+AF组起搏前30 d开胸心包腔内注射包含报告基因的rAAV9-EGFP和包含靶基因的rAAV9-SERCA2a-EGFP各500μL(1×1012v.g/μL)。转染30 d后,AF组、rAAV9+EGFP+AF组和rAAV9+SERCA2a+EGFP+AF组,以600 BPM刺激频率,持续起搏兔右心房24h制作AF模型。处死各组动物,倒置荧光显微镜下观察右心房肌组织EGFP表达情况,行HE染色对右心房组织形态检查,应用免疫组化技述检测SERCA2a蛋白及LVDCCalc蛋白在心房肌中的表达情况。结果 rAAV9+EGFP+SERCA2a+AF组SERCA2a蛋白及LVDCCalc蛋白表达量显著高于AF组和rAAV9+EGFP+AF组(P<0.05),但与对照组比较差异无显著性。结论心房肌转SERCA2a基因,显著减少了急性房颤心房肌的LVDCCa1c蛋白表达的降低,有逆转急性AF电重构的作用。     

应用Ad Easy腺病毒载体系统构建人肌浆网钙离子ATP酶2a(SERCA2a)

目的:利用Ad easy腺病毒表达系统构建含人肌浆网钙离子ATP酶2a(SERCA2a)基因重组腺病毒,并在HEK293细胞中扩增制备重组腺病毒.方法:将人SERCA2a基因全长c DNA(3700bp)插入到腺病毒穿梭载体pAdTrack-CMV,成功构建pAd-TrackCMV SERCA2a重组质粒,经Pme I酶切线性化,采用电击法转入到已含Ad easy质粒的电感受态菌BJ5183进行重组.挑选同源重组质粒,Pac I酶切线性化转染HEK293细胞包装成重组腺病毒颗粒,荧光检测有绿色荧光蛋白表达.将重组病毒和SD大鼠心肌细胞共培养,western-blot检测SERCA2a可以在大鼠心肌细胞过表达且影响了胞内SERCA2a的活性.结果:成功包装含人SERCA2a基因的重组腺病毒,并可以有效感染SD大鼠心肌细胞.结论:利用新型腺病毒载体在短时间内成功构建了携带有人SERCA2a基因的腺病毒,为以后进一步研究人SERCA2a基因治疗提供了新途径.     

心力衰竭家兔心肌肌浆网钙回摄功能的异常及其影响因素

本文旨在探讨心力衰竭家兔心肌肌浆网钙回摄功能的异常及其影响因素和可能的机制。用主动脉破瓣术加腹主动脉缩窄术造心衰模型,用钙离子荧光成像仪检测心肌肌浆网钙回摄功能,用无机磷酸根法测定心肌肌浆网钙泵的活性,用Western blot检测各组心肌组织中肌浆网钙泵(SERCA2a)、受磷蛋白(PLB)、16位丝氨酸磷酸化-受磷蛋白(PLB-Ser16)、17位苏氨酸磷酸化-受磷蛋白(PLB-Thr17)、Ca2+∕钙调素依赖的蛋白激酶II(CaMKII)、蛋白激酶A(PKA)和蛋白磷脂酶(PP1α)的蛋白表达,用γ-32P底物掺入法测定CaMKII、PKA的活性。结果显示,与假手术组相比,心衰组钙回摄量显著下降(P0.01),SERCA2a在心肌中的表达量和活性均显著下降(P0.05),PLB的表达水平及其磷酸化位点(Ser16、Thr17)的磷酸化状态明显降低(P0.05),且PKA和CaMKII的表达及活性均明显升高(P0.05或P0.01),PP1α的表达量显著升高(P0.05)。以上结果证实心衰家兔模型心肌肌浆网钙回摄功能的异常与SERCA2a的表达活性、PLB及其磷酸化水平均显著下降有关,提示PLB的两个磷酸化位点(Ser16、Thr17)可能共同参与心衰家兔心肌肌浆网钙泵活性的调节。     

β_1-肾上腺素受体表达的增加未能保护异丙肾上腺素损伤的大鼠心肌细胞

本文旨在观察转染β1-肾上腺素受体(β1-adrenoceptor,β1-AR)基因对异丙肾上腺素(isoprenaline,ISO)损伤的大鼠心肌细胞收缩功能和存活的影响。采用胶原酶消化法分离培养原代大鼠心肌细胞,转染含β1-AR基因的腺病毒后,用ISO孵育24h致心肌细胞损伤,采用Westernblot检测心肌细胞β1-AR蛋白的含量,通过计数培养细胞中杆状细胞的百分率来检测心肌细胞存活率,用可视化边缘探测系统检测心肌细胞收缩功能变化。结果显示,与对照组相比,转染β1-AR基因的心肌细胞β1-AR蛋白含量明显增加(P0.01);转染β1-AR基因并用ISO损伤的心肌细胞内β1-AR蛋白含量亦明显增加(P0.01)。与对照组相比,转染β1-AR基因的心肌细胞存活率没有明显变化,ISO损伤的心肌细胞存活率明显下降(P0.01);而转染β1-AR基因并用ISO损伤的心肌细胞存活率与ISO组比进一步下降(P0.01)。与对照组相比,转染β1-AR基因的心肌细胞收缩幅度显著增大(P0.05),ISO损伤的心肌细胞收缩幅度明显下降(P0.01);而转染β1-AR基因并用ISO损伤的心肌细胞的收缩幅度与ISO组比没有明显变化。以上结果提示,β1-AR的表达增加对ISO损伤的大鼠心肌细胞的保护作用不明显。     

Sim2基因对PC12细胞周期的影响

观察Sim2基因对PC12细胞周期及细胞周期调控蛋白表达水平影响,初步阐明Sim2基因在Down综合征发病机制中的作用.以脂质体法将pcDNA3-mSim2真核表达载体瞬时转染PC12细胞;以RT-PCR方法检测mSim2基因在PC12细胞的表达;流式细胞仪观察细胞周期分布的变化;RT-PCR和免疫组织化学方法分别检测细胞周期调节蛋白Ｅ（cyclin E）和p27 mRNA和蛋白水平的表达变化.RT-PCR结果显示,瞬时转染pcDNA3-mSim2的PC12细胞中有明显的mSim2 mRNA表达;流式细胞仪检测发现,与对照组和空载体组相比,转染mSim2后,处于G₀/G₁期的PC12细胞百分比明显升高（Ｐ<0.01）,而G₂/M期的细胞百分比明显降低 (Ｐ<0.01);在mRNA和蛋白水平上,转染mSim2的细胞细胞周期蛋白E表达较对照组明显降低;而p27的表达明显升高(Ｐ<0.01).以上结果表明,mSim2基因可能通过影响神经元前体细胞的增殖在Down综合征发病机制中发挥了重要作用.     

肌浆网钙ATP酶过表达对心房颤动兔心房及L型钙通道alc蛋白表达的影响

目的探讨心肌肌浆网钙ATP酶2a（SERCA2a）基因过表达,对兔急性心房颤动（AF）的心房肌L型电压依赖钙通道蛋白alc亚单位（LVDCCalc）表达的影响。方法48只成年新西兰兔,随机分成为房颤组（AF组,n=12）、9一型腺相关病毒＋增强型绿色荧光蛋白组＋房颤组（rAAV9＋EGFP＋AF组,n=12）、9一型腺相关病毒＋肌浆网钙ATP酶2a＋增强型绿色荧光蛋白组＋房颤组（rAAV9＋SERCA2a＋EGFP＋AF组,n=12）,并设假手术组作为对照（Control组,,l=12）。rAAV9＋EGFP＋AF组和rAAV9＋SERCA2a4-EGFP4-AF组起搏前30d开胸心包腔内注射包含报告基因的rAAV9一EGFP和包含靶基因的rAAV9-SERCA2a—EGFP各500肛L（1×10”v．g／ptL）。转染30d后,AF组、rAAV9＋EGFP＋AF组和rAAV9＋SERCA2a＋EGFP＋AF组,以600BPM刺激频率,持续起搏兔右心房24h制作AF模型。处死各组动物,倒置荧光显微镜下观察右心房肌组织EGFP表达情况,行HE染色对右心房组织形态检查,应用免疫组化技述检测SERCA2a蛋白及LVDCCalc蛋白在心房肌中的表达情况。结果rAAV9＋EGFP＋SERCA2a4-AF组SERCA2a蛋白及LVDCCalc蛋白表达量显著高于AF组和rAAV9＋EGFP＋AF组（P〈0．05）,但与对照组比较差异无显著性。结论心房肌转SERCA2a基因,显著减少了急性房颤心房肌的LVDCCalc蛋白表达的降低,有逆转急性AF电重构的作用。     

心衰大鼠心肌细胞β2-AR的表达与心功能改变的关系及机制

目的:探讨慢性心衰大鼠心肌细胞β2肾上腺素能受体(β2-AR)的表达变化,过表达β2-AR后心肌细胞收缩功能的改变及其可能机制.方法:通过腹主动脉缩窄术建立大鼠慢性心力衰竭(CCF)模型并采用胶原酶消化法分离心衰大鼠心肌细胞.转染携带β2-AR目的基因的重组腺病毒,通过免疫印迹方法检测正常细胞和心衰细胞β2-AR蛋白表达的变化,采用单个细胞动态边缘检测系统测定其收缩功能的改变.结果:与正常细胞相比,心衰时β2-AR蛋白的表达没有变化,转染β2-AR基因则使之表达增加(P＜0.05).与正常组相比,心衰组的基础收缩明显降低(3.955±1.684%vs5.472±2.918%,P＜0.01);过表达β2-AR逆转了心衰心肌细胞的基础收缩(5.882±2.208%vs3.955±1.684%,n=60,P＜0.01),但不影响心衰心肌细胞的最大收缩(9.366±2.646%vs9.066±3.509%).结论:心衰时大鼠心肌细胞BrAR的表达不变,但是其基础收缩功能降低,而β2-AR的过表达则能够改善心衰细胞的基础收缩功能.     

EDU 免疫荧光法检测整合素连接激酶（ILK）高表达 对新生大鼠心肌细胞DNA 合成的影响

目的:通过EDU免疫荧光法观察整合素连接激酶(Integrin-Linked Kinase,ILK)在新生大鼠心肌细胞内高表达后对心肌细胞DNA合成的影响。方法:取新生(1-3天内)大鼠原代心肌细胞,培养72小时后随机分为正常对照组、ILK转染组。对照组转染重组腺病毒载体(adeno-GFP),ILK组转染重组腺病毒载体+ILK基因(adeno-ILK)。转然成功后48小时将两组心肌细胞分别通过5-乙基-2’-脱氧尿嘧啶核苷(EDU)免疫荧光法测定心肌细胞DNA合成。结果:ILK转染组心肌细胞内DNA合成较对照组明显增加(P<0.05)。结论:ILK高表达具有促进新生大鼠心肌细胞的DNA合成的能力。     

黄芪注射液对网腔钙结合蛋白基因沉默阿霉素损伤心肌细胞内质网应激伴侣蛋白GRP78,GRP94 mRNA的作用

目的：研究黄芪注射液对网腔钙结合蛋白（calumenin）基因沉默阿霉素损伤心肌细胞内质网应激伴侣蛋白GRP78,GRP94 mRNA的作用。方法：实验将体外培养的1~3 d乳鼠心肌细胞分为5组：对照组、模型组（正常细胞+3 mg/L阿霉素）、calumenin基因沉默模型组（慢病毒感染细胞+3 mg/L阿霉素）、黄芪组1（正常细胞+3 mg/L阿霉素+200 g/L黄芪）、黄芪组2（慢病毒感染细胞+3 mg/L阿霉素+200 g/L黄芪）。构建慢病毒-calumenin质粒,转染乳鼠培养心肌细胞,采用实时荧光定量分析（real-time PCR）检测各组心肌细胞calumenin及内质网应激伴侣蛋白GRP78、GRP94 mRNA表达。结果：①与对照组比较,模型组心肌细胞calumenin mRNA表达减少（P<0.05）,而calumenin基因沉默模型组及黄芪组2心肌细胞calumenin mRNA表达明显减少（P<0.01）;与模型组比较,黄芪组1心肌细胞calumenin mRNA表达增加（P<0.05）;与calumenin基因沉默模型组比较,黄芪组2心肌细胞calumenin mRNA表达明显增加（P<0.01）。②与对照组相比较,模型组及calumenin基因沉默模型组心肌细胞内质网应激伴侣蛋白GRP78、GRP94 mRNA表达明显增多（P<0.01）;与模型组比较,黄芪组1心肌细胞GRP78、GRP94 mRNA表达明显减少（P<0.01）;与calumenin基因沉默模型组比较,黄芪组2心肌细胞内质网应激伴侣蛋白GRP78、GRP94 mRNA表达明显减少（P<0.01）。结论：①阿霉素损伤可引起心肌细胞calumenin表达减少。②Calumenin可缓解阿霉素损伤所诱导心肌细胞内质网应激。黄芪注射液可抑制阿霉素损伤所诱导心肌细胞内质网应激,这种作用可能系通过calumenin介导实现的。     

鸭CD36基因表达对前列腺癌PC3细胞增殖的影响

为了探讨鸭CD36基因表达对前列腺癌PC3细胞增殖的效应,通过克隆鸭CD36基因CDS区,构建真核表达载体pEGFP-N3+CD36+His,空载体pEGFP-N3为对照,转染培养的前列腺癌PC3细胞。结果表明:前列腺癌PC3细胞均被pEGFP-N3+CD36+His和pEGFP-N3成功转染,转染效率均较高;通过检测转染48 h的CD36+His-tag融合蛋白表达量和细胞数量,CD36+His-tag融合蛋白表达量为98.81 pg/m L,pEGFP-N3+CD36+His组细胞数为0.72×10~6个,pEGFP-N3组细胞数为0.61×10~6个,pEGFP-N3+CD36+His组细胞数显著高于pEGFP-N3组。研究结果揭示,鸭CD36基因的表达对前列腺癌PC3细胞增殖和生长可能有促进作用。     

基于NF-κB通路探讨IRAK3基因表达对脂多糖诱导的心肌细胞损伤的作用及机制

摘要 目的：探讨白介素1受体相关激酶3（IRAK3）基因表达对脂多糖（LPS）诱导的心肌细胞损伤的作用及机制。方法：分离培养SD乳鼠原代心肌细胞,随机分为对照组、LPS组、siIRAK3组和siIRAK3+LPS组。siIRAK3组和siIRAK3+LPS组心肌细胞转染IRAK3沉默核糖核酸（siRNA）,对照组和LPS组转染阴性对照siRNA。转染48 h后LPS组和siIRAK3+LPS组分别用LPS（10 μg/mL）处理心肌细胞6 h,对照组和siIRAK3组加入等量的PBS溶液。采用免疫蛋白印迹法（Western blot）检测LPS对心肌细胞IRAK3表达的影响,采用细胞计数试剂盒-8（CCK-8）法检测四组心肌细胞增殖,采用原位末端转移酶标记技术（TUNEL）检测四组心肌细胞凋亡。采用酶联免疫吸附测定（ELISA）检测四组心肌细胞上清液中炎症因子白介素（IL）-6、肿瘤坏因子（TNF）-α的水平。Western blot检测核转录因子-κB（NF-κB）蛋白和NF-κB抑制蛋白α（IκB-α）的表达。结果：Western bolt结果显示,LPS使原代心肌细胞IRAK3的蛋白表达升高（P<0.05）,CCK-8和TUNEL结果显示,与对照组相比,LPS组心肌细胞活力降低,心肌细胞凋亡比例升高（P<0.05）;siIRAK3组细胞活力和细胞凋亡比例与对照组相比均无明显差异（P>0.05）。与LPS组相比,siIRAK3+LPS组心肌细胞活力升高,心肌细胞凋亡比例降低（P<0.05）。与对照组相比,LPS组心肌细胞分泌的IL-6、TNF-α升高,NF-κB蛋白表达升高而IκB-α蛋白表达降低（P<0.05）。与LPS组相比,siIRAK3+LPS组心肌细胞炎症因子分泌减少,NF-κB蛋白表达降低,IκB-α蛋白表达升高（P<0.05）。结论：干扰IRAK3基因表达通过负向调控NF-κB通路减轻LPS诱导的大鼠原代心肌细胞损伤。     

周期蛋白D1参与香烟烟雾提取物促进人肺动脉平滑肌细胞增殖和迁移

本文旨在探讨周期蛋白D1(cyclin D1)在香烟烟雾提取物(cigarette smoke extract,CSE)所致人肺动脉平滑肌细胞(human pulmonary artery smooth muscle cells,HPASMCs)增殖和迁移中的作用。构建反义cyclin D1基因真核表达载体(pIRES2-EGFP-ascyclin D1),采用脂质体介导基因转染法将空载体(pIRES2-EGFP)和pIRES2-EGFP-ascyclin D1导入正常HPASMCs后,分别进行CSE干预。细胞随机分为6组:对照组、空载体组、反义cyclin D1组、5%CSE组、空载体+5%CSE组、反义cyclin D1+5%CSE组。用实时荧光RT-PCR和Western blot法分别检测cyclin D1mRNA和蛋白的表达,采用流式细胞术、四甲基偶氮唑盐比色法(MTT)、增殖细胞核抗原(PCNA)染色法测定细胞增殖能力,Transwell小室法检测细胞迁移能力。结果显示,反义cyclin D1基因真核表达载体pIRES2-EGFP-ascyclin D1成功构建,并成功转染入HPASMCs,转染后HPASMCs中cyclin D1的mRNA和蛋白表达水平较对照组均显著下降(P0.05)。与对照组比较,5%CSE组cyclinD1的mRNA和蛋白表达水平均明显升高(P0.05),细胞增殖和迁移能力显著增强(P0.05)。与5%CSE组比较,反义cyclinD1+5%CSE组cyclin D1mRNA和蛋白表达水平均明显下降(P0.05),细胞增殖和迁移能力显著降低(P0.05)。上述结果提示,CSE可通过上调cyclin D1表达促进HPASMCs增殖和迁移,反义cyclin D1基因真核表达载体可抑制CSE介导的HPASMCs增殖和迁移,提示cyclin D1在CSE所致HPASMCs增殖和迁移中发挥重要调控作用。     

前列腺癌PC3细胞表达鸭SREBP1基因的分析

为了探讨鸭SREBP1基因对前列腺癌PC3细胞增殖的影响,通过构建携带His标签鸭SREBP1基因第310位至403位氨基酸序列的真核表达载体p EGFP-N3+SREBP1+His,转染前列腺癌PC3细胞,空载体p EGFP-N3为对照,结果表明:p EGFP-N3+SREBP1+His和空载体均成功转染前列腺癌PC3细胞,p EGFP-N3+SREBP1+His转染效率高于空载体,通过检测转染48 h的细胞数量和SREBP1表达量,p EGFP-N3+SREBP1+His组细胞数为0.82×10~6个,SREBP1基因表达量为124.128 pg/m L;空载体组细胞数为0.74×10~6个,没有检测到His标签表达量。研究结果揭示,鸭SREBP1基因第310位至403位氨基酸序列对前列腺癌PC3细胞的增殖有促进作用。     

钙敏感受体对大鼠糖尿病性心肌病的影响

目的:观察钙敏感受体(Ca SR)在大鼠糖尿病性心肌病中的作用。方法:30只雄性Wistar大鼠随机分为对照组、糖尿病4周组和糖尿病8周组(n=10)。高糖高脂饮食4周后腹腔注射STZ(30 mg/kg)建立糖尿病模型。通过透射电镜观察心肌超微结构的变化,通过Western blot检测心肌组织Ca SR、肌浆网Ca2+-ATPase(SERCA)和受磷蛋白(PLN)的蛋白表达。结果:与对照组相比,随着病程的延长糖尿病组大鼠心肌Ca SR、SERCA蛋白表达降低,PLN表达增加,心肌结构损伤逐渐加重。结论:在大鼠糖尿病性心肌病进展过程中Ca SR的表达逐渐降低,并可能导致钙稳态紊乱参与糖尿病心肌病的发生。     

大蒜多糖对中毒性心肌炎心肌细胞凋亡的影响

目的:研究大蒜多糖 (GP)对中毒性心肌炎心肌细胞凋亡及Bcl -2、Bax蛋白表达的影响,探讨GP抑制心肌细胞凋亡的可能机制。方法:建立小鼠阿霉素 (ADR)中毒性心肌炎模型,利用缺口末端标记法检测心肌凋亡细胞;免疫组化法检测心肌细胞bcl 2、bax基因的蛋白表达情况,并利用电镜观察心肌结构变化。结果:ADR( 3mgkg-1ip,qod× 7)可致小鼠心肌细胞凋亡数明显升高,心肌细胞线粒体水肿,促进心肌细胞凋亡蛋白bax和抑制细胞凋亡蛋白bcl 2含量均明显升高,但bax/ bcl- 2的比值同时升高明显,与正常组比较有显著差异性 (P <0 . 0 1 )。GP可逆转ADR所致的上述改变,表现为剂量依赖性抑制细胞凋亡,降低bax蛋白表达同时增加bcl 2表达,使bcl- 2/ bax的比值增加 (P <0 .0 5或P <0 . 0 1 )。结论:GP能拮抗阿霉素所致的小鼠中毒性心肌炎心肌细胞凋亡作用,其作用机制可能与抑制Bax基因的蛋白表达,使Bcl -2基因表达的蛋白功能相对增强,Bcl -2 /Bax比值升高有关。     

PACE4对异丙肾上腺素诱导的心肌细胞凋亡的影响及其机制

目的:研究前体蛋白转化酶枯草溶菌素(PACE4)对异丙肾上腺素(ISO)诱导的心肌细胞凋亡的作用及其可能的作用机制。方法:构建pFLAG-PACE4重组表达载体并转染H9c2心肌细胞。将心肌细胞分为四组:正常对照组(无任何干预因素)、ISO组(10μmol/L ISO)、ISO+pFLAG组(空载质粒pFLAG转染+10μmol/LISO)、ISO+pFLAG-PACE4组(pFLAG-PACE4重组表达质粒转染+10μmol/LISO)。采用AnnexinV-FITC/PI双染法测定心肌细胞凋亡率;蛋白免疫印迹法检测活性半胱氨酸蛋白酶(caspase)-3、caspase-12、钙网蛋白、葡萄糖调节蛋白78(GRP78)、CCAAT/增强子结合蛋白同源蛋白(CHOP)、活化转录因子4(ATF4)和PERK的表达以及真核起始因子2α(eIF2α)的磷酸化水平。结果:与正常对照组相比,ISO组中PACE4表达水平明显降低,而转染pFLAG-PACE4质粒后,其表达水平显著增加。PACE4过表达可以显著抑制ISO诱导的细胞凋亡和caspase-3以及caspase-12的蛋白表达。ISO处理显著增加内质网应激分子钙网蛋白、GRP78和CHOP的表达,而PACE4过表达则可以抑制这些蛋白的表达。ISO诱导的PERK、eIF2α和ATF4的表达可以显著被PACE4过表达抑制。结论:PACE4过表达可以抑制ISO诱导的H9c2心肌细胞凋亡,其机制可能与PERK信号通路介导的内质网应激反应有关。     

LMO3过表达对胶质细胞增殖的作用

构建重组质粒pcDNA4/HisA-LMO3,转染C8-D1A胶质细胞,对照组为pcDNA4/HisA空载体质粒转染组和未转染组,MTT观察各组细胞的体外生长情况,流式细胞术(FCM)测定各组细胞的细胞周期和凋亡细胞百分比,Western-blot检测LMO3转染后凋亡相关蛋白的表达变化,从而观察LMO3基因对C8-D1A胶质细胞体外生长的影响.RT-PCR、Western印迹显示pcDNA4/HisA-LMO3转染组LMO3mRNA及LMO3蛋白表达水平明显高于对照组;与对照组细胞相比,转染组细胞的增殖能力明显高于空载体对照组及C8细胞(P0.01),S期细胞增加,G0/G1期细胞减少,C8细胞转染LMO3后可以促进C8细胞从G0/G1期进入S期,从而促进细胞的增殖.     

β2肾上腺素能受体过表达后大鼠心肌细胞收缩功能的改变及机制

目的:探讨大鼠心肌细胞过表达2-AR后心肌细胞收缩功能的改变及其可能机制.方法:采用胶原酶消化法分离培养大鼠心肌细胞,转染携带β2-A目的基因的重组腺病毒,通过免疫印迹方法检测细胞β2-AR蛋白表达的变化,通过ELISA方法检测细胞中cAMP水平的改变,采用单个细胞动态边缘检测系统测定细胞收缩功能的变化.结果:与正常心肌细胞相比,β2-AR的转染增加了细胞上β2-AR蛋白的含量(P＜0.05),并促进胞内cAMP水平的增加(14.76 3.15 pmol/ml vs 9.3 1.4pmol/ml,P＜0.05);进而增强了心肌细胞的基础收缩(8.203±2.596%vs 5.472±2.918%,P＜0.01),但不改变最大收缩(9.128±2.852%vs 9.366±2.646%).结论:β2-AR的过表达能够增加细胞内cAMP水平并改善心肌细胞的收缩功能.     

卡托普利对心力衰竭大鼠心肌细胞Bax、Bcl-2蛋白表达的影响

目的:探讨卡托普利对慢性压力负荷性心力衰竭大鼠心肌细胞凋亡相关基因Bax、Bcl-2蛋白表达的影响。方法:90只SD大鼠随机分为3组(n=30):假手术组(SH)、腹主动脉缩窄组(CAA)、卡托普利治疗组(CAP)。采用腹主动脉缩窄法复制模型,于第6、10周,检测各组心衰大鼠心肌细胞凋亡相关基因Bax,Bcl-2蛋白的表达。结果:造模后6周、10周结果均显示,CAA组较SH组心肌细胞凋亡基因Bcl-2蛋白及Bcl-2/Bax比例表达显著下降(P<0.01),Bax蛋白表达显著升高(P<0.01)。CAP组较CAA组Bcl-2蛋白及Bcl-2/Bax比例表达显著升高(P<0.01),Bax蛋白表达显著降低(P<0.01)。CAP组10周时较6周Bcl-2蛋白表达明显升高(P<0.05),Bax蛋白表达显著降低(P<0.01),Bcl-2/Bax比例显著升高(P<0.01)。结论:卡托普利能增加Bcl-2、降低Bax蛋白的表达,上调Bcl-2/Bax比率,从而抑制心肌细胞凋亡改善心功能。